Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowany protokół kokultury ES / OP9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego

DOI:

10.3791/2559

⸱

7 czerwca 2011

 ,  , 
1Department of Medicine, Hematology-Oncology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki OP9 mStrawberry umożliwiają pełną ocenę wszystkich potomnych pochodzących z ES z kokultury.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diferencjacja komórek ES in vitro w kierunku linii krwiotwórczych jest przydatna przy badaniu populacji komórkowych, które są trudne do uzyskania in vivo, oraz w charakterystyce najwcześniejszych genów zaangażowanych w hematopoezę, bez konieczności mierzenia się z letalnością embrionalną. System kokultury ES/OP9 został pierwotnie zaprojektowany w celu wytworzenia potomstwa krwiotwórczego bez nadprodukcji makrofagów, ponieważ linia komórek zstrojowych OP9 pochodzi z czaszki myszy z mutacją osteopetrozy, którym brakuje funkcjonalnego M-CSF. System kokultury ES/OP9 in vitro może być wykorzystywany do odtworzenia wczesnego rozwoju krwiotwórczego. Hodowane na komórkach zstrojowych OP9, komórki ES różnicują się w hemangioblasty Flk-1+, progenitorów krwiotwórczych, a ostatecznie w dojrzałe, terminalnie zróżnicowane linie. Standardowy protokół kokultury ES/OP9 polega na umieszczeniu komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek OP9, a także na okresowych etapach przepaszczania w celu usunięcia starych, zanieczyszczających komórek OP9. Co więcej, obecne protokoły obejmują ocenę wyłącznie komórek krwiotwórczych znajdujących się w zawiesinie i nie są zoptymalizowane pod kątem oceny potomstwa pochodzącego z komórek ES w każdym dniu różnicowania. Jednakże, ze względu na etapy przepaszczania i zbieranie wyłącznie komórek z zawiesiny, można pominąć znaczną część potomstwa pochodzącego z komórek ES oraz rozwijających się komórek krwiotwórczych. Kwestia ta staje się istotna przy próbie charakterystyki wad krwiotwórczych związanych z liniami ES z nokautem. Opisujemy tutaj zmodyfikowaną kokulturę ES/mStrawberry OP9, która pozwala na wyeliminowanie zanieczyszczających komórek OP9 z dalszych analiz. Metoda ta umożliwia pełną ocenę całego potomstwa pochodzącego z komórek ES we wszystkich dniach kokultury, co prowadzi do uzyskania wzorca różnicowania krwiotwórczego, który bardziej bezpośrednio odpowiada wzorcowi różnicowania krwiotwórczego obserwowanemu w embrionie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek ES

  1. Hodować komórki ES zgodnie ze standardowym protokołem dla danej linii komórkowej. Należy przygotować odpowiednią liczbę komórek ES do wysiania na komórki mStrawberry OP9 w dniu 0 (komórki ES zostaną wysiane w zagęszczeniu 1x10^3 komórek na cm2 w dniu 0)

2. Przygotowanie komórek OP9

  1. Przed hodowlą komórek mStrawberry OP9 należy przygotować pożywkę wzrostową OP9
    Pożywka do hodowli komórek OP-9
     Roztwór stokowyStężenie końcoweObjętość (mL)
    aMEM  39,5
    FBS (testowany dla OP-9)100%20%10
    L-glutamina100X (200mM)2mM0,5
       50mL

    Przechowywać w temperaturze 4°C i zużyć w ciągu jednego tygodnia od przygotowania
  2. W celu utrzymania komórek mStrawberry OP9 pożywkę należy wymieniać co 2 dni, a komórki należy pasażować przed osiągnięciem pełnej konfluencji (pasażowanie przy 70-90% konfluencji). Hodowle komórek mStrawberry OP9 nigdy nie są prowadzone powyżej 90% konfluencji, ponieważ prowadzi to do ich różnicowania w adipocyty. Patrz Rysunek 3.
    1. Pasażować komórki, przemywając je 2X w PBS (lub 1x w PBS + 1x w 0,1% Trypsyny-EDTA)
    2. Dodać podgrzany do 37°C roztwór 0,1% Trypsyny-EDTA na 5 minut (lub do momentu odklejenia się komórek)
    3. Po odklejeniu się komórek dodać pożywkę wzrostową OP-9. Przenieść komórki do probówki stożkowej 50mL.
    4. Wirować komórki w 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odlać nadosad.
    5. Resuspender komórki w świeżej pożywce wzrostowej mStrawberry OP9
    6. Wysiać komórki z minimalną gęstością 104komórek/cm2
    7. Hodować komórki mStrawberry OP9 do konfluencji, rozpoczynając 3 dni przed dniem wymaganym do kokultury z komórkami ES (dzień 0, dzień 5 lub dzień 8/9 eksperymentu)

