Artykuł metodologiczny

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

20.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2498

⸱

25 lutego 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama Huntsville, 2Department of Biology, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Streszczenie

Niedawne badania strukturalne i biochemiczne szczegółowo opisały wiele zdarzeń molekularnych zachodzących w rybosomie podczas hamowania syntezy białek przez antybiotyki oraz podczas syntezy powstających polipeptydów. Niektóre z tych antybiotyków oraz regulacyjne polipeptydy, występujące głównie w formie peptydylo-tRNA, hamują albo tworzenie wiązania peptydowego, albo terminację translacji1-7. Zdarzenia hamujące te mogą zatrzymać ruch rybosomu, co jest zjawiskiem określanym jako „zatrzymanie translacyjne” (translational arrest). Wykazano, że zatrzymanie translacji indukowane przez antybiotyk lub powstający polipeptyd reguluje ekspresję genów zaangażowanych w różnorodne funkcje komórkowe, takie jak wzrost komórki, oporność na antybiotyki, translokacja białek oraz metabolizm komórkowy8-13. Wiedza o tym, w jaki sposób antybiotyki i regulacyjne polipeptydy zmieniają funkcję rybosomu, jest niezbędna do pełnego zrozumienia roli rybosomu w translacji w każdym organizmie.

W niniejszej pracy opisujemy prostą metodologię, którą można wykorzystać do oczyszczania, wyłącznie w celach analitycznych, tych rybosomów, które translują konkretny mRNA i zawierają specyficzny peptydylo-tRNA14. Procedura ta opiera się na selektywnej izolacji translujących rybosomów związanych z mRNA znakowanym biotyną. Kompleksy translacyjne te są oddzielane od innych rybosomów w tej samej mieszaninie przy użyciu paramagnetycznych kulek streptawidyny (SMB) i pola magnetycznego (MF). mRNA znakowane biotyną są syntetyzowane w testach transkrypcji run-off z wykorzystaniem jako matryc fragmentów DNA generowanych metodą PCR, które zawierają promotory transkrypcyjne T7. Polimeraza RNA T7 włącza biotynę-16-UMP z biotyny-UTP; w naszych warunkach w cząsteczce mRNA o długości 600 nt z 25% zawartością UMP wbudowuje się około dziesięciu cząsteczek biotyny-16-UMP. Tak oznakowane biotyną cząsteczki mRNA są następnie izolowane i wykorzystywane w testach translacji in vitro przeprowadzanych z użyciem bezkomórkowych ekstraktów pozbawionych czynnika uwalniającego 2 (RF2), uzyskanych ze szczepów Escherichia coli zawierających rybosomy typu dzikiego lub zmutowane. Rybosomy translujące sekwencje mRNA znakowane biotyną zostają zatrzymane w obrębie kodonu stop z powodu braku białka RF2, które zazwyczaj odpowiada za terminację translacji. Zatrzymane rybosomy zawierające nowo zsyntetyzowany peptydylo-tRNA są izolowane i usuwane z reakcji translacji za pomocą SMB i MF. Kuleczki te wiążą wyłącznie cząsteczki mRNA zawierające biotynę.

Wyizolowane kompleksy translacyjne mogą być wykorzystywane do analizy cech strukturalnych i funkcjonalnych komponentów rybosomalnych typu dzikiego lub zmutowanych, bądź sekwencji peptydylo-tRNA, a także do określania interakcji rybosomów z antybiotykami lub innymi czynnikami molekularnymi 1,14-16. Aby zbadać funkcję tych wyizolowanych kompleksów rybosomalnych, można przeprowadzić testy peptydylo-transferazy w obecności antybiotyku puromycyny1. Do badania zmian strukturalnych w kompleksach translacyjnych można zastosować uznane procedury, takie jak i) sieciowanie do specyficznych aminokwasów14 oraz/lub ii) testy ochrony przed alkilacją1,14,17.

