Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowany protokół kokultury ES / OP9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego

22.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2559

⸱

7 czerwca 2011

 ,  , 
1Department of Medicine, Hematology-Oncology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki OP9 mStrawberry umożliwiają pełną ocenę wszystkich potomnych pochodzących z ES z kokultury.

Streszczenie

Diferencjacja komórek ES in vitro w kierunku linii krwiotwórczych jest przydatna przy badaniu populacji komórkowych, które są trudne do uzyskania in vivo, oraz w charakterystyce najwcześniejszych genów zaangażowanych w hematopoezę, bez konieczności mierzenia się z letalnością embrionalną. System kokultury ES/OP9 został pierwotnie zaprojektowany w celu wytworzenia potomstwa krwiotwórczego bez nadprodukcji makrofagów, ponieważ linia komórek zstrojowych OP9 pochodzi z czaszki myszy z mutacją osteopetrozy, którym brakuje funkcjonalnego M-CSF. System kokultury ES/OP9 in vitro może być wykorzystywany do odtworzenia wczesnego rozwoju krwiotwórczego. Hodowane na komórkach zstrojowych OP9, komórki ES różnicują się w hemangioblasty Flk-1+, progenitorów krwiotwórczych, a ostatecznie w dojrzałe, terminalnie zróżnicowane linie. Standardowy protokół kokultury ES/OP9 polega na umieszczeniu komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek OP9, a także na okresowych etapach przepaszczania w celu usunięcia starych, zanieczyszczających komórek OP9. Co więcej, obecne protokoły obejmują ocenę wyłącznie komórek krwiotwórczych znajdujących się w zawiesinie i nie są zoptymalizowane pod kątem oceny potomstwa pochodzącego z komórek ES w każdym dniu różnicowania. Jednakże, ze względu na etapy przepaszczania i zbieranie wyłącznie komórek z zawiesiny, można pominąć znaczną część potomstwa pochodzącego z komórek ES oraz rozwijających się komórek krwiotwórczych. Kwestia ta staje się istotna przy próbie charakterystyki wad krwiotwórczych związanych z liniami ES z nokautem. Opisujemy tutaj zmodyfikowaną kokulturę ES/mStrawberry OP9, która pozwala na wyeliminowanie zanieczyszczających komórek OP9 z dalszych analiz. Metoda ta umożliwia pełną ocenę całego potomstwa pochodzącego z komórek ES we wszystkich dniach kokultury, co prowadzi do uzyskania wzorca różnicowania krwiotwórczego, który bardziej bezpośrednio odpowiada wzorcowi różnicowania krwiotwórczego obserwowanemu w embrionie.

Protokół

1. Przygotowanie komórek ES

  1. Hoduj komórki ES zgodnie ze standardowym protokołem dla danej linii komórkowej. Należy przygotować odpowiednią liczbę komórek ES do wysiewu na komórki mStrawberry OP9 w dniu 0 (komórki ES zostaną wysiane w zagęszczeniu 1x10^3 komórek na cm2 w dniu 0)

2. Przygotowanie komórek OP9

  1. Przed hodowlą komórek mStrawberry OP9 przygotuj pożywkę wzrostową OP9
    Pożywka do hodowli komórek OP-9
     Roztwór stokowyStężenie końcoweObjętość (mL)
    aMEM  39.5
    FBS (testowany dla OP-9)10%20%10
    L-glutamina10X (200mM)2mM0.5
       50mL

    Przechowywać w 4°C i zużyć w ciągu jednego tygodnia od przygotowania
  2. Aby utrzymać komórki mStrawberry OP9, pożywkę należy wymieniać co 2 dni, a komórki należy pasażować przed osiągnięciem pełnej konfluencji (pasażowanie przy 70-90% konfluencji). Hodowle komórek mStrawberry OP9 nigdy nie są prowadzone powyżej 90% konfluencji, ponieważ doprowadzi to do ich różnicowania w adipocyty. Patrz Rycina 3.
    1. Pasażuj komórki, przemywając je 2X w PBS (lub 1x w PBS + 1x w 0,1% Trypsyny-EDTA)
    2. Dodaj podgrzaną wcześniej 0,1% Trypsynę-EDTA w temperaturze 37°C na 5 minut (lub do momentu odklejenia się komórek)
    3. Po odklejeniu się komórek dodaj pożywkę wzrostową OP-9. Przenieś komórki do probówki stożkowej o pojemności 50mL.
    4. Zwiruj komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć supernatant.
    5. Resuspenduj komórki w świeżej pożywce wzrostowej mStrawberry OP9
    6. Wysiej komórki z minimalną gęstością 104komórek/cm2
    7. Hoduj komórki mStrawberry OP9 do uzyskania konfluencji, zaczynając na 3 dni przed dniem wymaganym do ko-hodowli z komórkami ES (Dzień 0, Dzień 5 lub Dzień 8/9 eksperymentu)

