Mechaniczna manipulacja neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów

Podsumowanie

Precyzyjne pomiary i aplikacja sił działających na neurony w zakresie od 2 do 1000 mikrodyn są realizowane przy użyciu kalibrowanych szklanych igieł. Metodologia ta może być wykorzystana do kontrolowania i pomiaru wielu aspektów rozwoju aksonów, w tym inicjacji aksonalnej, napięcia aksonalnego, prędkości wydłużania się aksonów oraz wektorów siły.

Streszczenie

Manipulacje komórkowe oraz wydłużanie aksonów neuronalnych można przeprowadzić za pomocą skalibrowanych szklanych mikrowłókien, zdolnych do pomiaru i przyłożenia sił w zakresie 10-1000 μdyne^1,2. Pomiary siły uzyskuje się poprzez obserwację zginania igieł szklanych zgodnie z prawem Hooke'a, które są kalibrowane bezpośrednią metodą empiryczną³. W pełni opisano wymagania sprzętowe oraz procedury wytwarzania, kalibrowania, modyfikowania i wykorzystywania igieł w badaniach nad komórkami. Zakresy sił stosowane wcześniej oraz różne typy komórek, do których zastosowano te techniki, demonstrują elastyczność tej metodologii i służą jako przykłady dla przyszłych badań^4-6. Zalety techniczne obejmują ciągłą „wizualizację” sił generowanych podczas manipulacji oraz możliwość bezpośredniej ingerencji w różnorodne zdarzenia komórkowe. Należą do nich bezpośrednia stymulacja i regulacja wzrostu oraz retrakcji aksonów⁷, a także odrywanie i pomiary mechaniczne każdego rodzaju hodowanych komórek⁸.

Protokół

1. Wykonywanie szklanych igieł.

1. Do wytwarzania igieł z profilowanym czubkiem o długości około 4 mm, które stanowią zamknięte lite belki, wykorzystuje się regulowany wyciągacz mikroigieł. Krótka długość 4 mm, w przeciwieństwie do długiego i elastycznego czubka, ogranicza wibracje końcówki igły podczas eksperymentów. W obszarze proksymalnym włókna o długości 4 mm igła gwałtownie zwęża się z średnicy rurki szklanej do 15 μm na odcinku 1 mm, natomiast najbardziej dystalny 1 mm włókna ma średnicę 2.5 μm. Stosujemy kapilary szklane R-6 o średnicy zewnętrznej OD 0.9 mm, średnicy wewnętrznej ID 0.6 mm i długości 8" oraz wyciągacz BB-CH. Jeśli badacz chce mierzyć inne zakresy sił, należy wyciągnąć igły o innych właściwościach sprężystych (tj. o innej długości i/lub grubości). Z każdej kapilary wyciąga się cztery igły o długości 2". Igły przechowuje się w przykrytych szalkach Petriego o średnicy 160 mm z dwoma „wężykami” z plasteliny, w które igły są lekko wciśnięte.
2. Szklane igły, jak również opisana później igła druciana, są w istocie belkami wykorzystywanymi jako sprężyny gnące o sztywności odpowiedniej do pożądanych pomiarów siły. Należy pamiętać, że siła zginania belki skaluje się jako sześcian jej długości, niezależnie od składu materiału. Zatem w każdym z opisanych poniżej etapów kalibracji, igłę/belkę o niewystarczającej sztywności można usztywnić poprzez niewielkie skrócenie (np. skrócenie o 10% powoduje wzrost sztywności o 28%, tj. 0.9³).

