Artykuł metodologiczny

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

20.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2498

⸱

25 lutego 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama Huntsville, 2Department of Biology, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Streszczenie

Niedawne badania strukturalne i biochemiczne szczegółowo opisały wiele zdarzeń molekularnych zachodzących w rybosomie podczas hamowania syntezy białek przez antybiotyki oraz podczas syntezy powstających polipeptydów. Niektóre z tych antybiotyków oraz regulacyjne polipeptydy, występujące głównie w formie peptydylo-tRNA, hamują albo tworzenie wiązania peptydowego, albo terminację translacji1-7. Zdarzenia hamujące te mogą zatrzymać ruch rybosomu, co jest zjawiskiem określanym jako „zatrzymanie translacyjne” (translational arrest). Wykazano, że zatrzymanie translacji indukowane przez antybiotyk lub powstający polipeptyd reguluje ekspresję genów zaangażowanych w różnorodne funkcje komórkowe, takie jak wzrost komórki, oporność na antybiotyki, translokacja białek oraz metabolizm komórkowy8-13. Wiedza o tym, w jaki sposób antybiotyki i regulacyjne polipeptydy zmieniają funkcję rybosomu, jest niezbędna do pełnego zrozumienia roli rybosomu w translacji w każdym organizmie.

W niniejszej pracy opisujemy prostą metodologię, którą można wykorzystać do oczyszczania, wyłącznie w celach analitycznych, tych rybosomów, które translują konkretny mRNA i zawierają specyficzny peptydylo-tRNA14. Procedura ta opiera się na selektywnej izolacji translujących rybosomów związanych z mRNA znakowanym biotyną. Kompleksy translacyjne te są oddzielane od innych rybosomów w tej samej mieszaninie przy użyciu paramagnetycznych kulek streptawidyny (SMB) i pola magnetycznego (MF). mRNA znakowane biotyną są syntetyzowane w testach transkrypcji run-off z wykorzystaniem jako matryc fragmentów DNA generowanych metodą PCR, które zawierają promotory transkrypcyjne T7. Polimeraza RNA T7 włącza biotynę-16-UMP z biotyny-UTP; w naszych warunkach w cząsteczce mRNA o długości 600 nt z 25% zawartością UMP wbudowuje się około dziesięciu cząsteczek biotyny-16-UMP. Tak oznakowane biotyną cząsteczki mRNA są następnie izolowane i wykorzystywane w testach translacji in vitro przeprowadzanych z użyciem bezkomórkowych ekstraktów pozbawionych czynnika uwalniającego 2 (RF2), uzyskanych ze szczepów Escherichia coli zawierających rybosomy typu dzikiego lub zmutowane. Rybosomy translujące sekwencje mRNA znakowane biotyną zostają zatrzymane w obrębie kodonu stop z powodu braku białka RF2, które zazwyczaj odpowiada za terminację translacji. Zatrzymane rybosomy zawierające nowo zsyntetyzowany peptydylo-tRNA są izolowane i usuwane z reakcji translacji za pomocą SMB i MF. Kuleczki te wiążą wyłącznie cząsteczki mRNA zawierające biotynę.

Wyizolowane kompleksy translacyjne mogą być wykorzystywane do analizy cech strukturalnych i funkcjonalnych komponentów rybosomalnych typu dzikiego lub zmutowanych, bądź sekwencji peptydylo-tRNA, a także do określania interakcji rybosomów z antybiotykami lub innymi czynnikami molekularnymi 1,14-16. Aby zbadać funkcję tych wyizolowanych kompleksów rybosomalnych, można przeprowadzić testy peptydylo-transferazy w obecności antybiotyku puromycyny1. Do badania zmian strukturalnych w kompleksach translacyjnych można zastosować uznane procedury, takie jak i) sieciowanie do specyficznych aminokwasów14 oraz/lub ii) testy ochrony przed alkilacją1,14,17.