Protokół

1. Przygotowanie ekstraktu bezkomórkowego.

  1. Dwa gramy suchego osadu bakterii Escherichia coli uzyskanego z kultur w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego poddaje się dwukrotnemu przemyciu za pomocą pół litra buforu A zawierającego 10 mM Tris-octanu (pH 8.0), 14 mM octanu magnezu, 60 mM octanu potasu oraz 50 μg/mL fenylometansulfonylofluorydu (PMSF) poprzez wirowanie przy 5000 X g przez 5 min w temperaturze 4°C. Po przemyciu osad bakteryjny resuspenduje się w 40 mL buforu A.
  2. Komórki bakteryjne rozrywa się za pomocą prasy francuskiej (French Press), stosując ciśnienie 6000 psi. Ciśnienie to odpowiada 600 jednostkom przy użyciu tłoka o średnicy jednego cala. Rozrytą zawiesinę zbiera się do czystej probówki szklanej (50 mL).
  3. Rozrytą zawiesinę traktuje się 1 mM ditiotreitolem (DTT) i wirowuje przy 30 000 x g przez 30 min. Procedurę wirowania powtarza się, wykorzystując otrzymany nadfiltr. Końcowy nadfiltr rozdziela się (po 1 mL) do mikroprowbek. Następnie alikwoty mrozi się, używając mieszaniny suchego lodu z etanolem lub ciekłego azotu, i przechowuje w temperaturze -60°C lub -80°C.

2. Przygotowanie ekstraktów bezkomórkowych pozbawionych RF2.

  1. 4,5 mL zawiesiny kulek sepharose 4B z proteiną A miesza się z 5 mL antyserum anty-RF2 przy użyciu rotatora w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Mieszaninę wiruje się przy 2500 x g, aby oddzielić kulki od antyserum. Po odlaniu nadsączu kulki zawierające przeciwciała anty-RF2 (kulki anty-RF2) przepłukuje się poprzez resuspensję w 1 mL buforu B zawierającego 35 mM octanu Tris-acetatu pH 7,8, 10 mM octanu magnezu, 30 mM octanu amonu, 60 mM glutaminianu potasu oraz 5 μg/ mL leupeptyny jako inhibitora proteinaz. Następnie kulki anty-RF2 oddziela się od buforu B poprzez wirowanie w tych samych warunkach, które wskazano powyżej. Procedurę płukania powtarza się dwukrotnie.
  2. Jeden mL ekstraktu bezkomórkowego miesza się ze 150 μL kulek anty-RF2 przy użyciu rotatora w temperaturze 4°C przez dwie godziny. Mieszaninę wiruje się przy 10 000 x g, aby oddzielić ekstrakt bezkomórkowy od kulek. Nadsącz usuwa się i poddaje ponownej obróbce z kolejnymi 150 μL kulek anty-RF2. Procedurę tę powtarza się jeszcze raz z otrzymanym roztworem ekstraktu bezkomórkowego. Końcowy roztwór ekstraktu bezkomórkowego rozdziela się (po 100 μL) do mikroprowetek. Alikwoty zamraża się za pomocą mieszaniny suchego lodu z etanolem lub ciekłego azotu i przechowuje w temperaturze -60°C lub -80°C.

3. Przygotowanie matrycy DNA.

  1. Przygotować 1 mL reakcji PCR, mieszając 600 femtomoli matrycy plazmidowej zawierającej sekwencje do przetłumaczenia (Rys. 1), z 0,4 nanomolami każdego z oligodeoksynukleotydów wskazanych na Rys. 1, 0,2 mikromolami każdego dNTP oraz 50 U polimerazy Taq-DNA w buforze dostarczonym przez Stratagene Co. Reakcję amplifikacji przeprowadzić w następujących warunkach: 94°C przez 2 min, (94°C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72°C przez 1 min; przez 30 cykli) oraz 72°C przez 12 min.
  2. Produkty PCR oczyścić poprzez wytrącanie DNA po dodaniu 1/10 objętości 3 M octanu sodu, pH 5.2, oraz 2 objętości lodowatego etanolu. Procedurę wytrącania powtórzyć raz jeszcze. DNA zawiesić ponownie w 100 μL wody traktowanej diethylopirokarbonianem (DEPC).
    Zazwyczaj procedura ta pozwala uzyskać 100 μg produktu DNA o długości 600 bp.
  3. Sprawdzić integralność produktów PCR za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych.