2. Wykonanie i kalibracja igły drucianej

1. Wykonaj kalibracyjną igłę drucianą, wkładając drut z Chromelu o średnicy 0.001" do wnętrza igły szklanej (wykonanej w sekcji 1.1) z odłamanym czubkiem. Wysuń drut poza czubek na długość 26 mm i przyklej go superklejem. Zegnij dystalny 1 mm drutu w haczyk.
2. Wykonaj mikro-ciężarki z 1 metra drutu z Konstantanu o średnicy 0.003". Aby zmierzyć drut, przyklej go taśmą do miarki, co pomoże go maksymalnie wyprostować. Zważ 1 m drutu, precyzyjnie potnij go na odcinki o długości 1 cm i zegnij kilka kawałków w kształt litery V.
3. Kalibracja igieł drucianych wymaga zastosowania mikroskopu dissectingowego z retikułem pomiarowym oraz mikromanipulatora. Mikroskop jest nachylony pod kątem 90° na bok za pomocą uniwersalnego statywu ramieniowego, tak aby można było obserwować odchylenie igły drucianej w dół. Zamocuj igłę drucianą z sekcji 2.1 w uchwycie narzędziowym mikromanipulatora w taki sposób, aby obszar z haczykiem był prostopadły do osi optycznej mikroskopu. Zrównaj haczyk igły drucianej z oznaczeniem na retikułach. Zawieś 1 cm mikro-ciężarek na haczyku i zanotuj odchylenie. Stałą gięcia (μdynes/μm) drutu referencyjnego oblicza się jako stosunek masy mikro-ciężarka (uwaga: 1 mg = 0.98 dynes) do zaobserwowanego odchylenia (μm). Aby przygotować igłę drucianą do następnego etapu, odetnij skalpelem haczyk w punkcie pomiaru masy. Obecność haczyka stanowi dodatkowy ciężar, który w niewielkim stopniu wygina drut. Wpływa to zatem na początkową pozycję drutu w retikułach przed dodaniem ciężarka. Pomiar stałej sprężystości drutu wynika z odchylenia drutu w momencie dodania ciężarka do punktu zgięcia (przyszłego czubka drutu). Odcięcie haczyka nie zmienia stałej sprężystości drutu.

3. Kalibracja pośrednich igieł szklanych

1. Kalibracja pośrednich igieł szklanych wymaga użycia mikroskopu odwróconego z siatką okularową. Po jednej stronie stolika mikroskopowego znajduje się mechaniczny mikromanipulator służący do utrzymania drucianej igły z sekcji 2 w centrum pola optycznego. Po drugiej stronie znajduje się trójąosiowy hydrauliczny mikromanipulator (patrz tabela sprzętu), służący do przesuwania kalibrowanej pośredniej igły szklanej. Używając mikromanipulatorów, należy zbliżyć obie igły do siebie w centrum pola optycznego pod kątem ~45° w szalce Petriego o wymiarach 160 mm x 30 mm z wodą, przy powiększeniu 10x.
2. W celu oceny w pierwszej kolejności wytwarza się serię igieł wyciągniętych przy użyciu różnych ustawień wyciągarki do pipet. Celem jest wykonanie pośredniej igły szklanej o stałej sprężystości zgięcia wynoszącej 20-30 μdynes/μm. Wyznaczenie sztywności odbywa się poprzez pomiar stosunku ugięcia igły pośredniej w porównaniu do ugięcia igły drucianej. Na przykład, gdy igła druciana i szklana stykają się, igłę szklaną przesuwa się tak, aby odgiąć igłę drucianą o odległość 5 kresek na siatce, widoczną przez okulary. Przesunięcie igły szklanej w bok rozłącza igły. Igła druciana wraca następnie do swojej pierwotnej pozycji startowej, ale igła szklana znajdzie się teraz w nowej pozycji. Obciążenie igły szklanej oblicza się następnie z jej nowej pozycji przy zerowej sile minus pozycji obu igieł przy równym obciążeniu siłą (obie igły w kontakcie). W tym przykładzie, jeśli obie igły zostaną odgięte do kreski 5 (od zera na siatce), igła druciana wróci do zera, podczas gdy igła szklana może odskoczyć do 25; jeśli tak się stanie, oznacza to, że ugięła się o 20 kresek przy tej samej sile, która odgięła igłę drucianą o 5 kresek. Zatem stosunek zgięć obu igieł pozwala na kalibrację igły szklanej, która w tym przypadku jest 4 razy mniej sztywna niż igła druciana. Ponieważ obliczenia stałej sprężystości w sekcji 3.4 wykorzystują stosunki odległości, są one niezależne od powiększenia lub rozmiaru podziałki siatki. Jedynym ograniczającym czynnikiem jest wymóg, aby ugięcia były na tyle małe, by mieścić się w zakresie liniowej sprężystości igieł.
3. Należy wykonać serię ugięć na pozycjach 5, 10, 15, 3, 7, 12, 17, 5, 10, 15 kresek na siatce. Jeśli którekolwiek ugięcia zostaną zwolnione przedwcześnie, należy je powtórzyć. Pomiędzy ugięciami należy utrzymywać igłę drucianą w wyrównaniu na zerze. Dla każdego z tych ugięć należy odnotować wielkość ugięcia oraz końcową pozycję igły szklanej przy zerowym obciążeniu po zwolnieniu. Tworzy to 10 par punktów danych. Można stosować inne sekwencje, jednak ta seria została zaprojektowana tak, aby dostarczyć wczesnych informacji o spójności wewnętrznej, liniowości i histerezie (wyniki ugięć 5 + 10 = 15; 3 + 7 = 10; ugięcia 5, 10, 15 po zwolnieniu powinny być w przybliżeniu takie same na początku i na końcu).
4. Regresja liniowa zarejestrowanych ugięć z sekcji 3.3 daje dokładniejszą kwantyfikację stałej zgięcia pośredniej igły szklanej niż pojedynczy stosunek ugięć. Pozwala ona również na ocenę liniowości igły oraz jakości kalibracji, co jest wskazywane przez wyższą wartość r i bliskość punktu przecięcia linii regresji z osią rzędnych do zera. Aby przygotować 10 par danych z sekcji 3.3 do regresji, od drugiej liczby z zarejestrowanych par (końcowej pozycji igły szklanej przy zerowym obciążeniu po zwolnieniu) należy odjąć odpowiadające jej początkowe ugięcie, czyli pierwszą liczbę z pary. Po wykonaniu tej operacji nowy zestaw par liczb składa się z początkowego ugięcia i obliczonej różnicy. Do tych 10 eksperymentalnych par danych należy dodać 5 kontrolnych par 0,0, aby zakotwiczyć regresję liniową przy zerowej sile dla zerowego ugięcia. Nie jest to absolutnie wymagane, ale zwiększa stopień dokładności. Zakotwiczenie w punkcie 0,0 opiera się na zasadzie, że igła nie jest zgięta, gdy nie jest przyłożona żadna siła. Z tych 15 par danych należy obliczyć regresję liniową. Stała sprężystości zgięcia kalibrowanej igły szklanej jest równa znanej stałej zgięcia igły drucianej podzielonej przez nachylenie tej linii regresji.