3. Ko-kultura ES/mStrawberry z komórkami OP9

  1. Przygotowanie pożywki różnicującej do kokultury
     Stężenie początkoweStężenie końcoweObjętość (mL)
    aMEM  39,5
    FBS10%20%10
    L-glutamina20mM2mM0,5
       50mL
  2. Komórki mStrawberry OP9 (Dzień –3)
    1. ZAWZSY przeprowadzaj pasaż komórek OP9 w dniu -3, aby w dniu 0 kokultury uzyskać konfluentne warstwy komórek mStrawberry OP9. Patrz Rycina 4b. Wysiej komórki mStrawberry OP9 w gęstości 1x104/cm2, aby osiągnąć konfluencję w dniu 0. Pamiętaj o pasażowaniu dodatkowych komórek na dzień 5 oraz dzień 8/9 w celu kontynuacji kokultury.
  3. Przygotowanie kokultury ES/mStrawberry OP9 (Dzień 0)
    1. Przemyj komórki ES 2x za pomocą PBS
    2. Poddaj komórki ES trypsynizacji za pomocą podgrzanej do 37°C 0,25% trypsyny-EDTA, inkubuj przez 5 min w 37°C
    3. Dodaj do komórek pożywkę różnicującą do kokultury
    4. Odwiruj komórki ES przy 40xg przez 5-7 min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej supernatant
    5. Resuspenduj komórki w pożywce różnicującej do kokultury
    6. Usuń pożywkę z komórek mStrawberry OP9
    7. Dodaj pożywkę różnicującą do kokultury do kolb z komórkami mStrawberry OP9
    8. Wysiej 1x103 komórek ES/cm2 do kolby z komórkami mStrawberry OP9. Inkubuj komórki w temperaturze 37° C, w 5% CO2 z zachowaniem wilgotności.
  4. Komórki mStrawberry OP9 (Dzień 2)
    1. Przeprowadź pasaż komórek mStrawberry OP9, aby uzyskać konfluentne warstwy komórek mStrawberry OP9 na 5. dzień kokultury. Wysiej komórki mStrawberry OP9 w gęstości 1x104/cm2, aby uzyskać konfluencję w dniu 5 (jak w kroku 3.2). W razie potrzeby przeprowadź pasaż dodatkowych komórek na dzień 8/9 (jak w kroku 2.2).
  5. Kokultura ES/mStrawberry OP9 (Dzień 3)
    1. Ostrożnie usuń pożywkę z kokultury i zastąp ją świeżą pożywką różnicującą do kokultury