4. Przygotowanie mRNA znakowanego biotyną.

  1. Przygotować 100 μL reakcji transkrypcji in vitro w wodzie traktowanej DEPC, mieszając 5 μg fragmentu DNA uzyskanego w reakcji PCR z 0,5 mikromola ATP, CTP, GTP, 0,3 mikromola UTP, 50 nanomolami biotyny-16-UTP oraz 10 μL mieszaniny enzymów T7 w buforze dostarczonym przez firmę Promega Co. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37°C przez 3 godziny.
    Aby określić ilość otrzymanego mRNA, należy usunąć matrycę DNA poprzez dodanie DNazy wolnej od RNaz. Reakcję inkubować w temperaturze 37°C przez 10 min.
  2. Oczyścić produkty mRNA poprzez wytrącenie RNA po dodaniu 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,2) oraz 2 objętości zimnego etanolu. Procedurę wytrącania powtórzyć raz jeszcze. mRNA zawiesić ponownie w 100 μL wody traktowanej DEPC.
    Zazwyczaj procedura ta pozwala uzyskać od 1-2 mg produktu mRNA o długości 600 nt znakowanego biotyną.
  3. Zweryfikować integralność produktów mRNA znakowanych biotyną za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych.

5. Izolacja translacyjnych rybosomów zawierających peptydylo-tRNA.

  1. Przygotować 500 μL mieszaniny reakcyjnej do translacji in vitro w wodzie traktowanej DEPC, mieszając 10-15 μg mRNA znakowanego biotyną z 75 nanomolami każdego z dziewiętnastu aminokwasów – wszystkich poza tym, który zostanie zastąpiony aminokwasem promieniotwórczym, 50 μCi aminokwasu promieniotwórczego (37MBq) oraz 20-50 μL bezkomórkowego ekstraktu pozbawionego RF2, w buforowanej mieszaninie reakcyjnej zawierającej 40 mM octanu Tris, pH 8.0, 10 mM octanu magnezu, 175 mM octanu potasu, 10 mM octanu amonu, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 mM GTP, 30 mM fosfoenolopirogronianu (PEP), 0.3 U/mL kinazy pirogronianowej (PK), 3.5% glikolu polietylenowego 8000, 1 mM spermidyny, 20 μg/mL kwasu folinowego oraz 250 μg/mL tRNA z E. coli. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37°C przez 10 minut.
    Kolejność dodawania składników reakcji jest bardzo istotna. Bezkomórkowy ekstrakt musi zostać najpierw zmieszany z roztworem buforowym zawierającym aminokwasy, a końcowa mieszanina inkubowana przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu aktywacji rybosomów. Następnie dodaje się mRNA znakowane biotyną. W przypadku analiz strukturalnych z wykorzystaniem procedur modyfikacji chemicznej dodanie aminokwasu promieniotwórczego nie jest wymagane.
  2. Do mieszaniny reakcyjnej translacji dodać 3 μL namagnesowanych kulek streptawidyny (SMB) zawieszonych w buforze C zawierającym 35 mM octanu Tris, pH 8.0, 10 mM octanu magnezu, 175 mM octanu potasu, 10 mM octanu amonu oraz 1 mM DTT. Inkubować nową zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  3. Oddzielić SMB od mieszaniny poprzez zastosowanie pola magnetycznego (MF) przy użyciu statywów do separacji magnetycznej.
  4. Resuspender SMB w buforze C i ponownie oddzielić kulki za pomocą MF. Powtórzyć tę procedurę płukania dwukrotnie. Resuspender kulki w 500 μL buforu C, przechowywać zawiesinę na lodzie i niezwłocznie przeprowadzić kolejną procedurę.

6. Analiza wyizolowanych rybosomów zawierających peptydylo-tRNA.

Dla peptydylo-tRNA

  1. Wymieszać 10 μL SMB (zawieszonego w buforze C) z 10 μL buforu do nakładania próbek zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2,5% (v/v) glicerolu, 4% dodecylu siarczanu sodu, 2 mM DTT oraz 0,2 mg/mL błękitu bromofenolowego. Rozdzielić komponenty przyczepione do kulek, przeprowadzając elektroforezę próbek w 10% żelach poliakrylamidowych Tris-tricine.
  2. Wysuszyć żele za pomocą próżniowej suszarki do żeli.
  3. Zweryfikować integralność i czystość peptydylo-tRNA poprzez naświetlenie wysuszonego żelu na filmie rentgenowskim.