4. Kalibracja szklanej mikropipety roboczej używanej do manipulacji neuronami

1. Szklane igły o odpowiedniej podatności, 2-15 μdynes/μm, przeznaczone do eksperymentów na neuronach, kalibruje się względem pośredniej igły szklanej w sposób analogiczny do opisanego w sekcji 3. Oznacza to, że testowane igły robocze odchylają igłę pośrednią o znanej sztywności, umieszczoną w pozycji igły drucianej opisanej w sekcji 3. Igły szklane o sztywności poniżej 2 μdynes/μm można nieco skrócić, aby doprowadzić je do odpowiedniego zakresu sztywności.

5. Igły są wstępnie traktowane czynnikami adhezyjnymi

1. Igły przeznaczone do obróbki wciska się w bok bryły gliny utrzymywanej w uchwycie zamocowanym nad zlewką o pojemności 10 ml z roztworem czynnika przylepnego, tak aby w roztworze zanurzony był tylko czubek igły. Zanurzanie trzpienia rurki kapilarnej jest niewskazane, ponieważ prowadzi do zwiększonego gromadzenia się powłoki na czubku z biegiem czasu, co zmienia sztywność i obniża skuteczność przylegania igły. Kalibrowaną igłę można wykorzystać około 4 razy, a następnie ponownie ją skalibrować w celu zapewnienia dokładności. Igły zanurza się sekwencyjnie w 0,1% roztworze polilizyny przez 30 minut, a następnie w konkanawalinie A (1 mg/ml w PBS) przez 30 minut. Polilizynę można stosować wielokrotnie przez kilka tygodni, przechowując ją w temperaturze -20°C. Roztwór conA należy przygotowywać co tydzień i przechowywać w temperaturze 4°C. W przypadku innych typów komórek cząsteczki prezentowane na ich powierzchni przez igłę mogą determinować przebieg badania.

