Opisano metodę badania integracji nowo powstałych komórek ziarnistych zakrętu zębatego u dorosłych zwierząt. Technika ta wykorzystuje zmodyfikowanego retrowirusa do znakowania nowych neuronów, a następnie rejestrację elektrofizjologiczną w celu określenia funkcjonalnej integracji in vivo.
Artykuł metodologiczny
Badanie integracji neuronów powstałych w wieku dorosłym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurogeneza zachodzi w mózgach dorosłych ssaków w strefie podkomorowej (SVZ) komory bocznej oraz w strefie podziarnistej (SGZ) zakrętu zębatego hipokampa przez całe życie. Wcześniejsze doniesienia wykazały, że neurogeneza hipokampa u dorosłych jest powiązana z różnymi zaburzeniami mózgu, w tym z epilepsją, schizofrenią, depresją i lękiem (1). Zrozumienie procesu prawidłowej i aberracyjnej integracji neuronów powstałych w dorosłości może rzucić światło na etiologię tych chorób i pomóc w opracowaniu nowych terapii.
Neurogeneza w SGZ u dorosłych odzwierciedla embrionalny i ponatalny rozwój neuronów, obejmując etapy specyfikacji losu, migracji, integracji synaptycznej i dojrzewania. Jednak pełna integracja następuje w przedłużonym, 6-tygodniowym okresie. Początkowe wejście synaptyczne do nowo powstałych w dorosłości komórek ziarnistych zakrętu zębatego (DGCs) w SGZ ma charakter GABAergiczny, po czym w 14. dniu pojawia się wejście glutaminergiczne (2). Specyficzne czynniki regulujące tworzenie obwodów neuronów powstałych w okresie dorosłym w zakręcie zębatym są obecnie nieznane.
W naszym laboratorium stosujemy deficyjny w replikację wektor retrowirusowy oparty na wirusie białaczki mysiej Moloney do dostarczania białek fluorescencyjnych i hipotetycznych genów regulacyjnych do tych proliferujących komórek. Ta technika wirusowa zapewnia wysoką swoistość i rozdzielczość w analizie daty powstania komórek, ich linii, morfologii oraz synaptogenezy.
W typowym eksperymencie często wykorzystuje się dwa lub trzy wirusy zawierające unikalne znaczniki, transgeny i elementy promotorowe do analizy pojedynczych komórek w określonym procesie rozwojowym in vivo. Poniższy protokół opisuje metodę analizy funkcjonalnej integracji noworodkowych neuronów z wykorzystaniem pojedynczego retrowirusa z zielonym (GFP) lub czerwonym (dTomato) białkiem fluorescencyjnym oraz elektrofizjologii techniki patch-clamp.
Protokół
1. Iniekcja wirusa
Wysokimtrowe zmodyfikowane retrowirusy (1×109 unit/ml) otrzymuje się poprzez kotransfekcję wektorów retrowirusowych i VSVG do komórek HEK293T, a następnie poprzez ultrawirowanie supernatantu wirusowego. W kwestii źródeł i metod produkcji należy zapoznać się z doskonałą demonstracją JoVE (3).
Uwaga: Młode dorosłe (4-6 tygodniowe) samice myszy C57Bl/6 (Charles River) są utrzymywane w standardowych warunkach. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi National Research Council dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC Uniwersytetu Stony Brook.
- Rozmrozić na lodzie 2 µl zamrożonego retrowirusa na każde zwierzę.
- Zpodaj znieczulenie (100 μg ketamina + 10 μg ksylazyny na gram masy ciała) i unieruchom zwierzę w aparacie stereotaksycznym (Steolting). Usuń włosy z głowy i przemyj skórę 70% etanolem.
- odsłonić czaszkę i wywiercić cztery płytkie otwory za pomocą wiertarki stomatologicznej (wiertło 0,6 mm) w następujących współrzędnych:
- przednio-tylny = -2 mm od bregmy; boczny = ±1,6 mm; brzuszny = 2,5 mm; przednio-tylny = -3 mm od bregmy; boczny = ±2,6 mm; brzuszny = 3,2 mm.
- przednio-tylny = -2 mm od bregma; boczny = ±1,6 mm; brzuszny = 2,5 mm; przednio-tylny = -3 mm od bregma; boczny = ±2,6 mm; brzuszny = 3,2 mm.