W przypadku rybosomalnego RNA

  1. Do 10 μL zawiesiny kulek dodać 190 μL 2 mM roztworu etylenodiaminotetraoctanu (EDTA) przygotowanego w wodzie traktowanej DEPC oraz 200 μL fenolu nasyconego wodą. Wymieszać zawiesinę poprzez intensywne wstrząsanie w wortexie i oddzielić fazę nieorganiczną od fazy organicznej poprzez wirowanie przy 10 000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej. Górną warstwę wodną przenieść do nowej mikroprobówki.
  2. RNA z warstwy wodnej wytrącić poprzez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2, 1 μL roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/mL oraz 2 objętości lodowatego etanolu. RNA zawiesić ponownie w 10 μL wody traktowanej DEPC.
  3. Integralność rRNAs zweryfikować za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych.
    Zazwyczaj 50 μL zawiesiny kulek pozwala uzyskać 1 μg rRNAs.

7. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 2 przedstawia wyniki serii analiz oceniających jakość i funkcjonalność rybosomów translacyjnych wyizolowanych zgodnie z opisaną procedurą. Obserwacja pojedynczego prążka w żelach poliakrylamidowych wskazuje na obecność polipeptydów związanych z mRNA znakowanymi biotyną, przyłączonymi do SMB (Rysunek 2A). Oczyszczanie rybosomalnych RNA za pomocą tej procedury potwierdza również obecność rybosomów związanych z tymi mRNA znakowanymi biotyną (Rysunek 2B). Dodanie puromycyny, antybiotyku indukującego aktywność peptydylo-transferazy rybosomu, prowadzi do rozszczepienia powstających peptydylo-tRNA1. Jest to widoczne jako zmiana wzorca migracji wyizolowanego polipeptydu w żelach poliakrylamidowych (Rys. 2C). Wspólnie dane te wskazują, że mRNA znakowane biotyną przyłączone do SMB zawierają funkcjonalne rybosomy z peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających specyficzne peptydylo-tRNA umożliwia badanie wpływu peptydylo-tRNA, antybiotyków i innych cząsteczek na funkcję rybosomów (Rysunek 3A) oraz na ich strukturę (Rysunek 3B). W przedstawionych tutaj przykładach antybiotyk sparsomycyna oraz aminokwas tryptofan (Trp) hamują hydrolityczne rozszczepienie powstającego peptydylo-tRNA tnaC-tRNA indukowane przez RF2 w izolowanych rybosomach (Rysunek 3A). Oddziaływanie sparsomycyny lub Trp z rybosomem indukuje również zmiany strukturalne w niektórych nukleotydach tworzących 23S rRNA rybosomu translacyjnego (Rys. 3B). Podsumowując, materiał biologiczny uzyskany za pomocą opisanego tutaj protokołu jest przydatny w pogłębieniu wiedzy na temat kontaktów strukturalnych zaangażowanych w hamowanie funkcji rybosomów podczas ich oddziaływania z różnymi czynnikami molekularnymi.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Procedura stosowana do wytwarzania i oczyszczania rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA. Fragmenty DNA o długości ok. 650 bp, zawierające gen tnaC oraz przyległy do niego region, przedstawione na rysunku, są wykorzystywane jako matryce do przygotowania mRNA zawierającego biotynę, [(bio)UMP]mRNA. Fragmenty DNA te są otrzymywane metodą PCR przy użyciu oligodeoksynukleotydów wskazanych w górnej części rysunku. Podkreślone litery oznaczają położenie promotora T7 zakodowanego w starterze nukleotydowym. Pogrubione litery wskazują sekwencję Shine-Dalgarno wykorzystywaną w translacji sekwencji mRNA tnaC. Promotor T7 w fragmencie DNA jest rozpoznawany przez polimerazę RNA T7, która służy do transkrypcji (strzałka) sekwencji tnaC oraz znajdującej się poniżej sekwencji niekodującej. Transkrypcja kończy się w momencie, gdy polimeraza RNA dotrze do końca 3' fragmentu DNA, za sekwencjami terminacyjnymi rpoBC (rpoBC"t"). Struktura spinki-do-włosów terminatora rpoBC chroni mRNA przed aktywnością egzoribonukleazy 3'-5' obecnej w ekstraktach bezkomórkowych stosowanych w reakcjach translacji in vitro. Izolowane [(bio)UMP]mRNAs są wykorzystywane do generowania zatrzymanych rybosomów translacyjnych w testach translacji in vitro. Sekwencja tnaC w [(bio)UMP]mRNA jest translokowana przez rybosom, który zatrzymuje się po wbudowaniu ostatniego aminokwasu z powodu braku czynnika uwalniającego (RF2) w mieszaninie reakcyjnej. Kompleksy rybosom-[(bio)UMP]mRNA są izolowane z całkowitej mieszaniny reakcyjnej przy użyciu magnetycznych kulek z streptawidyną (SMB), które wiążą nukleotydy znakowane biotyną wbudowane w mRNA. SMB związane z kompleksami rybosom-[(bio)UMP]mRNA są wyodrębniane z całkowitej mieszaniny reakcyjnej przy użyciu pola magnetycznego (MF).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Analizy strukturalne i funkcjonalne wyizolowanych kompleksów. A) Reakcje translacji in vitro przeprowadzono z mRNA [(bio)UMP], w których kodon startowy genu tnaC zastąpiono kodonem stop. Produkty końcowe wyizolowano przy użyciu kulek z streptawidyną, zgodnie z opisem na Rys. 1. Produkty reakcji oraz wyizolowane cząsteczki poddano następnie analizie za pomocą elektroforezy na żelach poliakrylamidowych. Oznaczono prążki tRNA-tnaC oraz peptydu tnaC. B) Całkowite RNA wyizolowano z kompleksów w stanie zatrzymania (stalled complexes) przy użyciu procedur ekstrakcji fenolowej. Każde wyizolowane RNA rozdzielono metodą elektroforezy w żelach agarozowych. Wskazano rybosomalne RNA (rRNA). C) Wyizolowane kompleksy zawierające tRNA-tnaC inkubowano z (+) lub bez (-) 0,02 mM puromycyną (Puro) w temperaturze pokojowej przez 10 min. Peptydy tnaC znakowano podczas translacji za pomocą [35S]-metioniny (A) lub [3H]-proliny (B).

