Neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

Podsumowanie

Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) stało się coraz popularniejszym narzędziem do badania fenotypu myszy z modyfikacjami genetycznymi. Niniejszy artykuł przedstawia metody niezbędne do przeprowadzenia wysokoprzepustowego fenotypowania myszy z modyfikacjami genetycznymi przy użyciu MRI dla wielu osobników jednocześnie.

Streszczenie

Dziedzina fenotypowania myszy za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) rozwija się gwałtownie, co jest podyktowane potrzebą udoskonalenia narzędzi do charakteryzowania i oceny modeli mysich chorób ludzkich. MRI stanowi doskonałą metodę badania zwierząt z modyfikacjami genetycznymi. Umożliwia ono objęcie obrazowaniem całego mózgu, może być stosowane in vivo i zapewnia wiele mechanizmów kontrastowania do badania różnych aspektów neuroanatomii oraz fizjologii. Pojawienie się skanerów wysokopolowych wraz z możliwością jednoczesnego skanowania wielu myszy pozwala na szybkie fenotypowanie nowych mutacji.

Skuteczne badania MRI u myszy wymagają uwagi wielu aspektów projektu eksperymentu. W niniejszym artykule opiszemy ogólne metody pozyskiwania wysokiej jakości obrazów do fenotypowania myszy z wykorzystaniem systemu, który obrazuje myszy jednocześnie w ekranowanych cewkach nadawczo-odbiorczych częstotliwości radiowej (RF) w wspólnym magnesie (Bock et al., 2003). Skupiamy się szczególnie na fenotypowaniu anatomicznym, ważnym i dostępnym zastosowaniu, które wykazało duży potencjał wpływu w wielu modelach mysich w naszym centrum obrazowania. Zanim przejdziemy do szczegółowych kroków pozyskiwania takich obrazów, należy zwrócić uwagę na istotne kwestie praktyczne dotyczące zarówno obrazowania mózgu in vivo (Dazai et al., 2004), jak i obrazowania mózgu ex vivo (Spring et al., 2007). Są one omówione poniżej.

Protokół

1. Obrazowanie mózgu wielu myszy in vivo:

Podczas obrazowania żywych zwierząt, przez całą sesję muszą być zapewnione trzy kluczowe elementy: 1) bezpieczna metoda znieczulenia, 2) kontrola parametrów środowiskowych oraz 3) monitorowanie fizjologiczne. Ponadto, w przypadku jednoczesnego obrazowania wielu osobników, pojawiają się dodatkowe komplikacje dotyczące łatwości i szybkości przygotowania oraz powtarzalności ułożenia zwierząt w celu ułatwienia rejestracji obrazów. W związku z tym zaprojektowano i wykonano trzy główne niestandardowe komponenty: system załadunkowy do wprowadzania myszy do cewek RF wewnątrz MRI, komorę indukcyjną ułatwiającą przygotowanie oraz platformę z wbudowanymi prowadnicami monitorującymi w celu standaryzacji ułożenia.

System załadunkowy:

System wprowadzania myszy składa się z dwóch głównych części: „ula dla myszy” (mouse hive) oraz „matrycy ładunkowej” (loading array). Główną funkcją ula dla myszy jest rozmieszczenie siedmiu cewek RF Millipede (Varian NMR Systems, Palo Alto, CA) w układzie heksagonalnym wewnątrz otworu magnesu. Matryca ładunkowa została zaprojektowana do utrzymywania i transportu wielu myszy umieszczonych w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml z otworami wywierconymi w końcówkach, aby umożliwić dopływ gazu anestetycznego. Po znieczuleniu myszy i podłączeniu ich do sprzętu monitorującego w obszarze przygotowawczym w pobliżu magnesu, są one wkładane do zmodyfikowanych probówek wirówkowych i montowane na matrycy ładunkowej. Po zamontowaniu wszystkich myszy, matryca ładunkowa jest transportowana, wsuwana do magnesu i ustawiana na systemie szynowym. System szynowy umożliwia sprzęgnięcie matrycy z ulem dla myszy podczas przesuwania jej w głąb otworu magnesu. Po pełnym wsunięciu do magnesu, probówki wirówkowe łączą się z systemem podawania anestetyku wewnątrz cewek RF. Izofluran zmieszany z tlenem jest dostarczany z końca ula dla myszy do preparatu za pomocą rurki biegnącej wzdłuż osi każdej poszczególnej cewki. Ta mieszanina gazów anestetycznych przepływa do probówek, omija myszy i jest zbierana przez aktywną jednostkę odsysającą przymocowaną do tylnej części matrycy ładunkowej (Rycina 1).