  6. Kokultura ES/mStrawberry OP9 (Dzień 5)
    1. Ostrożnie przemyj kokultury 2x za pomocą PBS
    2. Poddaj komórki trypsynizacji za pomocą podgrzanej do 37°C 0,25% trypsyny-EDTA
    3. Zmyj komórki z kolby za pomocą pożywki różnicującej do kokultury
    4. Odwiruj komórki przy 40xg przez 7 min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej supernatant
    5. Dodaj do komórek pożywkę różnicującą do kokultury. Użyj tępej igły o rozmiarze 21G do resuspensji komórek, aby zapewnić uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek
    6. Policz komórki za pomocą komory countingowej. Liczba komórek ES powinna wzrosnąć 10-150 razy w stosunku do dnia 0.
    7. Ponownie wysiej od 6,48x104/cm2 do 7,76x104/cm2 komórek z kokultury na nową warstwę konfluentnych komórek mStrawberry OP9
    8. ANALIZY w dniu 5 – pozostałe komórki z kokultury mogą być wykorzystane do analizy cytometrii przepływowej, cytopreparacji (30 tys. komórek), testów ChIP itp.
  7. Kokultura ES/mStrawberry OP9 (Dzień 8/9 i Dzień 12)
    1. Usuń pożywkę różnicującą z kolby i zachowaj ją. Przemyj monowarstwę 1x za pomocą PBS, aby usunąć komórki krwiotwórcze znajdujące się w zawiesinie. Nie wylewaj komórek krwiotwórczych.
    2. Poddaj komórki adherentne trypsynizacji za pomocą podgrzanej do 37°C 0,25% trypsyny-EDTA
    3. Zmyj komórki z kolby pożywką różnicującą dla ES i dodaj je do komórek krwiotwórczych z zawiesiny
    4. Odwiruj komórki przy 40xg przez 7 min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej supernatant
    5. Dodaj do komórek pożywkę różnicującą do kokultury lub PBS. Użyj tępej igły o rozmiarze 21G do resuspensji komórek, aby zapewnić uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek. Policz komórki za pomocą komory countingowej.
    6. Kokulturę można kontynuować przez 14 dni w celu oceny bardziej dojrzałych progenitorów krwiotwórczych poprzez ponowne wysiewanie komórek z kokultury na nową warstwę konfluentnych komórek mStrawberry OP9 w dniu 8 lub 9, a następnie ponownie w dniu 12. Wysiej zoptymalizowaną liczbę komórek w zależności od wymaganej odzyskiwalności komórek w dniu analizy.
  8. Ocena potomstwa pochodzącego z komórek ES (Dzień 1-14). Potomstwo pochodzące z komórek ES może być oceniane w dowolnym dniu kokultury poprzez sortowanie przepływowe komórek negatywnych pod kątem mStrawberry (potomstwo pochodzące z ES).
    1. Usuń pożywkę różnicującą z kolby i zachowaj ją. Przemyj monowarstwę 1x za pomocą PBS, aby usunąć komórki krwiotwórcze znajdujące się w zawiesinie. Nie wylewaj komórek krwiotwórczych.
    2. Poddaj komórki adherentne trypsynizacji za pomocą podgrzanej do 37°C 0,25% trypsyny-EDTA
    3. Zmyj komórki z kolby pożywką różnicującą do kokultury i dodaj je do komórek krwiotwórczych z zawiesiny
    4. Odwiruj komórki przy 40xg przez 7 min w temperaturze pokojowej (RT). Odlej supernatant
    5. Resuspenduj komórki za pomocą tępej igły o rozmiarze 21G i policz je
    6. Potomstwo pochodzące z komórek ES (komórki mStrawberry-negatywne) można oddzielić metodą sortowania przepływowego od komórek OP9 mStrawberry-pozytywnych. Potomstwo pochodzące z ES można następnie scharakteryzować za pomocą analizy cytometrii przepływowej, cytopreparacji, testów ChIP itp.

4. Reprezentatywne wyniki:

Harmonogram kokultury mysich komórek ES/mStrawberry z komórkami OP9; dni zbioru komórek i pasażowania; schemat badawczy.
Rycina 1. System kokultury ES/mStrawberry i OP9. Nasze laboratorium wykorzystuje in vitro System kokultury komórek ES do modelowania rozwoju hematopoetycznego. W tym systemie kokultury komórki ES różnicują się w hemangioblasty w 5. dniu, gdy zostaną umieszczone na konfluencyjnej warstwie komórek mStrawberry OP9. W miarę trwania kokultury w 8. dniu obecne są prekursory hematopoetyczne, natomiast w 14. dniu pojawiają się terminalnie zróżnicowane linie hematopoetyczne. Strzałki wskazują dni różnicowania, w których konieczne jest pasażowanie potomstwa pochodzącego z komórek ES na nowe konfluencyjne warstwy komórek mStrawberry OP9.

Etapy różnicowania hematopoetycznego, obrazy mikroskopowe; rozwój komórek, stadium hemangioblastyczne, prekursory.
Rycina 2. Prawidłowe różnicowanie komórek ESKomórki ES wysiewa się na konfluentną warstwę komórek mStrawberry OP9 w dniu 0. Potomstwo pochodzące z komórek ES zaczyna być widoczne w 3. dniu różnicowania, przyjmując postać skupisk komórek o wyraźnej granicy lub zaczynając tworzyć wzory wirowate. Hemangioblasty, będące wspólnym mezodermalnym prekursorem linii śródbłonkowej i hematopoetycznej, powinny pojawić się w 5. dniu jako piętrzące się wiry komórek. W przypadku okresów kokultury dłuższych niż pięć dni, potomstwo pochodzące z komórek ES powinno występować w postaci skupisk komórek hematopoetycznych. W 6. lub 7. dniu powinny pojawić się skupiska składające się z dwóch do czterech komórek, które do 8. lub 9. dnia kokultury urosną w większe agregaty komórkowe. Pozostałe potomstwo pochodzące z komórek ES znajduje się ściśle związane z adherentną warstwą komórek zrębowych.