Protokół

1. Przygotowanie ekstraktu bezkomórkowego.

  1. Dwa gramy suchego osadu bakteryjnego Escherichia coli, otrzymanego z kultur w środkowej fazie logarytmicznej, przemywa się dwukrotnie 0,5 l buforu A zawierającego 10 mM octanu Trisu, pH 8.0, 14 mM octanu magnezu, 60 mM octanu potasu i 50 μg/ mL fenylometanosulfonylofluorku (PMSF) poprzez wirowanie przy 5000 X g przez 5 min w 4°C. Po przemyciu osad bakteryjny resuspendsuje się w 40 mL buforu A.
  2. Komórki bakteryjne poddaje się rozpadowi za pomocą prasy francuskiej (French Press), stosując ciśnienie 6000 psi. Ciśnienie to odpowiada 600 jednostkom przy zastosowaniu tłoka o średnicy jednej uncji. Rozbitą zawiesinę zbiera się do czystej probówki szklanej (50 mL).
  3. Rozbitą zawiesinę traktuje się 1 mM ditiotreitolem (DTT) i wiruje przy 30 000 x g przez 30 min. Procedurę wirowania powtarza się, wykorzystując otrzymany nadosad. Końcowy nadosad rozlewa się (1 mL) do mikroprobówek. Na koniec alikwoty zamraża się w mieszaninie suchego lodu z etanolem lub w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze -60°C lub -80°C.

2. Przygotowanie ekstraktów bezkomórkowych pozbawionych RF2.

  1. 4,5 mL zawiesiny kulek sepharose 4B z białkiem A miesza się z 5 mL antyserum przeciwko RF2, używając rotatora w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Mieszaninę odwiruje się przy 2500 x g, aby oddzielić kulki od antyserum. Po odlaniu supernatantu, kulki zawierające przeciwciała przeciwko RF2 (kulki anti-RF2) przepłukuje się poprzez resuspensję w 1 mL buforu B zawierającego 35 mM octanu Tris o pH 7,8, 10 mM octanu magnezu, 30 mM octanu amonu, 60 mM glutaminianu potasu oraz 5 μg/mL leupeptyny jako inhibitora proteinazy. Następnie kulki anti-RF2 oddziela się od buforu B poprzez wirowanie w tych samych warunkach, które wskazano powyżej. Procedurę płukania powtarza się dwukrotnie.
  2. Jeden mL ekstraktu wolnego od komórek miesza się ze 150 μL kulek anti-RF2, używając rotatora w temperaturze 4°C przez dwie godziny. Mieszaninę odwiruje się przy 10 000 x g, aby oddzielić ekstrakt wolny od komórek od kulek. Supernatant usuwa się i poddaje ponownej obróbce z kolejnymi 150 μL kulek anti-RF2. Procedurę tę powtarza się jeszcze raz z otrzymanym roztworem ekstraktu wolnego od komórek. Końcowy roztwór ekstraktu wolnego od komórek rozdziela się (po 100 μL) do mikroprobówek. Alikwoty zamraża się za pomocą mieszaniny suchego lodu z etanolem lub ciekłego azotu, a następnie przechowuje w temperaturze -60°C lub -80°C.

3. Przygotowanie matrycy DNA.

  1. Przygotuj 1 mL mieszaniny do reakcji PCR, łącząc 600 femtomoli matrycy plazmidowej zawierającej sekwencje do translacji (Rys. 1), z 0,4 nanomolami każdego z oligodeoksynukleotydów wskazanych na Rys. 1, 0,2 mikromolami każdego dNTP oraz 50 U polimerazy Taq-DNA w buforze dostarczonym przez Stratagene Co. Przeprowadź reakcję amplifikacji zgodnie z następującymi warunkami: 94°C przez 2 min, (94°C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72°C przez 1 min; przez 30 cykli) oraz 72°C przez 12 min.
  2. Oczyść produkty PCR poprzez wytrącenie DNA, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu, pH 5.2, oraz 2 objętości lodowatego etanolu. Powtórz procedurę wytrącania jeszcze raz. Resuspenduj DNA w 100 μL wody traktowanej węglanem diethylopirocarbonianu (DEPC).
    Zazwyczaj procedura ta pozwala uzyskać 100 μg produktu DNA o długości 600 bp.
  3. Zweryfikuj integralność produktów PCR za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych.