Komora indukcyjna:

Ponieważ czas obrazowania może trwać do trzech godzin, zminimalizowanie czasu przygotowania zwierząt jest kluczowe w celu ograniczenia narażenia myszy na działanie anestetyków. W związku z tym opracowaliśmy specjalistyczną komorę indukcyjną, aby usprawnić proces przygotowania (Rycina 2). Specjalistyczna komora indukcyjna tworzy jednolite środowisko zarówno dla indukcji, jak i obsługi wielu myszy. Komora indukcyjna, wykonana z przezroczystego akrylu, posiada samozamykające się silikonowe porty przysłonowe, aby zminimalizować wyciek środka anestetycznego i umożliwić użytkownikowi dostęp do wnętrza bez konieczności stosowania specjalnych rękawiczek. W porównaniu do konwencjonalnych masek i obwodów dla pojedynczej myszy, komora indukcyjna jest wystarczająco duża, aby pomieścić do dwudziestu myszy i umożliwia swobodną manipulację zwierzętami bez konieczności podłączania uciążliwych rurek i masek. Urządzenie jest zasilane stałym przepływem gazu anestetycznego, który jest zbierany za pomocą pasywnego systemu odsysania. Do podgrzewania dna komory w celu utrzymania temperatury ciała zwierząt podczas przygotowania zastosowano rezystancyjne elementy grzejne.

Sanki:

Jednym z najbardziej uciążliwych i czasochłonnych aspektów przygotowania myszy do badania MRI jest aplikacja elektrod elektrokardiograficznych (EKG) oraz sondy temperatury odbytniczej. Ponadto stwierdzono, że wiele konwencjonalnych elektrod, takich jak elektrody mankietowe i igłowe, zniekształca postawę zwierzęcia, co utrudnia standaryzację ułożenia. W związku z tym opracowaliśmy dopasowaną platformę pozycjonującą z wbudowanymi sondami EKG, oddechowymi i temperaturowymi, zwaną „sankami” (U.S. Patent 7,146,936) (Rycina 3). Aby ograniczyć ruchy głowy zastosowano stabilizatory wykonane z rzepów.

Etapy obrazowania mózgu in vivo u wielu myszy:

1. Wszystkie badania na myszach wymagają lokalnej zgody ACC (komitetu ds. opieki nad zwierzętami), IACUC (instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt) lub równoważnego zatwierdzenia procedur postępowania z myszami.
2. Wszystkie procedury, takie jak identyfikacja i ważenie zwierząt, powinny być wykonywane w szafie bezpieczeństwa biologicznego (BSC) oraz w jednostce MRI. Zwierzęta przenosi się do autoklawowalnego plastikowego pojemnika i transportuje do komory indukcyjnej MRI.
3. Myszy są znieczulane w wstępnie ogrzanej komorze indukcyjnej przy użyciu 4% izofluranu i 4 L/min tlenu. Zwierzęta uznaje się za w pełni znieczulone, gdy przestają reagować na uciśnięcie łapy. Jeśli jest to konieczne, sierść z klatki piersiowej usuwa się za pomocą depilatora (NAIR), aby zapewnić lepszy kontakt z urządzeniami do monitorowania EKG i temperatury, które zostały wbudowane w specjalną sanię. Do oczu nakłada się maść do powiek (Tears Naturale P.M.), aby zapobiec ich wysychaniu, a podskórnie podaje się około 0,3 mL soli fizjologicznej w celu utrzymania nawodnienia.
4. Jeśli pożądane jest wzmocnienie kontrastowe, można zastosować Gd-DTPA-BMA (Omniscan). W przypadku zastosowania Gd-DTPA, należy go rozcieńczyć w soli fizjologicznej (objętość końcowa 300uL) i podać w pojedynczej dawce 1 mmol/kg przed sesją MR drogą IP.
5. Następnie myszy umieszcza się w indywidualnych saniach, unieruchamia pasami na głowę i wsuwa do otwartych z jednej strony probówek stożkowych o pojemności 50mL (Rysunek 3). Jednocześnie można zeskanować do 7 żywych myszy. Po umieszczeniu wszystkich zwierząt i podłączeniu monitorowania fizjologicznego, poziom izofluranu w otworze magnesu ustawia się na 2%, a poziom tlenu na 8 L/min.
6. Probówki stożkowe montuje się w systemie dokującym (Rysunek 1), zaprojektowanym w celu jednorodnego ustawienia myszy w każdej cewce RF umieszczonej w centrum otworu magnesu. Po załadowaniu poziom izofluranu można zmniejszyć do 0,9-2%. Przez cały czas trwania skanowania monitorowane jest EKG i temperatura każdego zwierzęcia. Podczas skanowania zwierzęta są ogrzewane za pomocą ciepłego powietrza.
7. Czas trwania każdego skanowania trójwymiarowego wynosi około 3 godzin. Szczegóły są następujące: fast spin echo z TR wynoszącym 2300 ms i TEeff wynoszącym 36 ms. Długość pociągu ech wynosi 8 przy 1 średniej. Wynikowa rozdzielczość obrazu to 125 μm (Rysunek 4).
8. Po zakończeniu skanowania zwierzęta wyjmuje się z magnesu i przenosi do ciepłej komory indukcyjnej wypełnionej 100% tlenem. Zwierzęta przenosi się do szczelnych plastikowych pojemników i transportuje w szafie BSC. Następnie umieszcza się je w ciepłej klatce bez przeciągów, aby mogły dojść do siebie po znieczuleniu.

2. Obrazowanie mózgu wielu myszy ex vivo:

Obrazowanie MR próbek utrwalonych, które nie jest podatne na artefakty ruchowe, pozwala na uzyskanie wyższej rozdzielczości niż obrazowanie żywych organizmów. Trójwymiarowe zestawy danych o wysokiej rozdzielczości zapewniają maksymalną elastyczność w pozyskiwaniu informacji ilościowych i umożliwiają zautomatyzowaną analizę obrazów. Opracowano niestandardową macierz cewek RF do równoległego pozyskiwania 16 wysokorozdzielczych zestawów danych MR utrwalonych mózgów myszy wewnątrz czaszki podczas nocnych sesji skanowania.

16-kanałowa cewka do obrazowania mózgu ex vivo:

W celu jednoczesnego obrazowania 16 próbek zbudowano specjalną macierz 16 cewek solenoidowych. Konstrukcja ta stanowi udoskonalenie wcześniejszego prototypu, który służył do jednoczesnego obrazowania trzech próbek w zestawie gradientowym z wkładką 60mm. Cewki solenoidowe składające się z 8 zwojów posiadają nadmiarowe zwoje na końcach, co zapewnia jednorodną czułość z dokładnością do 10% na długości 26mm; każda cewka jest indywidualnie ekranowana w modularnych komorach (Idziak and Haeberlen, 1982). 16 komór cewkowych zamocowano do ramy (Rysunek 5), która pozycjonuje cewki w obrębie gradientu i unieruchamia je za pomocą poduszki pneumatycznej w celu zminimalizowania drgań.

Etapy obrazowania mózgu ex vivo wielu myszy:

1. Otwórz jamę klatki piersiowej i wprowadź igłę (lub bezpieczny zestaw do infuzji z motylkiem, 25G X 3⁄4) do lewej komory serca znieczuplonej myszy (znieczulenie wykonano poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe ketaminy (150 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg)). Odetnij prawy przedsionek.
2. Wykonaj płukanie przez transperfuzję serca przy użyciu 30 mL 1X PBS w temperaturze pokojowej + 1 μL/mL heparyny (1000 jednostek USP/mL) + 2 mM ProHance z szybkością przepływu około 100 mL/godz.
3. Wykonaj etap fiksacji przy użyciu 30 mL 4% PFA (temperatura pokojowa) + 2 mM ProHance z szybkością 100 mL/godz.
4. Wykonaj dekapitację i usuń skórę, dolną szczękę, uszy oraz chrzęstną część czubka nosa.
5. Umieść pozostałą strukturę czaszki w 4% PFA + 2 mM ProHance na noc w temperaturze 4°C.
6. Przenieś do 1X PBS + 0,02% azotku sodu + 2 mM ProHance.
7. Wysokorozdzielcze trójwymiarowe skanowanie MRI przy 7 Tesla odbywa się w odstępie od 4 dni do maksymalnie 2,5 miesiąca po perfuzji. Mózgi są umieszczane w 16-kanałowej macierzy cewek solenoidowych (Rycina 5).
8. Parametry obrazowania są następujące: fast spin echo z TR 325 ms i TEeff 30 ms, długość pociągu ech równa 6 przy 4 średnich. Obrazy końcowe mają rozdzielczość izotropową 32 μm (Rycina 6), a czas trwania skanowania wynosi około 12 godzin.
9. Po skanowaniu umieść czaszkę w 10% formalinie + 2 mM ProHance w celu konserwacji.

3. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. System załadunku myszy. „Matryca załadunkowa” i „klatka zbiorcza” połączone wspólnym systemem szyn z włókna szklanego.

Rysunek 2. Komora indukcyjna.

Rysunek 3. a) Sanie z wbudowanymi czujnikami monitorującymi i stabilizatorem głowy. b) Zznieczyszona mysz na saniach z przymocowanym stabilizatorem głowy. Zespół sani łatwo wsuwa się do probówki wirówkowej.

Rycina 4. Reprezentatywny in vivo wiele obrazów mózgu z jednego trójwymiarowego skanu trwającego 3 godziny.

Rysunek 5. 16-kanałowa macierz cewek solenoidu do skanowania 16 utrwalonych preparatów mózgu.

Rycina 6. Reprezentatywny obraz mózgu ex-vivo.

Dyskusja

Zarówno systemy obrazowania myszy in vivo, jak i ex vivo pozwalają na obrazowanie wielu osobników jednocześnie, co znacząco zwiększa przepustowość badań obrazowych bez wydłużania czasu ich trwania. Obrazy mózgu uzyskane obiema technikami obrazowania wielu myszy, zarówno in vivo, jak i ex vivo, charakteryzują się wysoką jakością i są odpowiednie odpowiednio do fenotypowania głównych i mniejszych struktur w mózgu myszy.

Aby zminimalizować czas przygotowania wielu okazów zwierzęcych, kluczowe znaczenie ma równoległe prowadzenie procesów. Na przykład opracowanie komory indukcyjnej umożliwiło jednoczesną indukcję wielu okazów, a sani synchronizują aplikację sond EKG i temperatury, standaryzując jednocześnie ułożenie ciała. Ponadto nasz system obrazowania ex vivo pozwala na jednoczesne uzyskanie trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości 16 utrwalonych całych mózgów, co jest idealnym rozwiązaniem dla wysokoprzepustowych badań fenotypowych.

Do możliwych ograniczeń naszego systemu obrazowania in vivo należy brak możliwości indywidualnej kontroli znieczulenia i temperatury dla każdej myszy. W razie potrzeby indywidualną kontrolę znieczulenia można wprowadzić poprzez dodanie oddzielnych parowników anestetycznych dla każdej myszy. Kolejnym ograniczeniem systemu obrazowania in vivo jest fakt, że skanowanie jest ograniczone do myszy o masie mniejszej niż około 32 g. Obecnie istnieją jednak plany zwiększenia rozmiaru cewki, aby umożliwić badanie większych zwierząt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Izofluran, USP (AErrane)	Baxter Internationl Inc.	CA2L9108
NAIR	Church & Dwight Co.
Tears Naturale P.M.	Alcon	DIN 02082519
Omniscan (gadodiamid w zastrzykach USP)	GE Healthcare	J-110A
Dedykowane sanki (Custom Sleds)	Dazai Research Instruments
PBS bez Ca i Mg	Wisent Inc.	311-010-CL
Heparyna 10000USP/10ml	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02264315
ProHance (gadoteridol w zastrzykach USP)	Bracco Diagnostics	11181
Paraformaldehyd (proszek)	Sigma-Aldrich	P-6148-500g
Azydek sodu	Fisher Scientific	S227-100
Formalina 10%	Fisher Scientific	SF100-4