Wykorzystanie testu mikromacierzy panwirusowej (Virochip) do badań przesiewowych próbek klinicznych pod kątem patogenów wirusowych

Summary

Virochip to mikromacierz pan-wirusowa zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, jak również nowych wirusów na podstawie zachowawczej homologii sekwencji. Tutaj pokazujemy, jak uruchomić test Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności zarówno znanych, jak i nieznanych wirusów.

Abstract

Diagnoza wirusowych przyczyn wielu chorób zakaźnych jest trudna ze względu na różnorodność sekwencji wirusów, jak również ciągłe pojawianie się nowych patogenów wirusowych, takich jak koronawirus SARS i wirus grypy H1N1 z 2009 roku, które nie są wykrywalne tradycyjnymi metodami. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy i przeprowadziliśmy walidację platformy mikromacierzy panwirusowych o nazwie Virochip, która jest w stanie wykrywać wszystkie znane wirusy, a także nowe warianty na podstawie zachowawczej homologii sekwencji¹. Korzystając z Virochipa, zidentyfikowaliśmy pełne spektrum wirusów związanych z infekcjami dróg oddechowych, w tym przypadki niewyjaśnionych krytycznych chorób u hospitalizowanych pacjentów, z czułością równą lub wyższą niż konwencjonalne testy kliniczne^2-5. Virochip został również wykorzystany do identyfikacji nowych wirusów, w tym koronawirusa SARS^6,7, nowego kladu rinowirusów⁵, XMRV (retrowirus związany z rakiem prostaty)⁸, bornawirusa ptaków (przyczyna wyniszczającej choroby u papug)⁹ oraz nowego kardiowirusa u dzieci z chorobami układu oddechowego i biegunką¹⁰. Obecna wersja Virochipa została przeniesiona na platformę mikromacierzy Agilent i składa się z ~36 000 sond pochodzących z ponad ~1500 wirusów w GenBank od grudnia 2009 roku. Tutaj pokazujemy etapy związane z przetwarzaniem testu Virochip od początku do końca (czas realizacji ~ 24 godziny), w tym ekstrakcję kwasów nukleinowych próbki, amplifikację PCR przy użyciu losowych starterów, wprowadzanie barwnika fluorescencyjnego oraz hybrydyzację, skanowanie i analizę mikromacierzy.

Protocol

Etapy testu Virochip obejmują (1) ekstrakcję kwasu nukleinowego z próbek klinicznych, (2) odwrotną transkrypcję wyekstrahowanego RNA i syntezę^2-nici cDNA, (3) amplifikację PCR losowo zagruntowanego cDNA, (3) włączenie barwnika fluorescencyjnego Cy3, (4) hybrydyzację znakowanego materiału do mikromacierzy Virochip, oraz (5) skanowanie i analizę (Rysunek 1). Poniższy protokół zademonstruje zastosowanie testu Virochip na próbce wymazu z nosa od dziecka z chorobą grypopodobną.

Sekwencje starterów

Podkład A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N₉)-3'

Podkład B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3'

1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych z próbek klinicznych powinna być przeprowadzana w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub wyższego, ponieważ próbki te są potencjalnie zakaźne.
2. Próbka wymazu z nosa jest transportowana w podłożu wirusowym. Porcjować 200 μl próbki do probówki mikrowirówkowej Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
3. Opcjonalnie: przepuść próbkę przez filtr 0,22 μm (w celu oczyszczenia z cząstek wirusa)
4. Opcjonalnie: wstępna obróbka próbki za pomocą DNAzy (w celu degradacji genomowego DNA gospodarza i oczyszczenia do chronionego, zamkniętego w kapsułkach wirusowego kwasu nukleinowego) przy użyciu zestawu Turbo DNAse (Ambion) zgodnie z instrukcjami producenta
5. Wyodrębnij próbkę za pomocą zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA Zymo ZR lub zestawu do ekstrakcji wirusa Qiagen Ultrasens zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Odwrotna transkrypcja i synteza 2^nici CDNA ("Runda A")