3. Kokultura ES/mStrawberry i OP9

  1. Przygotowanie pożywki do różnicowania w ko-kulturze
     Stężenie zapasuStężenie końcoweObjętość (mL)
    aMEM  39.5
    FBS100%20%10
    L-glutamina200mM2mM0.5
       50mL
  2. Komórki mStrawberry OP9 (dzień –3)
    1. ZAWSZE przeprowadzaj pasaż komórek OP9 w dniu -3, aby w dniu 0 ko-kultury uzyskać konfluentne warstwy komórek mStrawberry OP9. Patrz Rysunek 4b. Wysiej komórki mStrawberry OP9 w zagęszczeniu 1x104/cm2, aby osiągnęły konfluencję w dniu 0. Pamiętaj o pasażowaniu dodatkowych komórek na dzień 5 oraz dzień 8/9 w celu kontynuacji ko-kultury.
  3. Przygotowanie ko-kultury ES/mStrawberry OP9 (dzień 0)
    1. Przemyj komórki ES 2x PBS
    2. Poddaj komórki ES trypsynizacji za pomocą uprzednio ogrzanej 0.25% trypsyny-EDTA i inkubuj przez 5min w 37°C
    3. Dodaj do komórek pożywkę do różnicowania w ko-kulturze
    4. Zwiruj komórki ES przy 400xg przez 5-7min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej nadsącz
    5. Resuspenduj komórki w pożywce do różnicowania w ko-kulturze
    6. Usuń pożywkę z komórek mStrawberry OP9
    7. Dodaj do kolb z komórkami mStrawberry OP9 pożywkę do różnicowania w ko-kulturze
    8. Wysiej 1x103 komórek ES/cm2 do kolby z komórkami mStrawberry OP9. Inkubuj komórki w 37°C i 5% CO2 w warunkach wilgotnych.
  4. Komórki mStrawberry OP9 (dzień 2)
    1. Przeprowadź pasaż komórek mStrawberry OP9, aby w dniu 5 ko-kultury uzyskać konfluentne warstwy tych komórek. Wysiej komórki mStrawberry OP9 w zagęszczeniu 1x104/cm2 dla uzyskania konfluencji w dniu 5 (jak w kroku 3.2). W razie potrzeby przeprowadź pasaż dodatkowych komórek na dzień 8/9 (jak w kroku 2.2).
  5. Ko-kultura ES/mStrawberry OP9 (dzień 3)
    1. Ostrożnie usuń pożywkę z ko-kultury i zastąp ją świeżą pożywką do różnicowania w ko-kulturze


