Formalna prezentacja sekcji oka myszy, prowadząca do uzyskania preparatu całego nabłonka barwnikowego siatkówki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) znajduje się w tylnej części oka ssaków, bezpośrednio pod siatkówką nerwową, która zawiera fotoreceptory (pręciki i czopki). RPE stanowi monowarstwa pigmentowanych komórek sześcianowatych i ściśle przylega do znajdującej się powyżej siatkówki nerwowej. Ta bliskość sprawia, że RPE jest niezwykle interesujący dla badaczy zajmujących się chorobami siatkówki. RPE jest również miejscem przeprowadzania testu in vivo naprawy DNA kierowanej przez homologię, znanego jako test pun . Oko mysie jest szczególnie trudne do wypreparowania ze względu na niewielki rozmiar (około 3,5 mm średnicy) i kulisty kształt. Niniejszy artykuł szczegółowo demonstruje procedurę sekcji oka, która pozwala na uzyskanie preparatu całego nabłonka RPE. W tej procedurze pokazujemy, jak pracować z wykorzystaniem, a nie przeciwko, kulistej strukturze oka. W skrócie, z tylnej części oka usuwa się tkankę łączną, mięśnie i nerw wzrokowy. Następnie usuwa się rogówkę i soczewkę. Kolejno wykonuje się strategiczne cięcia, które prowadzą do znacznego spłaszczenia pozostałej tkanki. Na koniec delikatnie oddziela się siatkówkę nerwową, odsłaniając nienaruszony RPE, który pozostaje przytwierdzony do leżącej poniżej błony naczyniowej i twardówki. Taki preparat całego nabłonka może być wykorzystany do przeprowadzenia testu pun , a także do badań immunohistochemicznych lub immunofluorescencyjnych tkanki RPE.
Protokół
1. Usunięcie zbędnej tkanki z zewnętrznej strony oka
- Wlej 1X PBS do pokrywki szalki 35 mm. Poziom płynu powinien znajdować się tuż poniżej krawędzi pokrywki.
- Za pomocą pęsety prostej przenieś oko (lub oka) z probówki do przechowywania do szalki 35 mm. Oka są zanurzone w PBS z dwóch powodów: 1. Nadmiarowe tkanki „odpłyną” od oka, co umożliwi ich łatwe dostrzeżenie i usunięcie, oraz 2. Podczas sekcji oko w zawiesinie naturalnie zachowa swój sferyczny kształt, co pozwala na pracę z tą formą, zamiast z nią walczyć.
- Używając obu par pęset kątowych (45° i 15°), delikatnie usuń jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej, odciągając tkankę w kierunku przeciwnym do przebiegu włókien (t.j. w stronę rogówki). Część tkanki łącznej pozostanie. Należy dążyć do jak najmniejszego ściskania gałki ocznej.
- Zamień pęsetę 15° na nożyczki sprężynowe. Stabilizując oko pęsetą 45°, użyj nożyczek sprężynowych do wycięcia pozostałych mięśni, tkanki łącznej oraz nerwu wzrokowego. *Wskazówka: Użyj zewnętrznej krawędzi nożyczek, aby odsunąć tkankę w kierunku przeciwnym do przebiegu włókien (w stronę granicy rogówkowo-twardówkowej), a następnie przytnij ją. Kontynuuj, aż wszystkie nadmiarowe tkanki zostaną usunięte z oka.
2. Usunięcie rogówki i soczewki
- Ustawiając rogówkę skierowaną do góry, użyj pęsety 45°, aby uchwycić niewielki fałd w centrum rogówki.
- Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj niewielkie nacięcie u podstawy fałdu. Następnie zwolnij uścisk fałdu.
- Trzymając oko nieruchomo pęsetą, wprowadź dolne ostrze nożyczek prostopadle do nacięcia i wykonaj cięcie w kierunku granicy rogówkowo-twardówkowej. Staraj się utrzymać dolne ostrze pod tęczówką, aby przeciąć zarówno rogówkę, jak i tęczówkę. Nie docinaj do samej granicy rogówkowo-twardówkowej. Pozostaw nożyczki wprowadzone do oka.