4. Przygotowanie mRNA znakowanego biotyną.

  1. Przygotować 100 μL reakcji transkrypcji in vitro w wodzie traktowanej DEPC, mieszając 5 μg fragmentu DNA otrzymanego w drodze PCR z 0,5 mikromola ATP, CTP, GTP, 0,3 mikromola UTP, 50 nanomolami biotyny-16-UTP oraz 10 μL mieszanki enzymów T7 w buforze dostarczonym przez firmę Promega Co. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37°C przez 3 godziny.
    Aby określić ilość otrzymanego mRNA, matrycę DNA należy usunąć poprzez dodanie DNazy wolnej od RNaz. Inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez 10 min.
  2. Oczyścić produkty mRNA, wytrącając RNA poprzez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 oraz 2 objętości zimnego etanolu. Powtórzyć procedurę wytrącania jeszcze raz. Resuspendować mRNA w 100 μL wody traktowanej DEPC.
    Zazwyczaj procedura ta pozwala na uzyskanie od 1-2 mg produktu mRNA o długości 600 nt znakowanego biotyną.
  3. Zweryfikować integralność produktów mRNA znakowanych biotyną za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych.

5. Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA.

  1. Przygotować 500 μL mieszaniny do reakcji translacji in vitro w wodzie traktowanej DEPC, mieszając 10-15 μg mRNA znakowanego biotyną z 75 nanomolami każdego z dziewiętnastu aminokwasów – wszystkich z wyjątkiem aminokwasu, który zostanie zastąpiony aminokwasem promieniotwórczym, 50 μCi aminokwasu promieniotwórczego (37MBq) oraz 20-50 μL ekstraktu bezkomórkowego pozbawionego RF2, w buforowanej mieszaninie reakcyjnej zawierającej 40 mM octanu Tris, pH 8.0, 10 mM octanu magnezu, 175 mM octanu potasu, 10 mM octanu amonu, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 mM GTP, 30 mM fosfoenolopirogronianu (PEP), 0.3 U/ mL kinazy pirogronianowej (PK), 3.5% glikolu polietylenowego 8000, 1 mM spermidyny, 20 μg/ mL kwasu folinowego oraz 250 μg/ mL tRNA z E. coli. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37°C przez 10 minut.
    Kolejność dodawania składników reakcji jest bardzo ważna. Ekstrakt bezkomórkowy należy najpierw wymieszać z roztworem buforowym zawierającym aminokwasy, a końcową mieszaninę inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić aktywację rybosomów. Następnie dodaje się mRNA znakowane biotyną. W przypadku analiz strukturalnych z wykorzystaniem procedur modyfikacji chemicznej dodanie aminokwasu promieniotwórczego nie jest wymagane.
  2. Do mieszaniny reakcji translacji dodać 3 μL paramagnetycznych kulek streptawidyny (SMB) zawieszonych w buforze C zawierającym 35 mM octanu Tris, pH 8.0, 10 mM octanu magnezu, 175 mM octanu potasu, 10 mM octanu amonu i 1 mM DTT. Inkubować nową zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  3. Oddzielić SMB od mieszaniny, przykładając pole magnetyczne (MF) za pomocą statywów do separacji magnetycznej.
  4. Resuspendować SMB w buforze C i ponownie oddzielić kulki za pomocą MF. Powtórzyć tę procedurę płukania dwukrotnie. Resuspendować kulki w 500 μL buforu C, przechowywać zawiesinę na lodzie i niezwłocznie przystąpić do kolejnego etapu procedury.

6. Analiza wyizolowanych rybosomów zawierających peptydylo-tRNA.

Dla peptydylo-tRNA

  1. Wymieszać 10 μL SMB (zawieszonego w buforze C) z 10 μL buforu do ładowania zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2,5% (v/v) glicerolu, 4% dodecylosiarczanu sodu, 2 mM DTT oraz 0,2 mg/mL błękitu bromofenolowego. Rozdzielić komponenty przyłączone do kulek, przeprowadzając elektroforezę próbek w 10% żelach poliakrylamidowych Tris-tricine.
  2. Wysuszyć żele za pomocą próżniowej suszarki do żeli.
  3. Zweryfikować integralność i czystość peptydylo-tRNA poprzez naświetlanie wysuszonego żelu na filmie rentgenowskim.

Dla rybosomalnego RNA

  1. Do 10 μL zawiesiny kulek dodać 190 μL 2 mM roztworu etylenodiaminotetraoctanu (EDTA) przygotowanego w wodzie traktowanej DEPC oraz 200 μL fenolu nasyconego wodą. Zawiesinę wymieszać poprzez intensywne wstrząsanie w wortexie, a następnie oddzielić fazę nieorganiczną od organicznej poprzez wirowanie przy 10,000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej. Górną warstwę wodną zebrać do nowej mikroprobówki.
  2. RNA z warstwy wodnej wytrącić poprzez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH 5.2), 1 μL roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/ mL oraz 2 objętości lodowatego etanolu. RNA zawiesić ponownie w 10 μL wody traktowanej DEPC.
  3. Integralność rybosomalnych RNA zweryfikować za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych.
    Zazwyczaj 50 μL zawiesiny kulek pozwala uzyskać 1μg rybosomalnego RNA.

7. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 2 przedstawia wyniki serii analiz oceniających jakość i funkcjonalność rybosomów translacyjnych wyizolowanych zgodnie z opisaną procedurą. Obserwacja pojedynczego prążka w żelach poliakrylamidowych wskazuje na obecność polipeptydów związanych z mRNA znakowanymi biotyną, przytwierdzonymi do SMB (Rycina 2A). Oczyszczanie rybosomalnych RNA za pomocą tej procedury potwierdza również obecność rybosomów związanych z tymi znakowanymi biotyną cząsteczkami mRNA (Rycina 2B). Dodanie puromycyny, antybiotyku indukującego aktywność peptydylo-transferazy rybosomu, prowadzi do odszczepienia powstających peptydylo-tRNA1. Objawia się to zmianą wzorca migracji wyizolowanego polipeptydu w żelach poliakrylamidowych (Ryc. 2C). Wspólnie dane te wskazują, że mRNA znakowane biotyną, przytwierdzone do SMB, zawierają funkcjonalne rybosomy z peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających specyficzne peptydylo-tRNA pozwala na badanie wpływu peptydylo-tRNA, antybiotyków i innych cząsteczek na funkcję rybosomów (Rysunek 3A) oraz na ich strukturę (Rysunek 3B). W przedstawionych tutaj przykładach antybiotyk sparsomycyna oraz aminokwas tryptofan (Trp) hamują hydrolityczne rozszczepienie peptydylo-tRNA nowo powstającego tnaC-tRNA indukowane przez RF2 w izolowanych rybosomach (Rysunek 3A). Oddziaływanie sparsomycyny lub Trp z rybosomem indukuje również zmiany strukturalne w niektórych nukleotydach wchodzących w skład 23S rRNA rybosomu translacyjnego (Rys. 3B). Podsumowując, materiał biologiczny otrzymany za pomocą opisanego tutaj procesu jest przydatny do pogłębienia wiedzy na temat kontaktów strukturalnych zaangażowanych w hamowanie funkcji rybosomu w wyniku jego oddziaływania z różnymi czynnikami molekularnymi.

Schemat syntezy i translacji mRNA znakowanego biotyną, przedstawiający transkrypcję run-off oraz zatrzymanie rybosomu.
Rysunek 1. Procedura stosowana do otrzymywania i oczyszczania translujących rybosomów zawierających peptydylo-tRNA. Fragmenty DNA o długości ok. 650 bp, zawierające gen tnaC oraz przyległy obszar, przedstawione na rysunku, służą jako matryce do przygotowania mRNA zawierających biotynę, [(bio)UMP]mRNA. Fragmenty DNA te są otrzymywane metodą PCR przy użyciu oligodeoksynukleotydów wskazanych w górnej części rysunku. Podkreślone litery oznaczają miejsce promotora T7 zakodowanego w primerze nukleotydowym. Pogrubione litery wskazują sekwencję Shine-Dalgarno wykorzystywaną w translacji sekwencji mRNA tnaC. Promotor T7 w fragmencie DNA jest rozpoznawany przez polimerazę RNA T7, która służy do transkrypcji (strzałka) sekwencji tnaC oraz następującej po niej sekwencji niekodującej. Transkrypcja zostaje zakończona, gdy polimeraza RNA dotrze do końca 3' fragmentu DNA, za sekwencjami terminatora rpoBC (rpoBC"t"). Struktura spinki (stem-loop) terminatora rpoBC chroni mRNA przed aktywnością egzoribonukleazy 3'-5' obecną w ekstraktach bezkomórkowych stosowanych w reakcjach translacji in vitro. Wyizolowane [(bio)UMP]mRNA są wykorzystywane do generowania zatrzymanych, translujących rybosomów w testach translacji in vitro. Sekwencja tnaC w [(bio)UMP]mRNA jest translowana przez rybosom, który zatrzymuje się po wbudowaniu ostatniego aminokwasu ze względu na brak czynnika uwalniającego (RF2) w mieszaninie reakcyjnej. Kompleksy rybosom-[(bio)UMP]mRNA są izolowane z całkowitej mieszaniny reakcyjnej przy użyciu magnetycznych kulek ze streptawidyną (SMB), które wiążą nukleotydy znakowane biotyną wbudowane w mRNA. SMB związane z kompleksami rybosom-[(bio)UMP]mRNA są ekstrahowane z całkowitej mieszaniny reakcyjnej przy użyciu pola magnetycznego (MF).

