Przygotowanie kolagenazy
- Odważyć kolagenazę do probówki stożkowej 50 ml i dodać bufor do izolacji, aby uzyskać stężenie końcowe wskazane w poniższej tabeli. Rozpuścić kolagenazę za pomocą vortexowania.
(12 myszy + 2 dodatkowe myszy = 14 myszy x 5 ml/mysz = 70 ml całkowitej objętości roztworu kolagenazy)
(70 ml x 0,5 mg/ml lub 0,3 mg/ml = 35 mg lub 21 mg całkowitej masy kolagenazy P)
Szczep Wiek Kolagenaza P (mg/ml) Czas (min) C3H, Balb/C, B6 > 12 tygodni 0,8 17 C3H, Balb/C, B6 <= 12 tygodni 0,5 13 NOD, NOR, NON > 12 tygodni 0,8 17 NOD, NOR, NON <= 12 tygodni 0,5 17 - Rozlać po 2 ml roztworu kolagenazy do każdej szklanej fiolki i umieścić na lodzie. Napełnić każdą strzykawkę 5 ml ilością 3 ml kolagenazy, założyć igłę 30g i umieścić na lodzie (przygotować w komorze z laminarnym przepływem powietrza).
Rozciąganie
- Bezpośrednio przed sekcją uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie stawów szyjnych. Spryskaj całe ciało 70% ETOH, aby było całkowicie mokre. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V, zaczynając od okolic narządów płciowych. Obróć mysz tak, aby ogon był skierowany w stronę przeciwną do badacza.
- Przesuń jelita na lewą stronę otwartego ciała myszy. Ujawni to trzustkę i wspólny przewód żółciowy.
- Załóż kleszczyk hemostatyczny po obu stronach jelita cienkiego w miejscu ujścia przewodu żółciowego, pozostawiając niewielką przestrzeń, przez którą roztwór kolagenazy może przedostać się do jelita.
- Wprowadź roztwór kolagenazy do trzustki poprzez przewód żółciowy, zaczynając od pęcherzyka żółciowego, używając igły 30g i strzykawki 5 ml zawierającej 3 ml zimnego roztworu kolagenazy.
- Wyjmij trzustkę z organizmu i umieść ją w silikonizowanej probówce zawierającej 2 ml roztworu kolagenazy. Krok ten należy wykonać SZYBKO i jak najdokładniej, minimalizując zebranie tkanki tłuszczowej i łącznej.
- Umieść probówkę w lodzie i powtórz krok 3 z kolejną myszą.
Trawienie
- Szczelnie zamknąć każdą fiolkę i umieścić ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Inkubować przez 13-17 minut (czas zależy od szczepu i wieku zwierzęcia).
- Po upływie tego czasu energicznie wstrząsnąć fiolką. Trzustka powinna się rozpaść.
- Przelać każdy digest przez duże sterylne sito do sterylnego zlewka o pojemności 1000 ml i energicznie wypłukać zawartość sita za pomocą buforu piorącego. Przenieść digesty do stożkowych probówek 50 ml (3 trzustki/probówka 50 ml: jeśli n=12, użyć wystarczającej ilości buforu piorącego, aby objętość końcowa wyniosła 200 ml, i rozdzielić ją do 4 probówek 50 ml). Rozcieńczanie należy przeprowadzić szybko i na lodzie, aby uniknąć niepożądanego trawienia wysepek.
- Wirowanie: Uruchomić wirówkę. Po osiągnięciu prędkości 1300 rpm wyłączyć urządzenie.
- Odssać nadosad, pozostawiając ok. 5 mL. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie odessać osadu.
- Resuspendować osad, energicznie opukując probówkę ręką, a następnie dodać 50 ml buforu piorącego.
- Wirowanie: Uruchomić wirówkę. Po osiągnięciu prędkości 1300 rpm wyłączyć urządzenie.
- Resuspendować osad i przemyć 5 ml buforu piorącego.
- Przenieść 5 ml do probówki stożkowej 15 ml i odwirować, jak opisano powyżej.
- Odssać nadosad tak całkowicie, jak to możliwe. (Pozostały bufor może spowodować zmianę gęstości Ficollu).
Ficoll
Należy działać szybko. Długotrwała ekspozycja na Ficoll jest TOKSYCZNA dla wysepek.
- Przed dodaniem ficollu należy upewnić się, że osad jest całkowicie rozbity (tkanki nieobalne są trudne do resuspensji w ficollu).
- Resuspendować osad w 7 ml ficollu o gęstości 1.108, intensywnie mieszając w wortexie.
- Na wierzch każdej warstwy ficollu nanieść warstwowo po 2 ml pozostałych gęstości w następującej kolejności: 1.096, 1.069, a następnie 1.037.
- Wirować przez 15 minut przy 1800 rpm w temperaturze 4 stopni, z WYŁĄCZONĄ funkcją hamowania!
- Wyłowić wyspki z drugiej warstwy za pomocą spoidu (sterylnej plastikowej pipety kroplowej). Przenieść wszystkie zebrane próbki do probówki stożkowej 50 ml zawierającej ok. 25 mL zimnego buforu.
- Przemyć, jak opisano powyżej, 3 razy buforem do przemywania (powtarzając kroki 12-15).
- Resuspendować wyspki w 20 ml RPMI-1640 (zawierającego 10% FCS, penicylinę i streptomycynę, HEPES oraz MEM-NEAA) i delikatnie wymieszać. Odlać 100 ul próbki do zliczenia.
- Przenieść 100 ul na płytkę z siatką (Grid-plate) 35 mm zawierającą 1 ml pożywki i 1 ml ditiizonu.
- Inkubować pozostałe wyspki w pożywce RPMI 1640 w inkubatorze w temperaturze 37°C i 7% CO2, w płytkach 160 mm z całkowitą objętością 30 ml pożywki na płytkę.