- Używając pęsety 45°, ostrożnie obróć oko tak, aby nożyczki znajdowały się równolegle do granicy rogówkowo-twardówkowej, i wykonaj niewielkie cięcie. Powoli obróć oko o 360°, wykonując małe nacięcia wzdłuż całego obwodu. Ponownie staraj się utrzymać dolne ostrze nożyczek sprężynowych pod tęczówką, aby przeciąć zarówno tęczówkę, jak i rogówkę. Odseparuj tęczówkę i rogówkę od reszty oka i je usuń.
- Przechyl oko na bok i delikatnie naciśnij tylną połowę gałki ocznej, aby wypchnąć soczewkę. Usuń soczewkę. Wnętrze pozostałej pucharowej części oka wyścielone jest siatkówką neuronalną, która powinna wyglądać gładko i być nieprzezroczysta.
3. Podziel powstałą „czarkę” z oka na cztery części, tworząc strukturę przypominającą kwiat o 4 „płatkach”
- Oko należy ustawić w taki sposób, aby otwór naczynia z okiem znajdował się prostopadle do ciała. Do stabilizacji i pozycjonowania naczynia należy użyć pęsety pod kątem 45°.
- Trzymając nożyczki sprężynowe przed sobą, prostopadle do ciała, należy wsunąć dolne ostrze nożyczek w górną krawędź otwartego naczynia z okiem. Za pomocą pęsety pod kątem 45° należy ostrożnie wyrównać naczynie tak, aby można było wykonać jedno proste cięcie od granicy rogówki i twardówki w kierunku główki nerwu wzrokowego. Wszystkie cięcia powinny być prostopadłe do granicy rogówki i twardówki i, o ile nie określono inaczej, powinny przebiegać jak najbliżej główki nerwu wzrokowego, nie naruszając jej.
- Należy obrócić naczynie z okiem o 180°, zachowując jego prostopadłe ustawienie względem ciała. Należy zastosować technikę opisaną w kroku 3.2, aby wykonać drugie cięcie prostopadłe.
- Należy obrócić naczynie i powtórzyć technikę opisaną w punkcie 3.2, aby wykonać dwa kolejne cięcia. Wszystkie cztery cięcia powinny być oddalone od siebie o kąt jak najbliższy 90°. Należy pamiętać, że oko nie jest idealnie sferyczne, więc wystąpić może pewna zmienność.
4. Przetnij każdy z czterech „płatków” na pół, tworząc strukturę przypominającą kwiat o ośmiu płatkach
- Przenieś ćwiartkę gałki ocznej z szalki 35 mm na czyste szkiełko. Ustawiając gałkę oczną stroną górną do góry, podważ ją pęsetą pod kątem 45°. Ostrożnie wyjmij ją z cieczy i umieść na czystym szkiełku.
- Używając obu par pęset kątowych, delikatnie rozchyl oko tak, aby siatkówka neuronalna była skierowana do góry. NIE USUWAJ SIATKÓWKI NEURONALNEJ – pomaga ona zachować sferyczny kształt oka, dzięki czemu nie będziesz musiał przeciwdziałać jego strukturze. Chroni ona również nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) przed przypadkowym uszkodzeniem podczas kolejnych etapów.
- Obracaj szkiełko, aż jeden z „płatków” znajdzie się prostopadle do Twojej pozycji.
- Za pomocą pęsety pod kątem 15° delikatnie chwyć róg płatka. Róg płatka powinien stanowić rogówka, a nie siatkówka neuronalna lub RPE. Delikatnie unieś róg, pozwalając mu zachować naturalne zakrzywienie.
- Wsuń dolne ostrze nożyczek sprężynowych pomiędzy płatek a szkiełko. Ustaw nożyczki tak, aby można było wykonać pojedyncze, proste i prostopadłe cięcie od granicy rogówkowo-twardówkowej w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Tnij jak najbliżej głowy nerwu wzrokowego, unikając jednak jego przecięcia. Puść płatek, pozwalając mu opaść na szkiełko.