  6. Ko-kultura ES/mStrawberry OP9 (dzień 5)
    1. Ostrożnie przemyj ko-kultury 2x PBS
    2. Poddaj komórki trypsynizacji za pomocą uprzednio ogrzanej 0.25% trypsyny-EDTA
    3. Zmyj komórki z kolby pożywką do różnicowania w ko-kulturze
    4. Zwiruj komórki przy 400xg przez 7min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej nadsącz
    5. Dodaj do komórek pożywkę do różnicowania w ko-kulturze. Użyj stępionej igły 21G do resuspendowania komórek, aby zapewnić uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek
    6. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Liczba komórek ES powinna wzrosnąć od 100 do 150 razy w stosunku do dnia 0.
    7. Ponownie wysiej ko-kultury w zagęszczeniu od 6.48x104/cm2 do 7.76x104/cm2 na nową warstwę konfluentnych komórek mStrawberry OP9
    8. ANALIZY w dniu 5 – pozostałe komórki ko-kultury można wykorzystać do analizy cytometrycznej, przygotowania cytopreparatów (30 tys. komórek), testów ChIP itp.
  7. Ko-kultura ES/mStrawberry OP9 (dzień 8/9 oraz dzień 12)
    1. Usuń z kolby pożywkę do różnicowania i zachowaj ją. Przemyj monowarstwę 1x PBS, aby usunąć komórki hematopoetyczne znajdujące się w zawiesinie. Nie wylewaj komórek hematopoetycznych.
    2. Poddaj komórki adherentne trypsynizacji za pomocą uprzednio ogrzanej 0.25% trypsyny-EDTA
    3. Zmyj komórki z kolby pożywką do różnicowania ES i dodaj je do komórek hematopoetycznych zebranych z zawiesiny
    4. Zwiruj komórki przy 400xg przez 7min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej nadsącz
    5. Dodaj do komórek pożywkę do różnicowania w ko-kulturze lub PBS. Użyj stępionej igły 21G do resuspendowania komórek, aby zapewnić uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    6. Ko-kulturę można kontynuować przez 14 dni w celu oceny bardziej dojrzałych progenitorów hematopoetycznych, ponownie wysiewając komórki ko-kultury na nową warstwę konfluentnych komórek mStrawberry OP9 w dniu 8 lub 9, a następnie ponownie w dniu 12. Zoptymalizuj liczbę wysiewanych komórek w zależności od wymaganej odzyskiwalności komórek w dniu analizy.
  8. Ocena potomstwa pochodzącego z komórek ES (dzień 1-14). Potomstwo pochodzące z komórek ES można oceniać w dowolnym dniu ko-kultury poprzez sortowanie przepływowe komórek negatywnych względem mStrawberry (potomstwo ES).
    1. Usuń z kolby pożywkę do różnicowania i zachowaj ją. Przemyj monowarstwę 1x PBS, aby usunąć komórki hematopoetyczne w zawiesinie. Nie wylewaj komórek hematopoetycznych.
    2. Poddaj komórki adherentne trypsynizacji za pomocą uprzednio ogrzanej 0.25% trypsyny-EDTA
    3. Zmyj komórki z kolby pożywką do różnicowania w ko-kulturze i dodaj je do komórek hematopoetycznych w zawiesinie
    4. Zwiruj komórki przy 400xg przez 7min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej nadsącz
    5. Resuspenduj komórki za pomocą stępionej igły 21G i policz je
    6. Potomstwo pochodzące z komórek ES (komórki negatywne względem mStrawberry) można oddzielić metodą sortowania przepływowego od dodatnich komórek OP9 mStrawberry. Potomstwo ES można następnie scharakteryzować za pomocą analizy cytometrycznej, cytopreparatów, testów ChIP itp.

4. Reprezentatywne wyniki:

figure-protocol-1
Rycina 1. System kokultury ES/mStrawberry OP9. W naszym laboratorium wykorzystujemy system kokultury komórek ES in vitro do modelowania rozwoju hematopoetycznego. W tym systemie kokultury komórki ES różnicują się w hemangioblasty w 5. dniu, gdy zostaną umieszczone na konfluentnej warstwie komórek mStrawberry OP9. W miarę postępu kokultury w 8. dniu obecne są prekursory hematopoetyczne, natomiast terminalnie zróżnicowane linie hematopoetyczne pojawiają się do 14. dnia. Strzałki wskazują dni różnicowania, w których konieczne jest pasażowanie potomstwa pochodzącego z komórek ES na nowe konfluentne warstwy komórek mStrawberry OP9.