6. Konfiguracja sprzętu

1. Stanowisko do pracy nad rozciąganiem jest ustawione na stole wibroizolacyjnym. Składa się ono z mikroskopu odwróconego wyposażonego w szynę zamontowaną po lewej stronie nad stolikiem oraz przymocowanego do niej manipulatora hydraulicznego, który podtrzymuje nasze wyważone, niestandardowe przedłużenie, w które włożony jest podwójny uchwyt narzędzi. Ustaw manipulator hydrauliczny wzdłuż szyny, umieszczając igłę w jego uchwycie na drodze światła mikroskopu, podczas gdy regulatory manipulatora znajdują się w centrach swoich zakresów. W czasie traktowania igły czynnikami adhezyjnymi, włącz inkubator Ringcubator lub inny system grzewczy stolika mikroskopowego, aby stolik osiągnął równowagę termiczną przed rozpoczęciem eksperymentów.

7. Wyrównywanie igieł

1. Celem jest takie ustawienie dwóch igieł (referencyjnej i roboczej) w polu widzenia mikroskopu, aby ich końcówki znajdowały się w odległości około 50 μm, przy czym igła referencyjna powinna znajdować się powyżej naczynia hodowlanego, a zatem być nieco poza obszarem ostrości, gdy igła holująca jest w ostrości na dnie naczynia. Obie igły wraz z uchwytami są zamontowane w podwójnym uchwycie narzędziowym Leica, który sam w sobie jest małym mikromanipulatorem. Za pomocą mikromanipulacji podwójnego uchwytu narzędziowego obie końcówki ustawia się równolegle. Igłę referencyjną należy wsunąć do uchwytu tylko na niewielką odległość, wystarczającą do zaciśnięcia jej przez pierścień mocujący, a następnie umieścić cały ten zespół w prawej stronie podwójnego uchwytu narzędziowego. Igłę roboczą (poddaną obróbce) należy wsunąć do uchwytu do połowy jej długości i umieścić w lewej stronie podwójnego uchwytu narzędziowego. Gdy obie końcówki igieł zostaną wysunięte na tę samą pozycję i wyrównane, różna długość igieł w uchwytach spowoduje przesunięcie pierścieni mocujących, dzięki czemu nie będą one przeszkadzać w zbliżeniu końcówek do siebie. Kroki od 7.2 do 7.4 wykonuje się bez powiększenia. Kroki 7.5-7.8 wykonuje się pod obserwacją mikroskopową.
2. Należy wstępnie ustawić hydrauliczny mikromanipulator tak, aby pokrętło regulacji pionowej znajdowało się w najwyższym położeniu. Pozostałe pokrętła oraz śrubę przesuwną (przód/tył) uchwytu narzędziowego należy ustawić w połowie ich zakresu.
3. Należy zbliżyć do siebie końcówki obu igieł, używając śruby regulacji bocznej znajdującej się po prawej stronie uchwytu narzędziowego. Następnie, w razie potrzeby, należy przesunąć same uchwyty igieł do przodu lub do tyłu w podwójnym uchwycie narzędziowym, aby końcówki igieł znalazły się w tej samej pozycji wysunięcia. Należy obejrzeć zestaw z boku i za pomocą śruby regulacji góra/dół po prawej stronie wprowadzić końcówki w tę samą płaszczyznę. Jeśli igła jest ustawiona pod kątem w swoim uchwycie, należy obrócić uchwyty w uchwycie narzędziowym, aby zmniejszyć przerwę między końcówkami.
4. Należy wychylić uchwyt narzędziowy i umieścić końcówki w torze światła nad powierzchnią medium, kierując je stromo w dół. Przed zabraniem ręki należy dokręcić śrubę przegubową w podstawie.