1. Dodaj 1 μl 40 pmol / μl Primer A do 4 μl wyekstrahowanego RNA. Podgrzewać do 65°C przez 5 minut w termocyklerze (np. GeneAmp PCR System 9700), a następnie ostudzić w temperaturze pokojowej x 5 min.
2. Dodać 5 μl mieszanki wzorcowej składającej się z 2 μl buforu 5X RT, 1 μl 12,5 mM dNTP, 1 μl wody, 0,5 μl 0,1 M DTT i 0,5 μL SSIII RT (Invitrogen). Inkubować w temperaturze 42°C x 60 minut.
3. W programowalnym termocyklerze podgrzej do 94°C x 2 min (aby przerwać reakcję odwrotnej transkryptazy), schłodzić do 10°C, wirować pulsacyjnie, a następnie dodaj 5 μl mieszanki sekwenazy składającej się z 1 μl buforu 5X Sequenazae, 3,8 μl wody i 0,15 μl sekwenazy (USB Corporation). W przypadku syntezy 2. nici zwiększ temperaturę od 10°C do 37°C w ciągu 8 minut, przytrzymaj 8 minut, następnie podgrzej do 94°C x 2 min (aby dezaktywować sekwenazę) i schładzaj do 10°C (podtrzymaj).
4. Opcjonalnie: Próbka cDNA Rd A może być przechowywana w tym momencie w temperaturze -20°C.

3. Amplifikacja PCR losowo zagruntowanego CDNA ("Runda B")

1. Dodać 5 μl próbki Rd A do 45 μl mieszanki głównej składającej się z 5 μl buforu 10X PCR, 1 μL 12,5 mM dNTP, 1 μL 100 pmol / μL startera B, 1 μL KlenTaq LA (Sigma) i 37 μL wody.
2. Uruchom protokół PCR w następujący sposób: 94°C, 2 min →(25 cykli 94°C, 30 s / 50°C, 45 s / 72°C, 1 min) →72°C, 5 min →10°C (zatrzymanie)
3. Sprawdź próbkę Rd B na 1,5% żelu do elektroforezy agarozowej. Należy uwidocznić rozmaz od około 200 - 1000 pz (ryc. 2A)

4. Włączenie barwnika fluorescencyjnego Cy3

1. Opcjonalnie: inna próbka może być znakowana barwnikiem fluorescencyjnym Cy5 i hybrydyzowana do tej samej mikromacierzy.
2. Aby włączyć aa-dNTP, dodaj 5 μl próbki Rd B do 45 μl mieszanki głównej składającej się z 5 μl buforu 10X PCR, 1 μl 12.5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 μl 100 pmol / uL startera B, 1, 1 μl KlenTaq LA (Sigma) i 37 μl wody. Uruchom protokół PCR w następujący sposób: 94°C, 2 min →(15cykli 94°C, 30 s / 50°C, 45 s / 72°C, 1 min) →72°C, 5 min →10°C (zatrzymanie)
3. Wyczyść próbkę Rd C za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrator-5 (Zymo Research) zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować w 10 μl.
4. Dodać 1 μl 1M wodorowęglanu (Sigma) i 1 μl Cy5 (GE Healthcare) do próbki Rd C.
5. Inkubuj x 1 godzinę w ciemności.
6. Wyczyść próbkę znakowaną Cy3 za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować w 12 μl.

5. Hybrydyzacja do mikromacierzy Virochip

1. Opcjonalnie: użyj 1,5 μl do sprawdzenia stężenia cDNA i ilości barwnika zawartego w spektrofotometrze Nanodrop (do normalizacji próbek)
2. W probówce z paskiem do PCR dodać 1 μl 25-krotnego buforu rozdrobniowego, 5 μl 5-krotnego buforu blokującego, 9,5 μl (lub ilość do normalizacji) próbki znakowanej Cy3 i wodę do całkowitej objętości 25 μl (Agilent)
3. Dodać 25 μl buforu hybrydyzacyjnego 2X GEx (Agilent). Krótko przykręć, aby usunąć bąbelki.
4. Załadować 40 μl próbki na szkiełko uszczelki.
5. Umieść drukowaną przez Agilent tablicę Virochip (University of California, San Francisco / Agilent) (strona oznaczona "Agilent" na dole) na górze suwaka uszczelki i mocno dokręć.
6. Hybrydyzować przez noc w piekarniku o temperaturze 65°C, prędkość ustawiona na 10 obr./min.
7. Aby umyć matryce, podgrzej bufor 2 (Agilent) do 37°C. Rozebrać prowadnicę uszczelki / kanapkę z matrycą pod wodą w buforze 1 (Agilent). Myć w buforze 1 x 1 min. Myć w podgrzanym buforze 2 x 1 min. Powoli wyjmij szkiełko z bufora 2, uważając, aby uniknąć pęcherzyków (użyj chusteczek, aby odprowadzić nadmiar wilgoci, uważając, aby nie dotykać bezpośrednio aktywnej strony tablicy)
8. Umieść szkiełko w uchwycie na szkiełka i włóż do skanera matrycowego.

