Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.
Artykuł metodologiczny
Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białka błonowe pełnią w żywych komórkach krytyczne funkcje związane z transdukcją sygnałów, transportem i przemianami energii, a w związku z tym są uwikłane w liczne dysfunkcje i choroby. Jednakże rozumienie strukturalne i funkcjonalne białek błonowych znacznie odstaje od wiedzy na temat ich rozpuszczalnych odpowiedników, głównie ze względu na trudności związane z ich solubilizacją i otrzymywaniem kryształów o jakości dyfrakcyjnej. Krystalizacja w mezofazach lipidowych (znana również jako krystalizacja in meso lub LCP) jest obiecującą techniką, która została z sukcesem zastosowana do uzyskania struktur o wysokiej rozdzielczości mikrobialnych rhodopsyn, białek fotosyntetycznych, beta-beczek błony zewnętrznej oraz receptorów sprzężonych z białkiem G. Krystalizacja in meso wykorzystuje środowisko błonowe zbliżone do naturalnego i zazwyczaj pozwala na otrzymanie kryształów o niższej zawartości rozpuszczalnika i lepszym uporządkowaniu w porównaniu z tradycyjną krystalizacją z roztworów detergentów. Metoda ta nie jest trudna, lecz wymaga zrozumienia zachowania faz lipidowych oraz wprawy w obchodzeniu się z lepkimi materiałami mezofazowymi. Prezentujemy tutaj prosty i wydajny sposób przygotowania LCP oraz rekonstytucji białka błonowego w dwuwarstwie lipidowej LCP przy użyciu mieszalnika strzykawkowego, a następnie dozowania nanolitrowych porcji LCP na płytkę analityczną lub krystalizacyjną, przeprowadzanie testów przedkrystalizacyjnych oraz pozyskiwanie kryształów z matrycy LCP. Protokoły te stanowią podstawowy przewodnik po próbach krystalizacji in meso; jednak, jak w każdym eksperymencie krystalizacyjnym, wymagane jest szerokie przesiewanie i optymalizacja, a pomyślny wynik nie jest w pełni gwarantowany.
Protokół
Typowy schemat eksperymentu krystalizacji in meso przedstawiono na Rys. 11,2. Analizy LCP-FRAP poprzedzające krystalizację są opcjonalne; mogą one jednak znacząco przyspieszyć proces poszukiwania wstępnych warunków krystalizacji, szczególnie w przypadku trudnych białek błonowych3.
1. Rekonstytucja białka w LCP
- Oczyścić interesujące białko błonowe w roztworze detergentu i zagęścić kompleksy białko/detergent do stężenia ~10 - 20 mg/mL, dbając o to, aby nie przekroczyć optymalnego stężenia detergentu1,4.
- Przenieść ~25 mg lipidy gospodarza LCP (zazwyczaj monooleiny) lub mieszaniny lipidów do plastikowej probówki o pojemności 1,5 mL i inkubować w temperaturze 40 °C przez kilka minut, aż lipid się stopi.
- Zamocować łącznik strzykawek do szczelnej strzykawki o pojemności 10 μL.
- Napełnić strzykawkę stopionym lipidem za pomocą pipety o regulowanej objętości. Zapisać objętość lipidu w strzykawce.
- Napełnić drugą strzykawkę o pojemności 10 μL roztworem białka, zachowując stosunek objętości roztworu białka do lipidu 2/3 v/v.
- Połączyć obie strzykawki za pomocą łącznika.
- Naprzemiennie przesuwać tłoki strzykawek, aby przemieszczać lipid i białko przez wewnętrzną igłę łącznika w przód i w tył, aż mezofaza lipidowa stanie się homogeniczna. LCP tworzy się samoistnie podczas mieszania mechanicznego, a białko zostaje wbudowane w dwuwarstwę lipidową LCP. Powstanie LCP można zweryfikować po jego przezroczystej, żelowatej konsystencji oraz braku dwójłomności w badaniu pod mikroskopem wyposażonym w polaryzatory skrzyżowane lub, jeśli to możliwe, za pomocą małokątowego rozproszenia promieni rentgenowskich1.
2. Testy LCP-FRAP przed krystalizacją
Analizy LCP-FRAP służą do pomiaru właściwości dyfuzyjnych białek błonowych zrekonstytuowanych w LCP w różnych warunkach przesiewowych3. Dyfuzja dalekozasięgowa białek błonowych w LCP jest niezbędna do pomyślnej krystalizacji; jednak mikrostruktura LCP ogranicza dyfuzję dużych białek lub oligomerycznych agregatów białkowych. Częstą przyczyną niepowodzenia eksperymentu krystalizacji in meso jest szybka agregacja białek prowadząca do utraty dyfuzji. Wykazano, że zachowanie agregacyjne białka zależy od konkretnego konstruktu białkowego, gospodarza lipidowego oraz składu roztworu przesiewowego3.