- Zamocuj 1μl strzykawka Hamiltona z płaskim końcem i aplikacja 0.5 μl retrowirusa na miejsce z szybkością 0.25 μl/min do zakrętu zębatego. (Głębokość brzuszna – patrz współrzędne powyżej). Po każdym wstrzyknięciu odczekać 2 minuty przed powolnym wycofaniem strzykawki, aby zapobiec cofaniu się płynu. Między wstrzyknięciami krótko przemyć zewnętrzną powierzchnię końcówki strzykawki sterylnym PBS za pomocą aplikatora, aby usunąć ślady krwi.
- Zamknąć ranę za pomocą sterylny materiał do szwów chirurgicznych (typ P-1; rozmiar 6-0) i należy umieścić zwierzę z powrotem w standardowych warunkach hodowlanych do czasu osiągnięcia pożądanych etapów czasowych po wstrzyknięciu.
2. Przygotowanie skrawków
Aby uzyskać wysokiej jakości skrawki ostre od dorosłych myszy, stosujemy zmodyfikowany roztwór do cięcia w celu przygotowania skrawków (patrz poniżej).
- Schłodzić roztwór do cięcia do temperatury 0-4 °C na lodzie i napowietrzać mieszaniną 95% O2-5% CO2 przez co najmniej 30 minut.
- Zanestetyzować zwierzę i przeprowadzić perfuzję transkardialną przy użyciu lodowatego, nasyconego tlenem roztworu do cięcia.
- Szybko wyjąć mózg i umieścić go w szalce Petriego z papierem filtrującym uprzednio zwilżonym zimnym, natlenionym roztworem do cięcia. Odciąć móżdżek i wyciąć powierzchnię montażową co najmniej 1mm przed (widocznymi) współrzędnymi miejsca iniekcji. Przykleić mózg do stolika wibrotomu i zamontować go w komorze do cięcia wypełnionej zimnym i natlenionym roztworem do cięcia.
- Przygotować skrawki w płaszczyźnie coronalnej lub horyzontalnej (300-350μm) i przenieść je pipetą o dużym prześwicie do komory inkubacyjnej zawierającej ACSF w temperaturze pokojowej, napowietrzany mieszaniną 95% O2/5% CO2.
- Inkubować skrawki przy ciągłym napowietrzaniu w temperaturze 32°C przez 30-60 minut. Na czas rejestracji przywrócić w komorze temperaturę pokojową.
3. Eksperymenty elektrofizjologiczne
- Próbki przekłada się do komory rejestracyjnej, która jest stale perfundowana nasyconym tlenem ACSF w temperaturze 32°C - 34°C.
- Bipolarną wolframową elektrodę stymulującą umieszcza się w warstwie molekularnej zakrętu zębatego, korzystając z obiektywu mikroskopu o niskim powiększeniu (10X).
- Nowo powstałe DGC w strefie podziarnistej/warstwie komórek ziarnistych identyfikuje się na podstawie ekspresji GFP lub dTomato. Rejestrację metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell przeprowadza się na nowo powstałych neuronach przy dużym powiększeniu (40X).
- Właściwości wyładowcze rejestrowanych komórek uzyskuje się poprzez wstrzykiwanie serii prądów w trybie current-clamp.
- Impulsy elektryczne są dostarczane przez elektrodę stymulującą za pomocą izolatora stymulacji sterowanego przez oprogramowanie rejestrujące, a następnie rejestruje się wywołane prądy postsynaptyczne w nowo powstałych DGC.
4. Analiza danych
Amplitudy wywołanych odpowiedzi postsynaptycznych analizuje się na różnych etapach rozwoju neuronów powstałych w wieku dorosłym.
5. Reprezentatywne wyniki
Stosując powyższy protokół, powszechnie uzyskuje się ekspresję GFP w nowo powstałych neuronach zakrętu zębatego, podobną do tej przedstawionej na Rysunku 1. Należy zauważyć, że nowo powstałe neurony są łatwo wizualizowane, a zarówno dendryty, jak i aksony są wyraźnie oznakowane. Ekspresja w cienkich aksonach GDC i małych kolcach dendrytycznych zależy od jakości i miana wirusa, zastosowanego promotora oraz czasu ekspresji in vivo. W naszych badaniach nowo powstałe komórki i organella subkomórkowe są zazwyczaj widoczne w ciągu kilku dni po wtryśnięciu, a ekspresję w kolcach można śledzić od najwcześniejszych etapów rozwoju. Rejestracje whole-cell z nowo powstałych neuronów na różnych etapach czasowych umożliwiają badanie unikalnych właściwości tych komórek, np. potencjałów czynnościowych (Rysunek 2a), a także procesu integracji synaptycznej z istniejącymi obwodami neuronalnymi podczas dojrzewania (Rysunek 2b).