Tworzenie hemangioblastów, dzień 5, obraz mikroskopowy, niewłaściwy wzorzec rozwoju, analiza badań komórkowych.
Rycina 3. Nieudane różnicowanie komórek ES. Wyniki z tej kokultury odzwierciedlają nieprawidłowe różnicowanie komórek ES. Należy zauważyć, że w 5. dniu potomstwo pochodzące z komórek ES nie układa się w strukturę wiru. Brak komórek ułożonych w wir wskazuje na nieprawidłową formację hemangioblastów. Jeśli hemangioblasty nie rozwiną się prawidłowo, dalsza kokultura doprowadzi do zahamowania różnicowania linii hematopoetycznej. Kokultury z nieprawidłową formacją hemangioblastów należy utylizować.

Kultury mStrawberry OP9, obraz mikroskopowy, porównanie wzrostu komórek niezlewnej i zlewnej.
Rycina 4. Kultury komórek OP9 z mStrawberry. (A) Komórki OP9 mStrawberry są poddawane pasażowaniu przy konfluencji 70–90%. (B) W celu prawidłowej różnicowania komórki ES oraz pochodne z nich komórki potomne są wysiewane na nadmiernie konfluencyjną warstwę komórek OP9 mStrawberry.

Analiza cytometryczna, wykres rozrzutu, sortowanie komórek mStrawberry+, dane SSC-A vs FSC-A.
Rycina 5. Reprezentatywny profil przepływu dla kokultury ES/mStrawberry OP9. Wszystkie potomstwo pochodzące z komórek ES są komórkami mStrawberry-ujemnymi i mogą zostać wyselekcjonowane metodą sortowania przepływowego z komórek OP9 mStrawberry. Brama dla komórek mStrawberry-ujemnych została wyznaczona przy użyciu tradycyjnej kokultury ES/OP9.

Dyskusja

Prawidłowe różnicowanie komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek mStrawberry OP9 prowadzi do powstania hemangioblastów Flk1+ w 5. dniu kokultury. Hemangioblasty powinny występować w postaci spiętrzonych kłaczków komórek, co przedstawiono na Rysunku 1. W pozostałym czasie kokultury widoczne potomstwo pochodzące z komórek ES powinno pojawiać się jako skupiska komórek krwiotwórczych (Rysunek 1). W 6. lub 7. dniu powinny pojawić się od dwóch do czterech skupisk komórek, które do 8. lub 9. dnia kokultury urosną w większe skupiska komórek (zarówno przylegające, jak i w zawiesinie). Inne potomstwo pochodzące z komórek ES znajduje się również w ciasnym połączeniu z przyległą warstwą komórek zrazikowych.

Choć nie jest to wyszczególnione w protokole, kluczowe jest wstępne przetestowanie FBS stosowanego w medium wzrostowym dla komórek ES, mediach wzrostowych dla komórek mStrawberry OP9 oraz mediach różnicowania dla ES/mStrawberry OP9. Odpowiednio przetestowana surowica powinna zapewnić prawidłowy wzrost komórek mStrawberry OP9, a także właściwe różnicowanie komórek ES w kokulturze aż do 5. dnia różnicowania. Jako alternatywę lub uzupełnienie dla komórek mStrawberry OP9, komórki OP9 mogą zostać napromieniowane dawką 8000 rad przed wysianiem do osiągnięcia pełnej konfluencji (7,8x104 komórek/cm2). Napromieniowanie komórek OP9 pozwala na wyeliminowanie powtarzających się etapów przesiewania, a także umożliwia niemal całkowite usunięcie starych, zanieczyszczających komórek OP9 z dalszych analiz.

Komórki OP9 zmodyfikowano genetycznie w celu ekspresji białka mStrawberry poprzez transdukcję komórek OP9 wektorem lentiwirusowym w stężeniu 3ug/mL, wykazującym ekspresję mStrawberry pod kontrolą promotora CMV (wektor pRRLsin-CMV, UCLA vector core).