figure-protocol-3
Rycina 3. Analizy strukturalne i funkcjonalne rybosomów zawierających tnaC-tRNA, które są związane z antybiotykiem sparsomycyną lub aminokwasem tryptofanem. A) Izolowane kompleksy zawierające tnaC-tRNAs inkubowano z (+) lub bez (-) sparsomycyną (Spar) lub tryptofanem (Trp) w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie mieszaniny zmieszano z RF2 i inkubowano w 37°C przez 20 min. B) Analiza zmian metylacji w 23S rRNA indukowanych przez cząsteczki wiążące się wewnątrz rybosomu. Izolowane kompleksy wstępnie inkubowano z (+) lub bez (-) 2 mM Trp lub Spar przez 5 min w 37°C. Następnie dodano czynnik alkilujący, siarczan dimetylu, a mieszaniny inkubowano w temperaturze pokojowej przez kolejne 20 min. Ekstrahowano całkowite RNA i przeprowadzono testy przedłużania startera z użyciem znakowanego [32P] oligodeoksynukleotydu komplementarnego do nukleotydów 23S rRNA, które znajdują się 100 nukleotydów w dół strumienia od zmodyfikowanego nukleotydu. Końcowe produkty testów przedłużania rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelach poliakrylamidowych. Oznaczono nukleotydy 23S rRNA, na które wpłynęła obecność Trp lub Spar.

Dyskusja

Procedura izolacji opisana w niniejszym raporcie jest wysoce powtarzalna. Niestety, nie można łatwo uniknąć obecności krótkich peptydylo-tRNA powstających z tych samych sekwencji translacyjnych; takie peptydylo-tRNA mogą stanowić 15-20 % całkowitej izolatowej substancji (Rycina 2C). Stężenie tych zanieczyszczeń może wzrosnąć w przypadku zastosowania wyższych stężeń mRNA znakowanego biotyną lub gdy użyte ekstrakty bezkomórkowe są stare bądź były wielokrotnie wykorzystywane. Dlatego bardzo ważne jest kontrolowanie jakości i stężenia składników reakcji translacji in vitro. Alternatywnie dostępne są komercyjne, wysokowydajne zrekonstytuowane ekstrakty bezkomórkowe, które mogą być stosowane w tych samych celach (system PURE)18.