5. Przed zbyt głębokim opuszczeniem igieł, co mogłoby doprowadzić do ich złamania lub zanieczyszczenia osadami na dnie naczynia hodowlanego, należy zlokalizować ich końcówki w polu widzenia mikroskopu. W naczyniu o średnicy 60 mm 15 ml medium zapewnia wystarczającą głębokość, stanowiąc margines bezpieczeństwa nad dnem naczynia. Warto przeprowadzić wstępne ćwiczenie z niekalibrowaną igłą, aby oswoić się z tym etapem. Należy zacząć od ustawienia ostrości powyżej komórek na dnie naczynia, używając obiektywu 10x. Czynność tę należy wykonywać w obszarze naczynia z dala od komórek światłoczułych lub reprezentatywnych dla eksperymentu. Następnie należy opuścić igły do medium. Przesuwaj igły na boki, szukając ich cienia. Jeśli nie są widoczne, należy je nieco bardziej opuścić i przesunąć do przodu w naczyniu, powtarzając ruchy na boki. Końcówkę lokalizuje się, przesuwając igłę do tyłu (lub do przodu) i w dół.
6. Należy przekręcić śrubę regulacji bocznej, aby zidentyfikować, którą igłę znaleziono. Jeśli igła porusza się wraz ze śrubą, jest to igła referencyjna; jeśli nie, jest to igła kalibrowana. W przypadku igły kalibrowanej należy użyć śruby bocznej, aby przesunąć igłę referencyjną w jej kierunku. Następnie należy przesuwać ją do przodu i do tyłu, szukając cienia igły referencyjnej. Jeśli znaleziona igła jest referencyjna, należy przesunąć ją w lewo, jednocześnie przesuwając hydraulicznie zestaw w prawo w poszukiwaniu igły kalibrowanej.
7. Po zlokalizowaniu obu igieł należy użyć precyzyjnych elementów sterujących podwójnego uchwytu narzędziowego do ich wyrównania. Ze względu na stromy kąt igieł wchodzących nad krawędź naczynia, sterowanie góra/dół powoduje również przesunięcie do przodu (wydłużenie) przy regulacji w górę oraz skrócenie przy regulacji w dół. Śruba regulacji przód/tył po lewej stronie działa odwrotnie: pchanie końcówki do przodu przesuwa ją również w dół do naczynia, a cofanie wycofuje igłę, jednocześnie podnosząc pozycję końcówki. Zatem podniesienie igły referencyjnej i pchnięcie igły kalibrowanej do przodu wydłuży obie, wyrównując je na końcach i zapewniając optymalną relację wysokości nad naczyniem. Jeśli igła referencyjna wystaje znacznie poza igłę roboczą, można wkręcić/pchnąć igłę roboczą w dół i do przodu, jednocześnie opuszczając i skracając igłę referencyjną, aż obie zostaną wyrównane, a igła robocza znajdzie się niżej. Czasami zakres śrub nie pozwala na zbliżenie igieł, wówczas może być konieczne delikatne przesunięcie samych uchwytów; należy upewnić się, że śruba przegubowa jest mocno dokręcona i, opierając palce o krawędź uchwytu narzędziowego, przyłożyć siłę w celu przesunięcia trzpieni. Można również, podobnie jak wcześniej, obracać uchwyty igieł w uchwycie narzędziowym podczas ich przebywania w medium, obserwując efekt i sprawdzając, czy zbliżają się do siebie.
8. Należy zarejestrować obraz tej ostatecznej, skorygowanej pozycji; odległość między igłami bez przyłożonej siły stanowi odniesienie dla dystansu zerowego. Następnie należy unieść igły powyżej płaszczyzny preparatu i „zaparkować” je na brzegu pola widzenia.
9. Zanieczyszczenia na igle można usunąć, przeciągając ją przez menisk. Najpierw należy odsunąć igłę referencyjną od drugiej igły, aby uniknąć zablokowania się obu końcówek. Może być konieczne wykonanie kilku takich przejść.