- Oznakuj białko barwnikiem fluorescencyjnym (Cy3 lub podobnym), stosując stosunek białko/barwnik wynoszący ok. 10/1, usuń niezwiązany barwnik i zagęść białko do stężenia ok. 1 mg/ml. Oznakuj wolne grupy aminowe lub wolne grupy tiolowe. W przypadku znakowania wolnych grup aminowych zastosuj pH od 7 do 7,5, aby przede wszystkim oznakować wolny koniec N. Należy pamiętać, że znakowanie grup aminowych może prowadzić również do oznakowania lipidów współoczyszczonych z białkiem.2,3.
- Rekonstytuować znakowane białko w LCP zgodnie z opisem w sekcji 1).
- Przygotować płytki analityczne zgodnie z opisem w sekcji 3), stosując roztwory przesiewowe LCP-FRAP zamiast ekranów krystalizacyjnych2.
- Inkubować płytki w temperaturze 20 °C w ciemności przez co najmniej 12 godzin w celu osiągnięcia stanu równowagi.
- Umieść jedną z płytek na stanowisku LCP-FRAP i ustaw ostrość na pierwszej studzience, korzystając z obiektywu 10x.
- Należy zarejestrować 5 obrazów fluorescencyjnych, aby utrwalić początkowy stan przed wybieleniem.
- Uruchom laser. Moc lasera oraz liczba impulsów powinny zostać tak dostosowane, aby wybielić od ok. 30% do 70% znakowanego białka w środku wybielonej plamki.
- Bezpośrednio po wyzwoleniu lasera należy rozpocząć rejestrację szybkiej sekwencji po fotowybielaniu, obejmującej ok. 20 obrazów, z najwyższą możliwą częstotliwością.
- Następnie należy zarejestrować powolną sekwencję po wybielaniu składającą się z około 50 obrazów, wybierając opóźnienie między obrazami w zakresie 1–20 s, w zależności od szybkości dyfuzji białka.
- Zintegruj natężenie wewnątrz obszaru wybielonego we wszystkich klatkach i skoryguj je pod kątem wybielania oraz wahań natężenia światła podczas akwizycji, dzieląc natężenie wewnątrz wybielonego obszaru przez średnie natężenie obszaru referencyjnego znajdującego się poza strefą wybielania laserowego.
- Znormalizuj skorygowaną intensywność tak, aby intensywność przed wybieleniem była równa 1, a początkowa intensywność po wybieleniu była równa 0.
- Wyznacz dopasowanie krzywej zaleźności znormalizowanej intensywności od czasu, F(t), korzystając z następującego równania5:
F(t) = M x exp(-2T/t) x (I0(2T/Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.) + I1(2T/t)), (Równ. 1)
gdzie M oznacza frakcję mobilną dyfundujących cząsteczek, a T to charakterystyczny czas dyfuzji, t jest rzeczywistym czasem każdej zarejestrowanej klatki, I0 i ja1 czy są 0th i 1st rzędy zmodyfikowanych funkcji Bessela. - Oblicz współczynnik dyfuzji, D, według wzoru:
D = R2/4T, (Równ. 2)
gdzie R to promień wybielonej plamki. - Przejdź do kolejnej studzienki i powtórz kroki od 2.5) do 2.13).
- Porównaj frakcje mobilne i współczynniki dyfuzji uzyskane dla różnych warunków przesiewowych. Zaprojektuj nowe ekrany krystalizacyjne w oparciu o składniki, które ułatwiały dyfuzję białka, wykluczając warunki, w których nie zaobserwowano dyfuzji białka. Jeśli białko nie dyfundowało w żadnym z przetestowanych warunków, rozważ rozszerzenie przestrzeni przesiewowej lub wypróbowanie nowej konstrukcji białka.
3. Przygotowanie prób krystalizacji LCP
- Rekonstytuuj białko w LCP zgodnie z opisem w sekcji 1).
- Przenieś LCP zawierające białko do szczelnej strzykawki o objętości 10 μL zamocowanej do dozownika strzykawkowego z powtarzalnym dozowaniem.
- Do strzykawki 10 μL przymocuj krótką, wymienną igłę (rozmiar 26 G, długość 10 mm).
- Nanieś krople (bolusy) LCP o objętości 20 nL na powierzchnię czterech sąsiednich dołków, tworzących kwadrat 2x2.
- Na każdą kropkę LCP nałóż 1 μL odpowiedniego roztworu z ekranu krystalizacyjnego.
- Przykryj cztery wypełnione dołki kwadratowym szkiełkiem przedmiotowym o boku 18 mm. Delikatnie dociśnij szkiełko, aby uszczelnić dołki.