figure-protocol-2
Rycina 2. Prawidłowe różnicowanie komórek ES. Komórki ES są wysiewane na konfluencyjną warstwę mStrawberry OP9 w dniu 0. Potomstwo pochodzące z komórek ES staje się widoczne w 3. dniu różnicowania; przybierają one postać klastrów komórek o wyraźnej granicy lub zaczynają tworzyć wzór wirujący. Hemangioblasty, będące wspólnym mezodermalnym prekursorem dla linii śródbłonkowej i hematopoetycznej, powinny pojawić się w 5. dniu jako spiętrzone wiry komórek. W przypadku okresów kokultury przekraczających pięć dni, potomstwo pochodzące z komórek ES powinno występować jako klastry komórek hematopoetycznych. Klastry składające się z dwóch do czterech komórek powinny pojawić się w 6. lub 7. dniu i urosnąć w większe skupiska komórkowe do 8. lub 9. dnia kokultury. Inne potomstwo pochodzące z komórek ES występuje również w formie ściśle związanej z adherentną warstwą komórek stromy.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Nieudane różnicowanie komórek ES. Wyniki z tej kokultury odzwierciedlają nieprawidłowe różnicowanie komórek ES. Zwróć uwagę, że potomstwo pochodzące z komórek ES nie tworzy wzoru wiru w 5. dniu. Brak komórek ułożonych w wzór wiru wskazuje na nieprawidłowe tworzenie się hemangioblastów. Jeśli hemangioblasty nie rozwiną się prawidłowo, dalsza kokultura doprowadzi do zahamowania różnicowania linii krwiotwórczej. Kokultury z nieprawidłowo uformowanymi hemangioblastami należy zutylizować.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Kultury komórek OP9 mStrawberry. (A) Komórki OP9 mStrawberry są pasażowane przy 70-90% konfluencji. (B) W celu prawidłowego różnicowania, komórki ES oraz pochodne z nich komórki potomne są wysiewane na nadmiernie konfluentną warstwę komórek OP9 mStrawberry.

figure-protocol-5
Rycina 5. Reprezentatywny profil cytometrii przepływowej kokultury ES/mStrawberry OP9. Wszystkie potomstwo pochodzące z komórek ES są komórkami mStrawberry-ujemnymi i mogą zostać wyselekcjonowane metodą sortowania przepływowego z komórek mStrawberry OP9. Bramka dla komórek mStrawberry-ujemnych została wyznaczona przy użyciu tradycyjnej kokultury ES/OP9.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowe różnicowanie komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek mStrawberry OP9 prowadzi do powstania hemangioblastów Flk1+ w 5. dniu kokultury. Hemangioblasty powinny występować w postaci spiętrzonych kłaczków komórek, co przedstawiono na Rysunku 1. W pozostałym czasie kokultury widoczne potomstwo pochodzące z komórek ES powinno pojawiać się jako skupiska komórek krwiotwórczych (Rysunek 1). W 6. lub 7. dniu powinny pojawić się od dwóch do czterech skupisk komórek, które do 8. lub 9. dnia kokultury urosną w większe skupiska komórek (zarówno przylegające, jak i w zawiesinie). Inne potomstwo pochodzące z komórek ES znajduje się również w ciasnym połączeniu z przyległą warstwą komórek zrazikowych.

Choć nie jest to wyszczególnione w protokole, kluczowe jest wstępne przetestowanie FBS stosowanego w medium wzrostowym dla komórek ES, mediach wzrostowych dla komórek mStrawberry OP9 oraz mediach różnicowania dla ES/mStrawberry OP9. Odpowiednio przetestowana surowica powinna zapewnić prawidłowy wzrost komórek mStrawberry OP9, a także właściwe różnicowanie komórek ES w kokulturze aż do 5. dnia różnicowania. Jako alternatywę lub uzupełnienie dla komórek mStrawberry OP9, komórki OP9 mogą zostać napromieniowane dawką 8000 rad przed wysianiem do osiągnięcia pełnej konfluencji (7,8x104 komórek/cm2). Napromieniowanie komórek OP9 pozwala na wyeliminowanie powtarzających się etapów przesiewania, a także umożliwia niemal całkowite usunięcie starych, zanieczyszczających komórek OP9 z dalszych analiz.

Komórki OP9 zmodyfikowano genetycznie w celu ekspresji białka mStrawberry poprzez transdukcję komórek OP9 wektorem lentiwirusowym w stężeniu 3ug/mL, wykazującym ekspresję mStrawberry pod kontrolą promotora CMV (wektor pRRLsin-CMV, UCLA vector core).