8. Przyłączanie do komórek

1. Do tego momentu igły były obserwowane bezpośrednio przez mikroskop. Od momentu przyкрепienia komórki obserwacje będą prowadzone zarówno przez mikroskop, jak i na ekranie wideo. Aspekt lewo/prawo w obu przypadkach jest identyczny, ale orientacja góra/dół obrazu na ekranie wideo nie jest taka sama jak (grawitacyjny) kierunek góra i dół w mikroskopie. Aby wyjaśnić różnice między kierunkami góra/dół obserwowanymi bezpośrednio przez mikroskop a tymi na ekranie wideo, te drugie będą określane jako „góra” i „dół” (w cudzysłowie).
2. Proces przeciągania wykonuje się poprzez zmianę pozycji dwóch igieł od lewej do prawej („poziomo”) na ekranie wideo. W związku z tym wybór eksperymentalnego aksonu opiera się częściowo na aksonie rozciągającym się w tym samym kierunku „poziomym”. Akson może odchylać się „w dół” od kierunku „poziomego” o maksymalnie 15°, ponieważ zostanie to skompensowane manewrem „podbicia” opisanym w sekcji 8.5. Ponadto akson wybrany do manipulacji powinien mieć długość co najmniej równą długości ciała komórki i posiadać aktywny stożek wzrostu. Preferowane są aksony rozciągające się na prawo od ciała komórki ze względu na konfigurację podwójnego uchwytu narzędzi z igłą roboczą zamontowaną po lewej stronie igły referencyjnej, tak aby przyłożone podczas przeciągania napięcie zwiększało przerwę między obiema igłami.
3. Główny akson rozciągający się na lewo od ciała komórki może zostać przeciągnięty bez zmiany orientacji uchwytu podwójnego narzędzia poprzez zwiększenie przerwy między igłami i lekkie uniesienie igły referencyjnej. Pozwala to igle przeciągającej na większy zakres wygięcia w stronę referencyjną i, jeśli jest to konieczne, przejście pod nią. Przeciąganie będzie wówczas przebiegać w lewo, a igła przeciągająca będzie wyginać się w stronę igły referencyjnej wraz ze wzrostem napięcia. Podczas analizy danych ta zmiana w relacji napięcia do odległości referencyjnej jest wprowadzana do arkusza poprzez odjęcie pomiaru rozdzielczości igieł od zerowej odległości referencyjnej, zamiast odejmowania odległości zerowej od pomiaru.
4. Przesuń igły blisko stożka wzrostu aksonu, ponownie zarejestruj odległość zerową, unieś igły i napompuj stół wibroizolacyjny.
5. Samo umieszczenie igły roboczej przed posuwającym się stożkiem wzrostu może spowodować spontaniczne przytwierdzenie w miarę postępu stożka wzrostu. Aby proaktywnie zmanipulować przytwierdzenie do stożka wzrostu, umieść igłę przeciągającą „poniżej” stożka wzrostu, a następnie opuść igłę na dno naczynia. Spowoduje to odchylenie igły „w górę”, jej wygięcie i przesunięcie wzdłuż dna naczynia w stronę stożka wzrostu, co doprowadzi do jego odczepienia i przesunięcia „w górę”. Dociśnij igłę do dna naczynia tylko tyle, aby stożek wzrostu zawinął się wokół końcówki igły, ale nie tak mocno, aby ześlizgnął się z igły i przesunął do tyłu. Odczekaj 20 minut, aby uchwyt mógł się ustabilizować. Przy odpowiednim doświadczeniu wskaźnik sukcesu może wynosić nawet 90%, ale zazwyczaj oscyluje wokół 75%. Na początku wskaźnik sukcesu może wynosić około 25%. Głównym błędem na początku jest „nadmierna manipulacja” stożkiem wzrostu. Początkowa interakcja w „kroku podbicia” trwa kilka sekund. Następnie należy pozostawić stożek wzrostu w spokoju, aby utworzył trwałe przytwierdzenie. W kolejnych krokach niezbędna jest cierpliwość.
6. Gdy stożek wzrostu znajdzie się na igle, przyłóż do niego lekkie napięcie, przesuwając igły w prawo, i lekko unieś igłę. Skompensuj ruch igły „w dół”, przesuwając ją nieco do przodu podczas podnoszenia. Podnoś etapami, aż przytwierdzony wypustek będzie rozciągał się prostopadle do igły i powyżej powierzchni naczynia. Prostopadłe ustawienie aksonu rozciągającego się od igieł po rozpoczęciu przeciągania jest wymagane dla dokładnych pomiarów siły, tak aby jedynym zastosowanym wektorem siły był wektor wzdłuż osi aksonu. Jeśli przeciągany wypustek odchyla się od igły, wektor siły jest przenoszony wzdłuż osi igły zamiast wyginać ją, przez co całkowita siła nie jest mierzona. Odsunięcie się od miejsca początkowego przytwierdzenia do naczynia poprawia szanse na trwałe przytwierdzenie do igły. Końcówka może znajdować się powyżej powierzchni naczynia (co widać po niewielkich wibracjach lub innej płaszczyźnie ostrości niż dno naczynia) lub dotykać go z minimalną siłą. Zbyt duży opór przy powierzchni zafałszuje pomiary. Igła przyklejona do naczynia lub wypustek komórkowy ponownie przytwierdzony do podłoża doprowadzą do obciążenia siłą w przypadku dalszych prób przesuwania, co następnie spowoduje nagłe „odskoczenie” z możliwą utratą przytwierdzenia. Aby uwolnić igłę z takiego punktu blokady, przesuń igłę do przodu i do tyłu („w górę” i „w dół” w płaszczyźnie ekranu”) zamiast zwiększać siłę (w prawo).