- Powtarzaj kroki 3.4)–3.6) dla kolejnych zestawów 4 dołków, aż cała płytka zostanie wypełniona.
- Inkubuj płytkę w stałej temperaturze, okresowo sprawdzając formowanie i wzrost kryształów.
4. Odzyskiwanie kryształów z LCP
- Umieść płytkę z kryształami białek pod stereomikroskopem z regulowanym powiększeniem, wyposażonym w liniowy polaryzator obrotowy i analizator.
- Ustaw ostrość na wybrane wgłębienie, korzystając z niskiego powiększenia, tak aby całe wgłębienie znajdowało się w polu widzenia.
- Narysuj na szklanym przykryciu cztery linie, tworząc kwadrat w obrębie wgłębienia, używając ostrego narożnika ceramicznego kamienia tnącego do kapilar.
- Przyciśnij krawędzie naciętego obrysu za pomocą mocnej pęsety z ostrymi końcami, aby przenieść zarysowania przez całą grubość szkła przykrycia.
- Wywierć dwa małe otwory w przeciwległych narożnikach naciętego kwadratu.
- Wstrzyknij kilka μL roztworu precypitanta przez jeden z otworów, aby zmniejszyć odwodnienie podczas kolejnych etapów.
- Używając pod kątem ostrej igły sondy, rozłam szkło wzdłuż jednego lub dwóch boków, aby uwolnić wycięty kwadrat.
- Ostrożnie podnieś szklany kwadrat, obserwując grudkę fazy kubicznej. Jeśli grudka przylega do przykrycia, obróć szklany kwadrat i połóż go na dnie wgłębienia.
- Dodaj dodatkowe kilka μL roztworu precypitanta, w razie potrzeby uzupełnionego o krioprotektant, na wierzch odsłoniętej grudki fazy kubicznej we wgłębieniu.
- Zwiększ powiększenie mikroskopu i ustaw ostrość na kryształ.
- Dostosuj kąt między polaryzatorem a analizatorem, aby zwiększyć kontrast między dwójłomnym kryształem a tłem, zachowując jednocześnie wystarczającą ilość światła, aby widzieć pętlę do zbierania kryształów.
- Wybierz MiTeGen MicroMount o średnicy odpowiadającej wielkości kryształu, a następnie pobierz kryształ bezpośrednio z LCP, zagarniając go do MicroMount.
- Szybko zamroź MicroMount z pobranym kryształem w ciekłym azocie, a następnie wyślij go na linię wiązki źródła synchrotronowego w celu zebrania danych rentgenowskich6.
5. Reprezentatywne wyniki:
Zmodyfikowany ludzki receptor beta 2 adrenergiczny sprzęgany z białkiem G (β2AR-T4L) wyekspresowano w zainfekowanych bakulowirusem komórkach owadzie sf9 i oczyszczono w roztworze detergentu dodecylmaltosyd (DDM)/hemisukcynian cholesterylu (CHS) w obecności częściowego odwrotnego agonisty, karazololu7. Białko znakowano estrem Cy3 NHS i wykorzystano w testach prekrystalizacyjnych LCP-FRAP (Rysunek 2). Wstępne przesiewania na siatkach w kilku warunkach wybranych na podstawie wyników testów LCP-FRAP pozwoliły uzyskać pierwsze obiekty przypominające kryształy (Rysunek 3). Dalsza optymalizacja warunków wytrącania doprowadziła do otrzymania kryształów o jakości dyfrakcyjnej (Rysunek 4).
Rysunek 1. Schemat typowego eksperymentu krystalizacji w LCP. Kroki w szarych polach nie są opisane w obecnych protokołach.
Rycina 2. analiza LCP-FRAP z wykorzystaniem β2AR-T4L/karazolol w LCP na bazie monooleiny. A) Wyniki testu LCP-FRAP przeprowadzonego w automatycznym trybie wysokoprzepustowym, w którym każda próbka na płytce 96-dołkowej jest wybełana sekwencyjnie, a powrót fluorescencji mierzony jest po 30-minutowej inkubacji. Wyznaczone wartości powrotu fluorescencji, reprezentujące frakcję mobilną w każdej próbce, przedstawiono dla wszystkich 96 próbek. Roztwory przesiewowe zawierają 0,1 M Tris pH 8, 30% v/v PEG 400 w połączeniu z 48 różnymi solami w dwóch różnych stężeniach. B) Profile powrotu fluorescencji dla kilku reprezentatywnych warunków. Linie ciągłe reprezentują dopasowania zgodnie z równaniem 1. Frakcje mobilne i współczynniki dyfuzji wyznaczono przy użyciu równań 1 i 2. Szybki powrót na poziomie poniżej 10% w próbce zawierającej chlorek sodu wynika z obecności lipidów znakowanych fluorescencyjnie, które zostały współoczyszczone z białkiem.