Standardowe protokoły kokultury ES/OP9 zakładają umieszczanie komórek ES na konfluencyjnej warstwie komórek OP9, a także etap przeżycia w 5. dniu w celu usunięcia starych, zanieczyszczających komórek OP9 z pasażu komórkowego. Ponadto, do oceny potomstwa pochodzącego z komórek ES usuwane są jedynie komórki krwiotwórcze znajdujące się w zawiesinie. Jednakże, zarówno etap przeżycia, jak i zbieranie wyłącznie komórek w zawiesinie mogą prowadzić do pominięcia znacznej liczby rozwijających się krwiotwórczych komórek pochodnych z ES. Problem ten staje się istotny przy próbach charakteryzacji defektów krwiotwórczych związanych z liniami ES z knockoutem. Aby obejść ten problem, w naszym laboratorium zastosowano zmodyfikowaną kokulturę z wykorzystaniem komórek OP9 wykazujących ekspresję mStrawberry. Zapewnia to przeniesienie całego potomstwa ES do dalszej kokultury w 5. dniu oraz możliwość zbioru całego potomstwa pochodnego z ES do dalszych analiz. Modyfikacja ta stanowi użyteczne narzędzie w ocenie i charakteryzacji potomstwa krwiotwórczego pochodzącego z linii ES zarówno człowieka, jak i myszy.

Ten model kokultury ES-mStrawberry z komórkami OP9 odwzorowuje różne stadia prymitywnej i definitywnej hematopoezy. W badaniach nad najwcześniejszymi etapami rozwoju hematopoetycznego często stosuje się test BL-CFC (Blast-like colony forming cell), który ocenia powstawanie hemangioblastów z komórek ES. Choć test BL-CFC jest użytecznym narzędziem przy badaniu wczesnego rozwoju hematopoetycznego, system kokultury mStrawberry-ES wykazuje większą użyteczność, ponieważ pozwala na ocenę nie tylko hemangioblastów, ale także bardziej dojrzałych linii hematopoetycznych.

Poprzednie prace z wykorzystaniem tradycyjnych protokołów różnicowania OP9/ES i EB wykazały, że w celu uzyskania krótko- i długoterminowo repopulujących komórek macierzystych krwi in vitro mogą być niezbędne dodatkowe czynniki, takie jak nadekspresja HoxB4. Konieczne są dalsze badania, aby ocenić, czy sortowane populacje pochodzące z ES, u których nie stwierdzono obecności mStrawberry, zawierają rzeczywiste komórki macierzyste krwi.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy U. Ganapati za opracowanie i przetestowanie linii komórkowej mStrawberry OP9. Dodatkowo dziękujemy H. Shafif za pomoc przy hodowli współdzielonej. H.P. jest wspierany stypendiem z National Heart, Lung, and Blood Institute (F31HL087714) (H.P.). Treść niniejszej pracy jest wyłączną odpowiedzialnością autora i nie musi reprezentować oficjalnych poglądów National Heart, Lung, And Blood Institute ani National Institutes of Health (NIH). UCLA Flow Cytometry Core Facility jest wspierane przez NIH (CA-16042 i AI-28697), Jonsson Cancer Center, UCLA AIDS Institute oraz UCLA School of Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Składniki zapasu pożywki do utrzymania komórek OP-9
aMEMInvitrogen12571-063
FBSOmega ScientificFB01Przetestowane
L-glutaminaCellgro25-005-C I200nM
Trypsyna-EDTAStem Cell Technologies07901
Składniki zapasu pożywki do różnicowania komórek ES/OP-9
aMEMInvitrogen12571-063
FBSHycloneSH30070Przetestowane
L-glutaminaCellgro25-005-CI200mM
PBS (bez Ca2+ i Mg2+)Cellgro21-031-CV
Trypsyna-EDTAStem Cell Technologies07901

Bibliografia

  1. Baron, M. H. Embryonic origins of mammalian hematopoiesis. Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).
  2. Baron, M. H. Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation. Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).
  3. Baron, M. H., Fraser, S. T. The specification of early hematopoiesis in the mammal. Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).
  4. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).
  5. Ganapati, U. Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression. Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).
  6. Hogan, B. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).
  7. Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).
  8. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).
  9. Nakano, T. Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro. Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).
  10. Nakano, T. In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis. Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).
  11. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1098 (1994).
  12. Turksen, K. Embryonic stem cells : methods and protocols. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

R nicowanie krwiotw rczeM Strawberry OP9sortowanie kom rekFlk 1 dodatniehemangioblastycytometria przep ywowar nicowanie kom rek ES
Zmodyfikowany protokół kokultury ES / OP9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.