9. Wydłużanie aksonu lub wypustki komórkowej

1. Holowanie wykonuje się poprzez przyłożenie małych przyrostów siły, przesuwając igły z dala od ciała komórki. Siły są obserwowane jako zwiększająca się przerwa między igłami. Stopniowo zwiększając napięcie, należy uważnie obserwować wszelkie oznaki odłączenia stożka wzrostu od igły.
2. Jeśli stożek wzrostu odłączy się i nie cofa się gwałtownie, należy nieco zmniejszyć napięcie i odczekać; często stożek wzrostu „dogoni” igłę i ponownie uchwyci jej końcówkę. Jeśli akson oderwie się od igły, należy go przechwycić przed cofnięciem, dociskając go do dna naczynia igłą i powtarzając ruch „pchnięcia w górę” lub „pociągnięcia w dół”, aby przyłożyć niewielkie napięcie, a następnie odczekać około 10 min na ponowne przyczepienie. Po dwóch nieudanych próbach zaleca się użycie innej komórki.
3. Poziom medium w naczyniu należy utrzymywać poprzez godzinne dodawanie wody w celu zrównoważenia parowania, używając znaku na ściance naczynia do wskazania początkowej głębokości. Za pomocą długiej pipety Pasteura należy powoli dodawać wodę przy ściance naczynia, z dala od igieł. Wydłużanie wypustki często „zatrzymuje się”, jeśli medium stanie się hiperosmotyczne. Parowanie można ograniczyć, nakładając warstwę oleju na powierzchnię medium, ale należy to zrobić po wprowadzeniu igły do medium. Jeśli igła przechodzi przez olej, prawdopodobieństwo przyczepienia się stożka wzrostu do igły jest znacznie mniejsze.
4. Na koniec eksperymentu, przed wyjęciem igieł z naczynia, należy ponownie sprawdzić dystans zerowy.

10. Analiza danych

1. Odczytaj pozycje igieł wzdłuż osi poziomej na ekranie, pozycję ciała komórki i zapisz czasy. Odległość rozdzielenia igieł pomniejszona o dystans zerowy bez obciążenia, pomnożona przez stałą giętkości igły, odpowiada sile przyłożonej w μdynes. Skalibruj odległości na obrazie ekranu za pomocą mikrometru przedmiotowego.
2. Kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości danych jest upewnienie się, że referencyjna odległość rozdzielenia igieł (siła zerowa) nie zmienia się w trakcie eksperymentu. Zmiany termiczne wpływają na sprzęt w skali mikronowej, dlatego nie należy włączać klimatyzacji w trakcie trwania eksperymentu. Ponadto, jeśli system grzewczy mikroskopu posiada czas opóźnienia, należy poczekać do uzyskania stabilności termicznej. Ringcubator skraca ten czas opóźnienia, a także izoluje zmiany termiczne w naczyniu od reszty mikroskopu i systemu manipulacyjnego, co zmniejsza dryft termiczny punktu zerowego oraz zmiany ostrości. Innym czynnikiem zmieniającym rozdzielenie nieobciążonych igieł jest napięcie powierzchniowe na trzpieniach igieł. Obciążenie zmienia się wraz z głębokością cieczy w naczyniu. Okresowe sprawdzanie odległości referencyjnej poprzez wycofanie igieł i tymczasowy odczyt dystansu zerowego bez przyłożonej siły w trakcie eksperymentu poprawia jakość danych, nawet jeśli odnotowuje się zmianę w rozdzieleniu.