Rysunek 3. Wstępne wyniki krystalizacji β2Kompleks AR-T4L/karazolol uzyskany w drodze wstępnego przesiewu siatkowego (coarse grid screening) wokół najbardziej obiecujących warunków zidentyfikowanych metodą LCP-FRAP, zawierający siarczan sodu (panel A) i mrzeczan sodu (panel B). Białko zostało znakowane estrem NHS Cy3, a obrazy fluorescencyjne wykonano przy wzbudzeniu przy 543 nm i emisji przy 605 nm.
Rysunek 4. Zoptymalizowane kryształy β2AR-T4L/karazolol. Zdjęcia kryształów wyhodowanych w obecności siarczanu sodu (panele A i B) oraz mrany potasu (panele C i D) wykonano w trybie jasnego pola (panele A i C) oraz przy użyciu polaryzatorów skrzyżowanych (panele B i D).
Dyskusja
Protokoły zapewniają podstawowe wskazówki wizualne dotyczące głównych etapów przeprowadzania eksperymentów krystalizacji in meso. Bardziej szczegółowe informacje związane z tymi protokołami, ze szczególnym uwzględnieniem potencjalnych pułapek, niedociągnięć lub alternatywnych metod, są dostępne w innych źródłach1,2. Opcjonalne testy LCP-FRAP mogą pomóc na wcześniejszych etapach w wyborze najbardziej obiecującej konstrukcji białka, lipidów gospodarza LCP i dodatków lipidowych, a także w ograniczeniu zakresu możliwych precypitantów i warunków buforowych3. Po znalezieniu wstępnego sukcesu krystalizacyjnego (tzw. hitu), należy go zoptymalizować w celu uzyskania kryształów lepszej jakości. Optymalizacja warunków krystalizacji in meso jest w zasadzie podobna do optymalizacji warunków dla białek rozpuszczalnych, z dodatkiem parametrów związanych ze składem LCP1. Kryształy białek błonowych hodowane w mezofazie lipidowej są zazwyczaj mniejsze niż kryształy otrzymywane w roztworach detergentów, ale są bardziej uporządkowane, co sprawia, że znacząco zyskują one dzięki zastosowaniu linii wiązek mikroogniskowych dostępnych w nowoczesnych źródłach synchrotronowych6.
Wiele procedur związanych z krystalizacją in meso, w tym przygotowywanie płytek do krystalizacji lub analiz, przeprowadzanie testów LCP-FRAP oraz detekcja kryształów, zostało częściowo lub w pełni zautomatyzowanych1,2,8,9, co pozwala na przesiewanie szerokiego zakresu warunków przy zużyciu niewielkich ilości białka i lipidów. Z drugiej strony, rekonstytucja białek w LCP oraz wycinanie kryształów pozostają operacjami manualnymi i bardziej żmudnymi, przez co istnieje potrzeba ich udoskonalenia.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była częściowo finansowana z grantów NIH nr GM073197 oraz RR025336.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka gazoszczelna 100 μL | Hamilton Co | 7656-01 | Wymagane są 2 strzykawki |
| Strzykawka gazoszczelna 10 μL | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Łącznik strzykawek | Hamilton Co | 7770-02 30902 | Łącznik można wykonać z dostępnych części, zgodnie z opisem w ref. 10 |
| Repetytory do strzykawek | Hamilton Co | 83700 | Repetytor do strzykawek można zmodyfikować, aby zmniejszyć objętość dozowania około 3-krotnie11 |
| Krótka (0,375”) zdejmowana igła z płaskim zakończeniem (styl punktu 3, rozmiar 26 G) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| Szklana płytka typu sandwich z 96 dołkami | Marienfeld | 08 900 03 | W przypadku operacji manualnych wygodniej jest złożyć szklaną płytkę typu sandwich, używając standardowych szkiełek mikroskopowych i dwustronnej taśmy klejącej z wyciętymi otworami1,2,12. |
| Szklany zakrywek | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monooleina | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Ekran krystalizacji | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Większość dostępnych komercyjnych ekranów może być stosowana do wstępnego przesiewu. Warunki, które konsekwentnie zaburzają LCP, można rozcieńczyć 2x w celu uzyskania lepszej kompatybilności13. | |
| Kamień do cięcia kapilar | Hampton Research | HR4-334 | |
| Pęseta precyzyjna | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Kątowa ostra sonda | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Należy dobrać średnicę MicroMount dopasowaną do rozmiaru kryształu |
Bibliografia
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
- Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
- Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
- Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
- Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).
Przedruki i uprawnienia