Rycina 1 Obraz konfokalny dwufotonowy noworodkowych neuronów w poziomym przekroju zakrętu zębatego dorosłej myszy. Zielone komórki to noworodkowe DGCs w 21dpi (dni po wtryskaniu), wykazujące ekspresję GFP, znakowane retrowirusem pUX-GFP.
Rycina 2 a) Właściwości generowania potencjałów czynnościowych w noworodkowym DGC w 21 dpi. b) reprezentatywne wywołane pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSCs) zarejestrowane w noworodkowym DGC w 21 dpi.
Dyskusja
Ciągła neurogeneza w hipokampie mózgów dorosłych ssaków stanowi unikalny eksperymentalny model badawczy do analizy rozwoju i integracji neuronów w dojrzałym mózgu. Przedstawiony tutaj protokół łączy znakowanie retrowirusowe z metodami elektrofizjologicznymi w celu zbadania integracji nowo powstałych neuronów ziarnistych zakrętu zębatego w mózgach dorosłych myszy.
Aby zapewnić sukces przeprowadzanych eksperymentów, zalecamy stosowanie się do poniższych wskazówek podczas krytycznych etapów procedury:
Aby uniknąć niepożądanych infekcji i stanów zapalnych, wszystkie narzędzia należy wysterylizować (poprzez autoklawowanie, użycie dowolnego rodzaju sterylizatora lub 70% etanolu) przed operacją. Przed wstrzyknięciem należy przemyć końcówkę igły strzykawki sterylnym PBS.
W przypadku iniekcji wirusa zwierzęta muszą być stabilnie zamocowane w urządzeniu stereotaksycznym, a źródła niepotrzebnych ruchów podczas wstrzykiwania należy zminimalizować. Należy upewnić się, że głowa jest dobrze i stabilnie unieruchomiona, oraz wyregulować pozycję nosa myszy tak, aby bregma i lambda znajdowały się na jednym poziomie przed obliczeniem współrzędnych iniekcji. Wirus należy pobrać do strzykawki szybko, aby zminimalizować ekspozycję na temperaturę pokojową – retrowirusy są szczególnie wrażliwe na temperaturę. Wirus należy wstrzykiwać powoli z zalecaną prędkością, aby zminimalizować uszkodzenia ciśnieniowe. Zastosowanie zalecanej strzykawki z płaską końcówką (w przeciwieństwie do powszechnych końcówek ściętych) zapewni równomiernie rozłożony obszar infekcji zakrętu zębatego.
Przed przygotowaniem skrawków, roztwór do cięcia oraz inkubujący ACSF muszą być napowietrzane mieszaniną 95% O2-5% CO2 przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić nasycenie roztworów tlenem. Aby uzyskać najlepszą jakość skrawków, zwierzęta powinny zostać poddane szybkiej perfuzji, a tkanka powinna być utrzymywana w zimnym, nasyconym tlenem roztworze.
W celu rejestracji stopniowo zwiększaj intensywność bodźca, aż do pojawienia się odpowiedzi postsynaptycznej. W razie potrzeby zmień położenie elektrody stymulującej w obrębie warstwy molekularnej zakrętu zębatego.
Podsumowując, zalecane podejście umożliwia badanie odrębnych właściwości i potencjalnych ról funkcjonalnych neuronów powstałych w życiu dorosłym podczas ich wczesnej integracji z aktywnymi, dojrzałymi obwodami neuronalnymi.
Oświadczenia
Brak deklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana przez NINDS oraz American Heart Association dla S.Ge. Metoda ta została pierwotnie opracowana i rozwinięta przez autora w laboratorium dr. Hongjuna Songa na Uniwersytecie Johns Hopkins. Pragniemy podziękować dr. Hongjunowi Songowi za jego wskazówki i wsparcie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
|
Bibliografia
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
Przedruki i uprawnienia