Standardowe protokoły kokultury ES/OP9 zakładają umieszczanie komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek OP9, a także etap przeżycia w 5. dniu w celu usunięcia starych, zanieczyszczających komórek OP9 z pasażu komórkowego. Ponadto, do oceny potomstwa pochodzącego z komórek ES usuwane są jedynie komórki krwiotwórcze znajdujące się w zawiesinie. Jednakże, zarówno etap przeżycia, jak i zbieranie wyłącznie komórek w zawiesinie mogą prowadzić do pominięcia znacznej liczby rozwijających się krwiotwórczych komórek pochodnych z ES. Problem ten staje się istotny przy próbach charakteryzacji defektów krwiotwórczych związanych z liniami ES z knockoutem. Aby obejść ten problem, w naszym laboratorium zastosowano zmodyfikowaną kokulturę z wykorzystaniem komórek OP9 wykazujących ekspresję mStrawberry. Zapewnia to przeniesienie całego potomstwa ES do dalszej kokultury w 5. dniu oraz możliwość zbioru całego potomstwa pochodnego z ES do dalszych analiz. Modyfikacja ta stanowi użyteczne narzędzie w ocenie i charakteryzacji potomstwa krwiotwórczego pochodzącego z linii ES zarówno człowieka, jak i myszy.

Ten model kokultury ES-mStrawberry z komórkami OP9 odwzorowuje różne stadia prymitywnej i definitywnej hematopoezy. W badaniach nad najwcześniejszymi etapami rozwoju hematopoetycznego często stosuje się test BL-CFC (Blast-like colony forming cell), który ocenia powstawanie hemangioblastów z komórek ES. Choć test BL-CFC jest użytecznym narzędziem przy badaniu wczesnego rozwoju hematopoetycznego, system kokultury mStrawberry-ES wykazuje większą użyteczność, ponieważ pozwala na ocenę nie tylko hemangioblastów, ale także bardziej dojrzałych linii hematopoetycznych.

Poprzednie prace z wykorzystaniem tradycyjnych protokołów różnicowania OP9/ES i EB wykazały, że w celu uzyskania krótko- i długoterminowo repopulujących komórek macierzystych krwi in vitro mogą być niezbędne dodatkowe czynniki, takie jak nadekspresja HoxB4. Konieczne są dalsze badania, aby ocenić, czy sortowane populacje pochodzące z ES, u których nie stwierdzono obecności mStrawberry, zawierają rzeczywiste komórki macierzyste krwi.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy U. Ganapati za opracowanie i przetestowanie linii komórkowej mStrawberry OP9. Dodatkowo dziękujemy H. Shafif za pomoc przy hodowli współdzielonej. H.P. jest wspierany stypendiem z National Heart, Lung, and Blood Institute (F31HL087714) (H.P.). Treść niniejszej pracy jest wyłączną odpowiedzialnością autora i nie musi reprezentować oficjalnych poglądów National Heart, Lung, And Blood Institute ani National Institutes of Health (NIH). UCLA Flow Cytometry Core Facility jest wspierane przez NIH (CA-16042 i AI-28697), Jonsson Cancer Center, UCLA AIDS Institute oraz UCLA School of Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Składniki zapasu pożywki do utrzymania komórek OP-9
aMEMInvitrogen12571-063
FBSOmega ScientificFB01Przetestowane
L-glutaminaCellgro25-005-C I200nM
Trypsyna-EDTAStem Cell Technologies07901
Składniki zapasu pożywki do różnicowania komórek ES/OP-9
aMEMInvitrogen12571-063
FBSHycloneSH30070Przetestowane
L-glutaminaCellgro25-005-CI200mM
PBS (bez Ca2+ i Mg2+)Cellgro21-031-CV
Trypsyna-EDTAStem Cell Technologies07901

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baron, M. H. Embryonic origins of mammalian hematopoiesis. Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).
  2. Baron, M. H. Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation. Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).
  3. Baron, M. H., Fraser, S. T. The specification of early hematopoiesis in the mammal. Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).
  4. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).
  5. Ganapati, U. Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression. Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).
  6. Hogan, B. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).
  7. Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).
  8. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).
  9. Nakano, T. Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro. Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).
  10. Nakano, T. In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis. Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).
  11. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1098 (1994).
  12. Turksen, K. Embryonic stem cells : methods and protocols. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie krwiotw rczeM Strawberry OP9sortowanie kom rekFlk 1 dodatniehemangioblastycytometria przep ywowar nicowanie kom rek ES

Powiązane artykuły