6. Skanowanie i analiza Virochip

1. Zeskanuj matrycę znakowaną Cy3 z prędkością 5 μm lub 2 μm zgodnie ze standardowym protokołem skanowania urządzenia (rysunek 2B).
2. Analizuj mikromacierze Virochip za pomocą oględzin, analizy skupień lub zautomatyzowanego programu do analizy Virochip, E-Predict¹¹. Za pomocą każdej z tych trzech metod wirus grypy jest łatwo wykrywany w próbce wymazu z nosa (od dziecka z chorobą grypopodobną) (ryc. 2C)

7. Reprezentatywne wyniki:

Gdy protokół zostanie wykonany poprawnie, powinien być widoczny rozmaz na elektroforezie w żelu agarozowym po kroku Rd B (Rysunek 2A). Mikromacierz Virochip na platformie Agilent będzie trudna do wizualnej analizy (rysunek 2B), ale jeśli wirus jest obecny, powinien być łatwo zidentyfikowany przez oględziny, analizę skupień i/lub E-Predict (rysunek 1C). Próbki mogą być wzbogacane odmierzonymi ilościami kwasu nukleinowego ze znanego wirusa (np. wirusa mozaiki tytoniu; MS2 bakteriofag), aby służyć jako kontrola pozytywna dla testu.

Rysunek 1. Schemat przetwarzania i analizy mikromacierzy Virochip. Wyekstrahowany kwas nukleinowy z próbek klinicznych jest losowo amplifikowany, znakowany barwnikami fluorescencyjnymi i hybrydyzowany z mikromacierzą Virochip. Mikromacierze są skanowane w rozdzielczości 2 μm i analizowane przy użyciu różnych narzędzi obliczeniowych, w tym E-Predict.

Rysunek 2. Etapy testu Virochip. Po amplifikacji metodą losowego PCR rozmaz o stężeniu 200 - 1000 pz można uwidocznić za pomocą elektroforezy żelowej (A). (B) Pokazane są trzy mikromacierze Virochip z 8 tablic / szklany szkiełko, z małym obszarem jednej mikromacierzy powiększonym we wstawce w prawym dolnym rogu. (C) Zautomatyzowana analiza wirusowa mikromacierzy przy użyciu E-Predict ujawniająca obecność wirusa grypy A w próbce klinicznej. Wysoki wynik podobieństwa (s = 0,55) odpowiada wartości p, która jest bliska zeru, co czyni ją niezwykle istotną prognozą.

Discussion

Opisany tutaj protokół Virochip jest złożony i wymaga skrupulatnego i wykwalifikowanego technika badawczego. Prawidłowe stężenia odczynników i warunki do PCR, znakowania i hybrydyzacji mają kluczowe znaczenie. Protokół Virochip można łatwo zmodyfikować, aby dostosować go do analizy chorych tkanek przy użyciu metody ekstrakcji tkanek, takiej jak TRIzol (Invitrogen) do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Sondy można dodawać lub usuwać w razie potrzeby, aby uzyskać pożądane spektrum i zakres pokrycia; Na przykład sondy do wykrywania celów niewirusowych, takich jak bakterie i grzyby, mogą być projektowane i dodawane "w locie". Niektóre zastosowania testu Virochip, który jest obecnie opracowywany, obejmują diagnostykę wirusów o szerokim spektrum w laboratorium klinicznym, badanie epidemii, badania przesiewowe czystości leków i szczepionek oraz odkrywanie nowych patogenów wirusowych.