Wyniki elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, translacja i oczyszczanie kuleczkami TnaC-tRNA, analiza RNA.
Rycina 2. Analizy strukturalne i funkcjonalne wyizolowanych kompleksów. A) Reakcje translacji in vitro przeprowadzono z wykorzystaniem [(bio)UMP]mRNA, w których kodon startowy genu tnaC zastąpiono kodonem stop. Produkty końcowe wyizolowano przy użyciu kuleczek z streptawidyną, zgodnie z opisem na Ryc. 1. Produkty reakcji i wyizolowane cząsteczki poddano następnie analizie za pomocą elektroforezy w żelach poliakrylamidowych. Oznaczono prążki tnaC-tRNA oraz peptydy tnaC. B) Całcowy RNA wyizolowano z zatrzymanych kompleksów, stosując procedury ekstrakcji fenolem. Każdy wyizolowany RNA rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelach agarozowych. Wskazano rybosomalne RNA (rRNA). C) Wyizolowane kompleksy zawierające tnaC-tRNA inkubowano z (+) lub bez (-) 0,02 mM puromycyną (Puro) w temperaturze pokojowej przez 10 min. Peptydy tnaC znakowano podczas translacji za pomocą [35S]-metioniny (A) lub [3H]-proliny (B).

Wyniki eksperymentu syntezy białek; elektroforeza żelowa translacji rybosomów w obecności TnaC-tRNA.
Rysunek 3. Analizy strukturalne i funkcjonalne rybosomów zawierających tnaC-tRNA, które są związane z antybiotykiem sparsomycyną lub aminokwasem tryptofanem. A) Izolowane kompleksy zawierające tnaC-tRNA inkubowano z (+) lub bez (-) sparsomycyny (Spar) lub tryptofanu (Trp) w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie mieszaniny zmieszano z RF2 i inkubowano w 37°C przez 20 min. B) Analiza zmian metylacji w 23S rRNA indukowanych przez cząsteczki wiążące się wewnątrz rybosomu. Izolowane kompleksy wstępnie inkubowano z (+) lub bez (-) 2 mM Trp lub Spar przez 5 min w 37°C. Następnie dodano czynnik alkilujący, siarczan dimetylu, a mieszaniny inkubowano w temperaturze pokojowej przez kolejne 20 min. Wyekstrahowano całkowite RNA i przeprowadzono analizy przedłużania starterów z użyciem oligodeoksynukleotydu znakowanego [32P], komplementarnego do nukleotydów 23S rRNA oddalonych o 100 nukleotydów w dół strumienia od zmodyfikowanego nukleotydu. Końcowe produkty analiz przedłużania rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelach poliakryloamidowych. Wskazano nukleotydy 23S rRNA, na które wpłynęła obecność Trp lub Spar.

Dyskusja

Procedura izolacji opisana w niniejszym raporcie jest wysoce powtarzalna. Niestety, nie można łatwo uniknąć obecności krótkich peptydylo-tRNA powstających z tych samych sekwencji translacyjnych; takie peptydylo-tRNA mogą stanowić 15-20 % całkowitej izolatowej substancji (Rycina 2C). Stężenie tych zanieczyszczeń może wzrosnąć w przypadku zastosowania wyższych stężeń mRNA znakowanego biotyną lub gdy użyte ekstrakty bezkomórkowe są stare bądź były wielokrotnie wykorzystywane. Dlatego bardzo ważne jest kontrolowanie jakości i stężenia składników reakcji translacji in vitro. Alternatywnie dostępne są komercyjne, wysokowydajne zrekonstytuowane ekstrakty bezkomórkowe, które mogą być stosowane w tych samych celach (system PURE)18.

