Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

19.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2536

⸱

27 kwietnia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Division of Infectious Diseases, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Streszczenie

Diagnostyka wirusowych przyczyn wielu chorób zakaźnych jest trudna ze względu na naturalną różnorodność sekwencji wirusów, a także ciągłe pojawianie się nowych patogenów wirusowych, takich jak koronawirus SARS i pandemiczny wirus grypy H1N1 z 2009 roku, których nie można wykryć tradycyjnymi metodami. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy i zwalidowaliśmy wcześniej uniwersalną platformę mikromacierzy wirusowej o nazwie Virochip, która umożliwia wykrywanie wszystkich znanych wirusów, a także nowych wariantów w oparciu o konserwowaną homologię sekwencji1. Dzięki zastosowaniu Virochip zidentyfikowaliśmy pełne spektrum wirusów związanych z infekcjami dróg oddechowych, w tym przypadki niewyjaśnionych stanów krytycznych u pacjentów hospitalizowanych, z czułością równą lub wyższą niż w przypadku konwencjonalnych testów klinicznych2-5. Virochip był również wykorzystywany do identyfikacji nowych wirusów, w tym koronawirusa SARS6,7, nowej klady rinowirusów5, XMRV (retrowirusa powiązanego z rakiem prostaty)8, ptasiego bornawirusa (przyczyny choroby wyniszczającej u papug)9 oraz nowego kardjowirusa u dzieci z infekcjami dróg oddechowych i biegunką10. Obecna wersja Virochip została przeniesiona na platformę mikromacierzy Agilent i składa się z około 36 000 sond pochodzących z ponad 1 500 wirusów zarejestrowanych w bazie GenBank do grudnia 2009 roku. W niniejszej pracy prezentujemy kolejne etapy przetwarzania testu Virochip od początku do końca (całkowity czas realizacji około 24 godzin), w tym ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbki, amplifikację PCR z użyciem randomowych starterów, inkorporację barwników fluorescencyjnych, a także hybrydyzację na mikromacierzy, skanowanie i analizę.

Protokół

Etapy badania Virochip obejmują (1) ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek klinicznych, (2) odwrotną transkrypcję wyekstrahowanego RNA oraz 2ndsynteza cDNA nici minus, (3) amplifikacja PCR cDNA z wykorzystaniem randomowych starterów, (3) wbudowanie barwnika fluorescencyjnego Cy3, (4) hybrydyzacja znakowanego materiału z mikromacierzą Virochip oraz (5) skanowanie i analiza (rycina 1). Poniższy protokół zademonstruje zastosowanie testu Virochip w próbce z wymazu z nosa dziecka z objawami infekcji grypopodobnej.

Sekwencje starterów

Starter A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3'

Starter B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3'

1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

  1. Ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek klinicznych należy przeprowadzać w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub wyższego, ponieważ próbki te mogą być zakaźne.
  2. Próbka z wymazu z nosa jest transportowana w medium transportowym do wirusów. Należy przenieść 20 μL próbki do probówki mikrocentryfugi Eppendorf o pojemności 1,5 mL.
  3. Opcjonalnie: przepuścić próbkę przez filtr 0,22 μm (w celu oczyszczenia cząstek wirusowych)
  4. Opcjonalnie: poddać próbkę wstępnej obróbce za pomocą DNazy (aby zdegradować genomowe DNA gospodarza i oczyścić chronione, zamknięte w kapsydach kwasy nukleinowe wirusa), wykorzystując zestaw Turbo DNAse (Ambion) zgodnie z instrukcją producenta
  5. Wyekstrahować kwas nukleinowy z próbki, używając zestawu Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit lub Qiagen Ultrasens Virus Kit zgodnie z instrukcją producenta.

2. Odwrotna transkrypcja i 2ndSynteza cDNA nici minus („Runda A”)

  1. Dodać 1 μl 40 pmol / μL Dodaj 4 µL wyekstrahowanego RNA do startera A. Podgrzej do 65°C przez 5 min w termocyklerze (np. GeneAmp PCR System 970), a następnie pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  2. Dodaj 5 μL mieszaniny master mix składającej się z 2 μL bufor RT 5X, 1 μL 12,5 mM dNTP, 1 μL woda 0.5 μL 0,1 M DTT oraz 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen). Inkubować w 42°C x 60 minut.
  3. W programowalnym termocyklerze podgrzać do 94°C x 2 min (aby przerwać reakcję odwrotnej transkrypcji), schłodzić do 10°C, wirówkę pulsacyjną, a następnie dodać 5 μL Mieszanina Sequenase składająca się z 1 μL bufor 5X Sequenase, 3.8 μL woda, i 0.15 μL Sequenase (USB Corporation). Dla 2nd synteza nici, zwiększanie wartości od 10°C Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 37°C przez ponad 8 min, utrzymać przez 8 min, a następnie podgrzać do 94°C x 2 min (aby dezaktywować Sequenazę) i schłodzić do 10°C (przytrzymać).
  4. Opcjonalnie Próbkę cDNA z reakcji odwrotnej transkrypcji (RdA) można w tym momencie przechowywać w temperaturze -20°C.