Stosując tę metodę, biotin-16-UMP jest wbudowywany losowo wzdłuż całej długości docelowego mRNA. Istnieje możliwość, że niektóre ORF zawierające ciągi urydyny mogły włączyć ten zmodyfikowany nukleotyd do swoich sekwencji, co wpływa na ich translację. W celu uzyskania najefektywniejszej translacji należy przetestować zmienne względne stężenia biotin-16-UTP/UTP podczas syntezy mRNA. Można zastosować alternatywne metody znakowania biotyną, celujące w koniec 5', który jest najstabilniejszym końcem cząsteczek mRNA. (i) Biotynę można przyłączyć do końca 5' mRNA, wykorzystując 3'-NH2ATP (3'-amino-3'-deoksyadenozynotrifosforan) oraz ligazę RNA T419. (ii) Do końca 5' mRNA można również przyłączyć oligonukleotyd znakowany biotyną na końcu 5', wykorzystując ligazę RNA T420. (iii) Do izolacji kompleksów translacyjnych można by również użyć oligodeoksynukleotydów znakowanych biotyną na końcu 3', które odpowiadają sekwencji komplementarnej do końca 5' mRNA. Te znakowane biotyną oligodeoksynukleotydy mogłyby zostać przyłączone do SMB przed izolacją. Następnie SMB przyłączone do znakowanych biotyną oligodeoksynukleotydów mogłyby zostać zmieszane z mieszaniną reakcyjną translacji, aby umożliwić interakcję z ich komplementarnymi sekwencjami mRNA. Po izolacji hybrydowy region RNA-DNA – a konkretnie region hybrydyzujący między znakowanym biotyną oligodeoksynukleotydem a sekwencją mRNA – mógłby zostać zdegradowany za pomocą RNazy H, oddzielając zatrzymane kompleksy od kulek streptavidyny. Ta alternatywna metoda może pozwolić na wykorzystanie kompleksów w przyszłych analizach strukturalnych z zastosowaniem metod o wyższej rozdzielczości.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

L.R.C.-V. pragnie dedykować niniejszą pracę pamięci dr. Adriel D. Johnsona, wspaniałego profesora, dla którego edukacja studentów była zawsze priorytetem. Brakuje nam Ciebie, Adriel. Jesteśmy wdzięczni Jacqueline Moreno za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów opisanych w niniejszym badaniu. Badanie to zostało sfinansowane z grantu przyznanego C.Y. przez National Science Foundation, MCB-0615390, oraz z funduszy startowych przyznanych L.R.C.-V. przez University of Alabama at Huntsville.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tris (zasada)Sigma-Aldrich252859
Octan magnezuFluka63049
Glutaminian potasuSigma-AldrichG1501
Octan amonuFluka09688
PMSFSigma-AldrichP7626
Kuleczki zawiesiny sepharose 4B z białkiem ASigma-AldrichP9424
Inhibitor leupeptynaSigma-AldrichL9783
Taq-polimeraza DNAStratagene, Agilent Technologies201223
Zestaw T7 MaxiprepPromega Corp.P1300
SMBPromega Corp.Z5482
Biotyna-16-UTPRoche Group1388908
ATPSigma-AldrichA7699
GTPSigma-AldrichG8877
PEPSigma-AldrichP7002
PKSigma-AldrichP7768
Polietylenoglikol 8000Fluka81268
Kwas folinowyFluka47612
SpermidynaFluka85558
tRNA z E. coliSigma-AldrichR1753
DEPCSigma-AldrichD5758
TricynaSigma-AldrichT5816
L-aminokwasySigma-AldrichLAA21
DTTFluka43815
statywy do separacji magnetycznejPromega Corp.Z5342

Bibliografia

  1. Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).
  2. Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA. J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).
  3. Gaynor, M., Mankin, A. S. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).
  4. Polacek, N., Mankin, A. S. The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).
  5. Steitz, T. A. Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target. Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).
  6. Tenson, T., Mankin, A. Antibiotics and the ribosome. Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).
  7. Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome. Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).
  8. Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript. J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).
  9. Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).
  10. Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA. Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).
  11. Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
  12. Onouchi, H. Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis. Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).
  13. Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA. J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).
  14. Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression. Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).
  15. Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression. J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).
  16. Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression. J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).
  17. Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center. J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).
  18. Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
  19. Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. luorescence- isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase. Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).
  20. Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase. Mol Divers. 4, 187-190 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja rybosom wanaliza peptydylo tRNAmRNA znakowane biotynparamagnetyczne kulki streptawidynoweekstrakt pozbawiony RF2translacja in vitrozahamowanie translacjitest peptydylo transferazyseparacja magnetycznaekstrakt bezkom rkowy

Powiązane artykuły