Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Podsumowanie

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Streszczenie

Diagnostyka wirusowych przyczyn wielu chorób zakaźnych jest trudna ze względu na naturalną różnorodność sekwencji wirusów, a także ciągłe pojawianie się nowych patogenów wirusowych, takich jak koronawirus SARS i pandemiczny wirus grypy H1N1 z 2009 roku, których nie można wykryć tradycyjnymi metodami. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy i zwalidowaliśmy wcześniej uniwersalną platformę mikromacierzy wirusowej o nazwie Virochip, która umożliwia wykrywanie wszystkich znanych wirusów, a także nowych wariantów w oparciu o konserwowaną homologię sekwencji¹. Dzięki zastosowaniu Virochip zidentyfikowaliśmy pełne spektrum wirusów związanych z infekcjami dróg oddechowych, w tym przypadki niewyjaśnionych stanów krytycznych u pacjentów hospitalizowanych, z czułością równą lub wyższą niż w przypadku konwencjonalnych testów klinicznych^2-5. Virochip był również wykorzystywany do identyfikacji nowych wirusów, w tym koronawirusa SARS^6,7, nowej klady rinowirusów⁵, XMRV (retrowirusa powiązanego z rakiem prostaty)⁸, ptasiego bornawirusa (przyczyny choroby wyniszczającej u papug)⁹ oraz nowego kardjowirusa u dzieci z infekcjami dróg oddechowych i biegunką¹⁰. Obecna wersja Virochip została przeniesiona na platformę mikromacierzy Agilent i składa się z około 36 000 sond pochodzących z ponad 1 500 wirusów zarejestrowanych w bazie GenBank do grudnia 2009 roku. W niniejszej pracy prezentujemy kolejne etapy przetwarzania testu Virochip od początku do końca (całkowity czas realizacji około 24 godzin), w tym ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbki, amplifikację PCR z użyciem randomowych starterów, inkorporację barwników fluorescencyjnych, a także hybrydyzację na mikromacierzy, skanowanie i analizę.

Protokół

Kroki analizy Virochip obejmują (1) ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek klinicznych, (2) odwrotną transkrypcję ekstrahowanego RNA i 2^ndsynteza cDNA nici minus, (3) amplifikacja PCR cDNA z użyciem przypadkowych starterów, (3) inkorporacja barwnika fluorescencyjnego Cy3, (4) hybrydyzacja znakowanego materiału z mikroarray Virochip oraz (5) skanowanie i analiza (Rysunek 1). Poniższy protokół zademonstruje zastosowanie testu Virochip w próbce wymazu z nosa pobranej od dziecka z zespołem objawów przypominających grypę.

Sekwencje starterów

Starter A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N₉)-3'

Starter B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3'

1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

1. Ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek klinicznych należy przeprowadzić w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub wyższego, ponieważ próbki te są potencjalnie zakaźne.
2. Próbkę z wymazu z nosa transportuje się w medium do stabilizacji wirusów. Należy odpić 200 μL próbki do probówki mikrocentryfugowej Eppendorf o pojemności 1,5 mL.
3. Opcjonalnie: przepuścić próbkę przez filtr 0,22 μm (w celu oczyszczenia cząstek wirusowych)
4. Opcjonalnie: poddać próbkę obróbce wstępnej za pomocą DNAzy (aby zdegradować genomowe DNA gospodarza i oczyścić chroniony, enkapsydowany kwas nukleinowy wirusa), korzystając z zestawu Turbo DNAse (Ambion) zgodnie z instrukcjami producenta
5. Wyekstrahować próbkę za pomocą zestawu Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit lub Qiagen Ultrasens Virus Kit zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Odwrotna transkrypcja i 2^ndSynteza cDNA nici minus („Runda A”)