3. Amplifikacja PCR cDNA z wykorzystaniem losowych starterów („Runda B”)

  1. Dodaj 5 uL próbki Rd A do 45 μL mieszaniny master mix składającej się z 5 μL buforu PCR 10X, 1 μL dNTP 12,5 mM, 1 μL primera B 10 pmol / μL, 1 μL KlenTaq LA (Sigma) oraz 37 μL wody.
  2. Przeprowadź protokół PCR według następującego schematu: 94°C, 2 min →(25 cykli: 94°C, 30 s / 50°C, 45 s / 72°C, 1 min) →72°C, 5 min →10°C (przechowywanie)
  3. Sprawdź próbkę Rd B na żelu z agarozy 1,5% w elektroforezie. Powinien być widoczny rozmaz w zakresie około 200 - 10 bp (Rycina 2A)

4. Inkorporacja barwnika fluorescencyjnego Cy3

  1. Opcjonalnie: kolejną próbkę można znakować barwnikiem fluorescencyjnym Cy5 i hybrydyzować z tą samą macierzą mikrozespołową.
  2. Aby włączyć aa-dNTP, dodać 5 uL próbki Rd B do 45 uL mieszaniny master mix składającej się z 5 uL 10X buforu PCR, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 10 pmol / uL primera B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma) oraz 37 uL wody. Wykonać protokół PCR w następujący sposób: 94°C, 2 min → (15 cykli: 94°C, 30 s / 50°C, 45 s / 72°C, 1 min) → 72°C, 5 min → 10°C (przechowywanie)
  3. Oczyścić próbkę Rd C za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować w 10 μL.
  4. Do próbki Rd C dodać 1 uL 1M wodorowęglanu (Sigma) oraz 1 uL Cy5 (GE Healthcare).
  5. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności.
  6. Oczyścić próbkę znakowaną Cy3 za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować w 12 μL.

5. Hybrydyzacja z mikromacierzą Virochip

  1. Opcjonalnie: użyć 1,5 μL do sprawdzenia stężenia cDNA oraz ilości wbudowanego barwnika za pomocą spektrofotometru Nanodrop (w celu normalizacji próbek)
  2. Do probówki paskowej do PCR dodać 1 μL 25X buforu do fragmentacji, 5 μL 5X buforu blokującego, 9,5 μL (lub ilość niezbędną do normalizacji) próbki znakowanej Cy3 oraz wodę do uzyskania całkowitej objętości 25 μL (Agilent)
  3. Dodać 25 μL 2X buforu hybrydyzacyjnego GEx (Agilent). Krótko odwirować, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  4. Nanieść 40 μL próbki na uszczelkę szkiełka.
  5. Umieścić matrycę Virochip (University of California, San Francisco / Agilent) (stroną oznaczoną napisem „Agilent” skierowaną w dół) na uszczelce szkiełka i mocno dokręcić śrubę.
  6. Hybrydyzować przez noc w inkubatorze w temperaturze 65°C, przy ustawieniu prędkości obrotowej 10 rpm.
  7. Aby przemyć matryce, podgrzać bufor 2 (Agilent) do 37°C. Rozdzielić zestaw szkiełko/matryca pod wodą w buforze 1 (Agilent). Przemyć w buforze 1 przez 1 min. Przemyć w podgrzanym buforze 2 przez 1 min. Powoli wyjmować szkiełko z buforu 2, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza (użyć chusteczki typu kimwipe do odsączenia nadmiaru wilgoci, unikając bezpośredniego dotykania aktywnej strony matrycy)
  8. Umieścić szkiełko w uchwycie i włożyć do skanera matryc.