Stosując tę metodę, biotin-16-UMP jest wbudowywany losowo wzdłuż całej długości docelowego mRNA. Istnieje możliwość, że niektóre ORF zawierające ciągi urydyny mogły włączyć ten zmodyfikowany nukleotyd do swoich sekwencji, co wpływa na ich translację. W celu uzyskania najefektywniejszej translacji należy przetestować zmienne względne stężenia biotin-16-UTP/UTP podczas syntezy mRNA. Można zastosować alternatywne metody znakowania biotyną, celujące w koniec 5', który jest najstabilniejszym końcem cząsteczek mRNA. (i) Biotynę można przyłączyć do końca 5' mRNA, wykorzystując 3'-NH2ATP (3'-amino-3'-deoksyadenozynotrifosforan) oraz ligazę RNA T419. (ii) Do końca 5' mRNA można również przyłączyć oligonukleotyd znakowany biotyną na końcu 5', wykorzystując ligazę RNA T420. (iii) Do izolacji kompleksów translacyjnych można by również użyć oligodeoksynukleotydów znakowanych biotyną na końcu 3', które odpowiadają sekwencji komplementarnej do końca 5' mRNA. Te znakowane biotyną oligodeoksynukleotydy mogłyby zostać przyłączone do SMB przed izolacją. Następnie SMB przyłączone do znakowanych biotyną oligodeoksynukleotydów mogłyby zostać zmieszane z mieszaniną reakcyjną translacji, aby umożliwić interakcję z ich komplementarnymi sekwencjami mRNA. Po izolacji hybrydowy region RNA-DNA – a konkretnie region hybrydyzujący między znakowanym biotyną oligodeoksynukleotydem a sekwencją mRNA – mógłby zostać zdegradowany za pomocą RNazy H, oddzielając zatrzymane kompleksy od kulek streptavidyny. Ta alternatywna metoda może pozwolić na wykorzystanie kompleksów w przyszłych analizach strukturalnych z zastosowaniem metod o wyższej rozdzielczości.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

L.R.C.-V. pragnie dedykować niniejszą pracę pamięci dr. Adriel D. Johnsona, wspaniałego profesora, dla którego edukacja studentów była zawsze priorytetem. Brakuje nam Ciebie, Adriel. Jesteśmy wdzięczni Jacqueline Moreno za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów opisanych w niniejszym badaniu. Badanie to zostało sfinansowane z grantu przyznanego C.Y. przez National Science Foundation, MCB-0615390, oraz z funduszy startowych przyznanych L.R.C.-V. przez University of Alabama at Huntsville.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tris (zasada)Sigma-Aldrich252859
Octan magnezuFluka63049
Glutaminian potasuSigma-AldrichG1501
Octan amonuFluka09688
PMSFSigma-AldrichP7626
Kuleczki zawiesiny sepharose 4B z białkiem ASigma-AldrichP9424
Inhibitor leupeptynaSigma-AldrichL9783
Taq-polimeraza DNAStratagene, Agilent Technologies201223
Zestaw T7 MaxiprepPromega Corp.P1300
SMBPromega Corp.Z5482
Biotyna-16-UTPRoche Group1388908
ATPSigma-AldrichA7699
GTPSigma-AldrichG8877
PEPSigma-AldrichP7002
PKSigma-AldrichP7768
Polietylenoglikol 8000Fluka81268
Kwas folinowyFluka47612
SpermidynaFluka85558
tRNA z E. coliSigma-AldrichR1753
DEPCSigma-AldrichD5758
TricynaSigma-AldrichT5816
L-aminokwasySigma-AldrichLAA21
DTTFluka43815
statywy do separacji magnetycznejPromega Corp.Z5342

Bibliografia

  1. Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).
  2. Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA. J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).
  3. Gaynor, M., Mankin, A. S. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).
  4. Polacek, N., Mankin, A. S. The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).
  5. Steitz, T. A. Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target. Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).
  6. Tenson, T., Mankin, A. Antibiotics and the ribosome. Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).
  7. Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome. Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).
  8. Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript. J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).
  9. Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).
  10. Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA. Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).
  11. Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
  12. Onouchi, H. Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis. Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).
  13. Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA. J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).
  14. Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression. Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).
  15. Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression. J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).
  16. Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression. J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).
  17. Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center. J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).
  18. Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
  19. Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. luorescence- isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase. Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).
  20. Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase. Mol Divers. 4, 187-190 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja rybosom wanaliza peptydylo tRNAmRNA znakowane biotynparamagnetyczne kulki streptawidynoweekstrakt pozbawiony RF2translacja in vitrozahamowanie translacjitest peptydylo transferazyseparacja magnetycznaekstrakt bezkom rkowy

Powiązane artykuły