1. Dodać 1 µL 40 pmol / μDodaj 4 $\mu$L wyekstrahowanego RNA do startera L Primer A. Podgrzej do 65°C.°Inkubuj w temperaturze C przez 5 min w termocyklerze (np. GeneAmp PCR System 9700), a następnie pozostaw do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 min.
2. Dodaj 5 μL master mixu składającego się z 2 μBufor RT 5X, 1 μL 12,5 mM dNTP, 1 μ0,5 l wody μL 0,1 M DTT oraz 0,5 μL SSIII RT (Invitrogen). Inkubować w temperaturze 42°C przez 60 minut.
3. W programowalnym termocyklerze podgrzać do 94°C x 2 min (w celu przerwania reakcji odwrotnej transkrypcji), schłodzić do 10°C, wirowanie pulsacyjne, a następnie dodanie 5 μMieszanina L Sequenase składająca się z 1 μL 5X bufor do sekwenowania, 3,8 μL wody oraz 0,15 μL Sequenase (USB Corporation). Dla 2^nd synteza nici, zwiększanie temperatury od 10°37°C°C przez 8 min, podtrzymać przez 8 min, następnie podgrzać do 94°C x 2 min (w celu inaktywacji Sequenazy), a następnie schłodzić do 10°C°C (podtrzymać).
4. Opcjonalnie Próbkę cDNA można w tym momencie przechowywać w temperaturze -20°C.°C.

3. Amplifikacja PCR cDNA z zastosowaniem losowych starterów („Runda B”)

1. Do 45 μL master mixu składającego się z 5 μL buforu PCR 10X, 1 μL dNTP 12,5 mM, 1 μL primera B 100 pmol / μL, 1 μL KlenTaq LA (Sigma) oraz 37 μL wody dodać 5 uL próbki Rd A.
2. Przeprowadzić protokół PCR według następującego schematu: 94°C, 2 min →(25 cykli: 94°C, 30 s / 50°C, 45 s / 72°C, 1 min) → 72°C, 5 min → 10°C (przechowywanie)
3. Próbkę Rd B sprawdzić w żelu agarozowym 1,5% w warunkach elektroforezy. Powinien być widoczny rozmaz z zakresu około 200 - 1000 bp (Ryc. 2A)

4. Inkorporacja barwnika fluorescencyjnego Cy3

1. Opcjonalnie: inną próbkę można oznakować fluorescencyjnym barwnikiem Cy5 i poddać hybrydyzacji z tym samym mikroarrayem.
2. Aby włączyć aa-dNTP, należy dodać 5 uL próbki Rd B do 45 uL mieszaniny reakcyjnej (master mix) składającej się z 5 uL buforu PCR 10X, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP(Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL startera B, 1,1 uL KlenTaq LA (Sigma) oraz 37 uL wody. Przeprowadzić protokół PCR zgodnie z następującymi parametrami: 94°C, 2 min →(15 cykli: 94°C, 30 s / 50°C, 45 s / 72°C, 1 min) → 72°C, 5 min → 10°C (przechowywanie)
3. Oczyścić próbkę Rd C za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) zgodnie z instrukcją producenta. Eluować w 10 μL.
4. Do próbki Rd C dodać 1 uL 1M wodorowęglanu (Sigma) oraz 1 uL Cy5 (GE Healthcare).
5. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności.
6. Oczyścić próbkę oznakowaną Cy3 za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) zgodnie z instrukcją producenta. Eluować w 12 μL.

5. Hybrydyzacja z mikroarray Virochip

1. Opcjonalnie: użyć 1,5 μL do sprawdzenia stężenia cDNA oraz ilości wbudowanego barwnika za pomocą spektrofotometru Nanodrop (w celu normalizacji próbek)
2. Do probówki z pasków PCR dodać 1 μL buforu do fragmentacji 25X, 5 μL buforu blokującego 5X, 9,5 μL (lub odpowiednią ilość do normalizacji) próbki znakowanej Cy3 oraz wodę do uzyskania całkowitej objętości 25 μL (Agilent)
3. Dodać 25 μL buforu do hybrydyzacji GEx 2X (Agilent). Krótko odwirować, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
4. Nanieść 40 μL próbki na uszczelkę szkiełka (gasket slide).
5. Umieścić macierz Virochip wydrukowaną przez Agilent (University of California, San Francisco / Agilent) (stroną z napisem „Agilent” skierowaną w dół) na uszczelce szkiełka i mocno dokręcić śrubę.
6. Hybrydyzować przez noc w inkubatorze w temperaturze 65°C, przy ustawieniu prędkości obrotowej 10 rpm.
7. Aby wyprać macierze, podgrzać bufor 2 (Agilent) do 37°C. Rozdzielić zestaw uszczelka szkiełka / macierz pod wodą w buforze 1 (Agilent). Przemyć w buforze 1 przez 1 min. Przemyć w podgrzanym buforze 2 przez 1 min. Powoli wyjąć szkiełko z buforu 2, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza (użyć chusteczki Kimwipe do odsączenia nadmiaru wilgoci, unikając bezpośredniego dotykania aktywnej strony macierzy)
8. Umieścić szkiełko w uchwycie i włożyć do skanera macierzy.