6. Skanowanie i analiza Virochip

  1. Zeskanuj macierz znakowaną Cy3 w rozdzielczości 5 μm lub 2 μm zgodnie ze standardowym protokołem skanowania instrumentu (Rysunek 2B).
  2. Przeanalizuj mikromacierze Virochip poprzez inspekcję wizualną, analizę skupień lub za pomocą zautomatyzowanego programu analitycznego Virochip, E-Predict1. Każdą z tych trzech metod pozwala na łatwe wykrycie wirusa grypy w próbce z wymazu z nosa (pobranej od dziecka z objawami grypopodobnymi) (Rysunek 2C)

7. Reprezentatywne wyniki:

Przy prawidłowym wykonaniu protokołu, po etapie Rd B, w elektroforezie na żelu agarozowym powinien być widoczny rozmaz (Rysunek 2A). Analiza wizualna mikroarray Virochip na platformie Agilent będzie trudna (Rysunek 2B), ale w przypadku obecności wirusa powinien on zostać łatwo zidentyfikowany poprzez inspekcję wizualną, analizę klastrową i/lub E-Predict (Rysunek 1C). Próbki można wzbogacić zmierzoną ilością kwasu nukleinowego znanego wirusa (np. wirusa mozaiki tytoniu; bakteriofaga MS2), aby służyły one jako kontrola dodatnia w badaniu.

Ekstrakcja kwasów nukleinowych, amplifikacja PCR, skanowanie mikromacierzy oraz analiza w celu detekcji.
Rycina 1. Schemat przetwarzania i analizy mikroarray Virochip. Kwasy nukeinowe wyekstrahowane z próbek klinicznych są poddawane losowej amplifikacji, znakowane barwnikami fluorescencyjnymi, a następnie hybrydyzowane z mikromacierzą Virochip. Mikromacierze są skanowane przy 2 μm rozdzielono i przeanalizowano przy użyciu różnych narzędzi obliczeniowych, w tym E-Predict.

wynik elektroforezy DNA, analiza mikroarray, wykres porównawczy ekspresji genów wirusowych
Rycina 2. Etapy analizy Virochip. Po amplifikacji za pomocą losowej reakcji PCR, rozmaz o wielkości 20–100 bp można zwizualizować za pomocą elektroforezy żelowej (A). (B) Przedstawiono trzy macierze Virochip z 8 macierzy / szkiełek przedmiotowych, przy czym niewielki fragment jednej macierzy został powiększony na wstawce w prawym dolnym rogu. (C) Zautomatyzowana analiza wirusowa za pomocą mikromacierzy z wykorzystaniem systemu E-Predict wykazująca obecność wirusa grypy A w próbce klinicznej. Wysoki wynik podobieństwa (s=0,5) odpowiada wartości p bliskiej zeru, co czyni tę predykcję niezwykle istotną.

Dyskusja

Protokół Virochip opisany w niniejszym opracowaniu jest złożony i wymaga skrupulatności oraz wysokich kwalifikacji technika badawczego. Kluczowe znaczenie mają poprawne stężenia odczynników oraz warunki przeprowadzania PCR, znakowania i hybrydyzacji. Protokół Virochip można łatwo zmodyfikować w celu analizy tkanek chorobowych, stosując metodę ekstrakcji tkankowej, taką jak TRIzol (Invitrogen), do izolacji kwasów nukleinowych. Sondy można dodawać lub usuwać w zależności od potrzeb, aby uzyskać pożądane spektrum i zakres wykrywania; na przykład sondy do detekcji celów niewirusowych, takich jak bakterie i grzyby, mogą być projektowane i dodawane na bieżąco. Niektóre obecnie opracowywane zastosowania testu Virochip obejmują szerokospektrową diagnostykę wirusologiczną w laboratoriach klinicznych, badanie ognisk epidemicznych, kontrolę czystości leków i szczepionek oraz odkrywanie nowych patogenów wirusowych.

Oświadczenia

Brak declared konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Davidowi Wangowi, Anatoly'emu Urismanowi, Amy Kistler, Kaelowi Fischerowi, Patrickowi Tangowi oraz Alexanderowi Greningerowi za początkowe opracowanie i optymalizację protokołu Virochip. Praca ta jest wspierana przez grant NIH K08 i Abbott Discovery Award (dla CC) oraz Howard Hughes Medical Institute (dla JLD).

Bibliografia

  1. Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
  2. Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
  3. Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
  4. Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
  5. Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
  6. Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
  7. Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
  8. Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
  9. Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
  10. Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
  11. Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie patogenów wirusowychmikrotablica Virochipekstrakcja kwasów nukleinowychPCR z zastosowaniem randomowych starterówznakowanie barwnikami fluorescencyjnymihybrydyzacja mikrotablicyskaner Agilentanaliza próbek klinicznychnadzór szerokospektralnyodkrywanie nowych wirusów
Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.