Izolacja mysich wysp trzustkowych

Protokół

Przygotowanie kolagenazy

1. Odważyć kolagenazę do 50 ml stożkowego pojemnika i dodać bufor izolacyjny, aby uzyskać końcowe stężenie, jak wskazano w poniższej tabeli. Rozpuść kolagenazę przez wirowanie.
   
   
   (12 myszy + 2 dodatkowe myszy = 14 myszy x 5 ml/mysz = 70 ml całkowitego roztworu kolagenazy)
   
   
   (70 ml x 0,5 mg/ml lub 0,3 mg/ml = 35 mg lub 21 mg kolagenazy P ogółem)
   
   
   <. styl="rozmiar czcionki: 12px; border-bottom: #ddd 1px solidny; text-align: left">Strain

   Wiek	Collagenase P (mg/ml)	Czas (min)
   C3H, Balb/C, B6	> 12 tygodni	0.8	17
   C3H, Balb/C, B6	<= 12 tygodni	0.5	13
   SKINIENIE, ANI ANI NIE	> 12 tygodni	0.8	17
   SKINIENIE, ANI ANI NIE	<= 12 tygodni	0.5	17

   
   
   
2. Dozować 2 ml roztworu kolagenazy do każdej szklanej fiolki i umieścić na lodzie. Załaduj każdą strzykawkę o pojemności 5 ml 3 ml kolagenazy, dodaj 30 g igły i umieść w lodzie (przygotuj w kapturze).

Rozdęcie

1. Tuż przed sekcją należy złożyć zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj całe ciało 70% ETOH, sprawiając, że będzie całkowicie mokre. Wykonaj wszczepienie w kształcie litery V, zaczynając od okolicy narządów płciowych. Obróć mysz tak, aby ogon był skierowany od Ciebie.
2. Usuń jelito po lewej stronie otwartej myszy. Spowoduje to odsłonięcie trzustki i wspólnego przewodu żółciowego.
3. Umieść zacisk hemostatu po obu stronach jelita cienkiego, gdzie odprowadza się przewód żółciowy, pozostawiając małą kieszeń, w której roztwór kolagenazy może dostać się do jelita.
4. Napompować trzustkę przez przewód żółciowy za pomocą igły 30 g i strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej 3 ml zimnego roztworu kolagenazy, zaczynając od pęcherzyka żółciowego.
5. Usunąć trzustkę z organizmu i umieścić ją w silikonowanej fiolce zawierającej 2 ml roztworu kolagenazy. Ten krok należy wykonać SZYBKO i tak czysto, jak to możliwe, minimalizując gromadzenie się tłuszczu i tkanki łącznej.
6. Umieść fiolkę na lodzie i powtórz krok 3 z następną myszką.

Trawienie

1. Zamknąć każdą fiolkę i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Wysiaduj przez 13-17 minut (czas różni się w zależności od odmiany i wieku zwierzęcia).
2. Po upływie tego czasu energicznie wstrząsnąć fiolką. Trzustka powinna się rozpaść.
3. Przelać każdy płyn przez duże sterylne sitko do sterylnego zlewki o pojemności 1000 ml i na siłę odpipetować z sitka za pomocą buforu do mycia. Dozować trawione substancje do probówek stożkowych o pojemności 50 ml (3 probówki trzustkowe/50 ml: jeśli n=12, użyj wystarczającej ilości buforu do mycia, aby uzyskać końcową objętość 200 ml i dozuj go do probówek 4x50 ml). Rozcieńczanie powinno odbywać się szybko i na lodzie, aby uniknąć niepożądanego trawienia wysp trzustkowych.
4. Odwirowanie: Uruchom wirówkę. Gdy osiągnie 1300 obr./min, wyłącz go.
5. Odessać supernatant, pozostawiając ~5 ml. Bądź bardzo ostrożny, aby nie zassać granulki.
6. Zawiesić granulkę, energicznie stukając ręką, a następnie dodać 50 ml buforu do mycia.
7. Odwirowanie: Uruchom wirówkę. Gdy osiągnie 1300 obr./min, wyłącz go.
8. Zawiesić osad i przemyć 5 ml buforu do mycia.
9. Przenieść 5 ml do 15 ml stożkowego i odwirować, jak powyżej.
10. Odessać supernatant tak całkowicie, jak to możliwe. (Pozostały bufor może spowodować zmianę gęstości figli.)

Ficoll

Działaj szybko. Długotrwałe narażenie na Ficoll jest TOKSYCZNE dla wysp trzustkowych.

1. Upewnij się, że osad jest całkowicie rozdrobniony przed dodaniem fikolu (nieuszkodzona tkanka jest trudna do ponownego zamieszczenia w fikolu).
2. Zawiesić osad w 7 ml filolu o gęstości 1,108, energicznie wirując.
3. Na wierzch każdej gęstości fikolu ułóż po 2 ml każdej z pozostałych gęstości w następującej kolejności: 1,096, 1,069, a następnie 1,037.
4. Wiruj przez 15 minut z prędkością 1800 obr./min w 4 stopniach, z przerwą WYŁĄCZON!
5. Zbierz wysepki z drugiej warstwy za pomocą spoidu (sterylnego plastikowego zakraplacza). Przenieś wszystkie kolekcje do stożka o pojemności 50 ml zawierającego ~25 ml zimnego buforu.
6. Przemyć, jak wyżej, 3 razy buforem myjącym (powtarzając krok 12-15).
7. Ponownie zawiesić wyspy trzustkowe w 20 ml RPMI-1640 (zawierającym 10% FCS oraz penicylinę i streptomycynę, HEPES, MEM-NEAA) i delikatnie wymieszać. Usunąć 100 ul próbki do policzenia.
8. Przenieść 100 ul do 35 mm Płytka siatkowa zawierająca 1 ml pożywki i 1 ml ditizonu.
9. Pozostałe wysepki inkubować w RPMI 1640, w inkubatorze o temperaturze 37°C, 7% CO_{2 ,} na płytkach 160 mm z łącznie 30 ml pożywki/płytkę.
   
   

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik			ditizon	Rozpuść 5 mg ditizon w 5 ml DMSO w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 45 ml soli fizjologicznej i delikatnie wymieszać. Filtr ze strzykawką o pojemności 60 ml i filtrem strzykawkowym 0,22" m do nowej probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 OC, aż do zużycia. W razie potrzeby dodać 1 ml do każdej płytki liczącej 35 mm.
Bufor				PBS
buforu				HBSS
.	Bufor			HBSS zawierający 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glukozy, pH 7,4
Roztwór do przemywania	Bufor			izolacyjny zawierający 1mM CaCl2
Kolagenaza P		Boehringer Ingeheim	1213873
Narzędzia				Zacisk hemostatu (n = 2), Kleszcze (n = 2), Nożyczki (do nacinania skóry i do wyjmowania trzustki z sąsiednich tkanek)
Strzykawka				sterylna, 5 ml, 1 / mysz.
Igły				sterylne, 1/strzykawka
fiolki ze szkła silikonowanego z nasadką		Fisher Scientific	213-018-54	sterylne, 1/mysz
1000 ml Zlewka	sterylne
zakraplacz				sterylne
myszy	zwierzę