6. Skanowanie i analiza Virochip

1. Skanuj macierz znakowaną Cy3 w rozdzielczości 5 μm lub 2 μm zgodnie ze standardowym protokołem skanowania urządzenia (Rycina 2B).
2. Analizuj mikrotablice Virochip poprzez inspekcję wizualną, analizę skupień lub za pomocą zautomatyzowanego programu analitycznego Virochip, E-Predict¹¹. Przy użyciu każdej z tych trzech metod wirus grypy jest łatwo wykrywalny w próbce wymazu z nosa (pobranej od dziecka z chorobą grypopodobną) (Rycina 2C)

7. Reprezentatywne wyniki:

Przy prawidłowym wykonaniu protokołu, po etapie Rd B na elektroforezie w żelu agarozowym powinien być widoczny rozmaz (Rycina 2A). Matryca Virochip na platformie Agilent będzie trudna do analizy wizualnej (Rycina 2B), jednak w przypadku obecności wirusa powinien on zostać łatwo zidentyfikowany poprzez inspekcję wizualną, analizę skupień i/lub E-Predict (Rycina 1C). Próbki można wzbogacić odmierzoną ilością kwasu nukleinowego z znanego wirusa (np. wirusa mozaiki tytoniu; bakteriofaga MS2), aby służyły jako kontrola pozytywna testu.

Rysunek 1. Schemat przetwarzania i analizy mikroarray Virochip.Kwasy nukleinowe wyekstrahowane z próbek klinicznych są poddawane amplifikacji losowej, znakowaniu barwnikami fluorescencyjnymi, a następnie hybrydyzacji z mikroarray Virochip. Mikroarray są skanowane z rozdzielczością 2 μm i analizowane przy użyciu różnych narzędzi obliczeniowych, w tym programu E-Predict.

Rycina 2. Etapy analizy Virochip. Po amplifikacji za pomocą losowej PCR, rozmycie o wielkości 200 - 1000 bp można zwizualizować za pomocą elektroforezy żelowej (A). (B) Przedstawiono trzy mikromacierze Virochip z 8 macierzy na jednej szkiełku przedmiotowym, z powiększeniem niewielkiego obszaru jednej mikromacierzy na wstawce w prawym dolnym rogu. (C) Zautomatyzowana analiza wirusowa mikromacierzy z wykorzystaniem programu E-Predict wykazująca obecność wirusa grypy A w próbce klinicznej. Wysoki wynik podobieństwa (s=0,55) odpowiada wartości p bliskiej zeru, co czyni tę prognozę niezwykle istotną.

Dyskusja

Protokół Virochip opisany w niniejszym opracowaniu jest złożony i wymaga skrupulatności oraz wysokich kwalifikacji technika badawczego. Kluczowe znaczenie mają poprawne stężenia odczynników oraz warunki przeprowadzania PCR, znakowania i hybrydyzacji. Protokół Virochip można łatwo zmodyfikować w celu analizy tkanek chorobowych, stosując metodę ekstrakcji tkankowej, taką jak TRIzol (Invitrogen), do izolacji kwasów nukleinowych. Sondy można dodawać lub usuwać w zależności od potrzeb, aby uzyskać pożądane spektrum i zakres wykrywania; na przykład sondy do detekcji celów niewirusowych, takich jak bakterie i grzyby, mogą być projektowane i dodawane na bieżąco. Niektóre obecnie opracowywane zastosowania testu Virochip obejmują szerokospektrową diagnostykę wirusologiczną w laboratoriach klinicznych, badanie ognisk epidemicznych, kontrolę czystości leków i szczepionek oraz odkrywanie nowych patogenów wirusowych.