11. Reprezentatywne wyniki:

Szklane igły z kalibracją siły można łatwo przystawić do dowolnego regionu komórki, zazwyczaj do stożka wzrostu, co jest wizualizowane bezpośrednio za pomocą mikroskopii świetlnej. Po odpowiednim przygotowaniu igły w celu uzyskania przylegania komórkowego, można eksperymentalnie przyłożyć napięcie mechaniczne do badanego regionu komórki lub zmierzyć siły generowane przez ten region. Przykładowy eksperyment z przeciąganiem neuronu przedstawiono na Ryc. 1, gdzie przeciągnięty akson zwiększył swoją długość dwukrotnie w ciągu dwóch godzin.

Rysunek 1. Wybór hodowanej komórki zwoju korzeniowego tylnego kurczaka o preferowanej orientacji do przeciągania. Przed rozpoczęciem manipulacji eksperymentalnej zapisano początkową zerową odległość odniesienia między igłami (A). Do stożka wzrostu zastosowano manewr „pchnięcia w górę” (B). Przeciąganie rozpoczyna się wraz ze zwiększonym obciążeniem siłą, co wskazuje rozdzielenie igieł (C). Przeciąganie doprowadziło do wydłużenia aksonu; „poziome” i prostopadłe ustawienie przeciąganego aksonu oraz igły roboczej umożliwiło dokładne pomiary siły (D). Pasek skali = 40 μm. Kalibracja igły = 6,9 μdyne/μm.

Dyskusja

Techniki przykładania i pomiaru sił komórkowych mają długą historię⁹. Nasza metoda była pierwotnie inspirowana pracami Dennisa Braya, który wykorzystywał szklane igły podobne do naszych do „ciągnięcia” neuronów ze stałą prędkością przy użyciu zmotoryzowanego urządzenia hydraulicznego¹⁰. Istnieje wiele alternatywnych sposobów przykładania sił do komórek, w tym: silniki krokowe¹¹, koraliki magnetyczne¹², mikrofabrykowane belki¹³ oraz przepływy płynów¹⁴. Te o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kapilara R-6	Drummond Scientific	9-000-3111	Szkło R-6 OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8"
Wyciągacz BB-CH	Mecanex S.A., Genewa, Szwajcaria	BB-CH puller	Używać trybu 4 Alt przy CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000
Drut Chromel 0.001"	Omega Engineering, Inc.	SPCH-001-50	nieizolowany drut termopary, szpula 50ft, obecnie nazywany Chromega
Drut Constatan 0.003"	Omega Engineering, Inc.	SPCI-003-50	nieizolowany drut termopary, szpula 50 ft
Precyzyjna pęseta	Fine Science Tools	91150-20	Dumont Inox #5
Uniwersalny statyw z ramieniem do mikroskopu	Nikon Instruments	76135 lub 90430	Większość marek lub typów statywów z ramieniem będzie odpowiednia do tego zastosowania
Mechaniczny mikromanipulator	Narishige International	M-152	Trójosiowy mikromanipulator gruboustawny z bezpośrednim napędem
Hydrauliczny mikromanipulator	Narishige International	MO-203	Obecnie dostępny jako MMO-203, typ z trzema ruchomymi osiami
Uchwyt igłowy	Leica Microsystems	11520145	Zestaw 3 szt.
Pojedynczy uchwyt na instrument	Leica Microsystems	11520142
Podwójny uchwyt na instrument	Leica Microsystems	11520143
Mechaniczny mikromanipulator	Leica Microsystems	39430001	Montaż słupowy, 1 uchwyt na sondę, Model RH 430001
Mechaniczny mikromanipulator z joystickiem	Leica Microsystems	11520137
Leica DM IRB	Leica Microsystems		Mikroskop odwrócony
Stół wibroizolacyjny Vibraplane	Kinetic Systems	seria 1200	Używany model 1201-02-12
Ringcubator	Własna konstrukcja (patrz odniesienie 19)		Odniesienie 19, wymaga zaktualizowanego sterownika wymienionego poniżej
Programowalny sterownik temperatury	Instrumart.com	Fuji Electric PXR3	Zastępuje wycofany sterownik temperatury PXV3
Nikon Diaphot TMD	Nikon Instruments		Mikroskop odwrócony, ok. 1980 r.
Binokularny mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ-10	Nikon Instruments		Inne mikroskopy stereoskopowe będą odpowiednie