- Obróć szkiełko o 90°, tak aby kolejny płatek znajdował się prostopadle do Twojej pozycji. Powtórz krok 4.5.
- Powtórz kroki 4.5 i 4.6 jeszcze dwukrotnie. Powstała struktura powinna przypominać ośmiopłatkowy kwiat.
5. Usunięcie siatkówki neuronowej
- Nanieś pipetą 100-200 μL 1X PBS na preparat. Zapobiegnie to przywieraniu siatkówki neuronalnej podczas oddzielania jej od RPE.
- Zazwyczaj siatkówka neuronalna jest luźno przytwierdzona do RPE. Jednak usunięcie wyłącznie siatkówki neuronalnej, bez naruszania RPE, wymaga praktyki i wprawy. Delikatnie uchwyć fragment siatkówki neuronalnej jedną parą pęset kątowych, stabilizując (przytrzymując) resztę oka drugą parą pęset kątowych. Odsuń siatkówkę neuronalną od reszty oka. Kontynuuj tę procedurę, aż cała siatkówka neuronalna zostanie usunięta. *Wskazówka: włóż końcówkę pęsety 15° w głowę nerwu wzrokowego, aby zakotwiczyć oko. Następnie użyj pęsety 45°, aby podsunąć ją pod siatkówkę neuronalną i unieść ją do góry i na zewnątrz. Najlepiej jest unosić siatkówkę neuronalną od strony głowy nerwu wzrokowego w kierunku granicy rogówkowo-twardówkowej. Pamiętaj o usunięciu wszelkich luźnych pozostałości tęczówki. Tęczówka jest dość lepka i w przeciwnym razie może przykleić się do RPE.
- Przepłucz preparat 1X PBS. Nanieś pipetą 100-200 μL 1X PBS na preparat, a następnie go odessij. Wylej PBS. Powtarzaj czynność w razie potrzeby, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia.
6. Zamocuj preparat(y) na szkiełku
- Nanieś pipetą 80-90 μL 90% glicerolu na nowe szkiełko w kształcie prostokąta. Użyj boku końcówki pipety, aby stworzyć równomiernie rozprowadzoną, prostokątną plamę glicerolu. (Jest to procedura montażu dwóch RPE na jednym szkiełku).
- Wsuń dolne ramię pęsety 15° pod preparat. Delikatnie podnieś preparat ze szkiełka sekcyjnego.
- Powoli opuść preparat do glicerolu. Delikatnie poruszaj pęsetą, wyciągając ją spod preparatu.
- Powtórz kroki 6.1-6.3 dla drugiego preparatu.
- Obróć szkiełko tak, aby dłuższy bok był prostopadły do Twojego ciała. Trzymaj szkiełko nakrywką pod kątem 45° do szkiełka przedmiotowego, tak aby się go dotykało. Przesuwaj je w stronę plamy glicerolu, aż wejdą w kontakt. Zachowując kontakt między szkiełkiem nakrywką a przedmiotowym, powoli przesuwaj nakrywkę od plamy w stronę krawędzi szkiełka. Ustaw długie boki szkiełka przedmiotowego i nakrywki tak, aby były równoległe. Trzymaj rogi szkiełka nakrywki między kciukiem a palcem wskazującym.
- Chwyć pęsetę 15° w drugą rękę. Oprzyj górną (wolną) krawędź szkiełka nakrywki w zgięciu ramienia pęsety. Bardzo powoli opuszczaj szkiełko nakrywkę. W momencie zetknięcia szkiełka nakrywki z glicerolem zatrzymaj się i poczekaj, aż glicerol się rozprzestrzeni. Powtarzaj proces opuszczania i czekania, aż preparaty całego RPE zostaną w pełni przykryte. Ma to zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza w wysoce lepkim glicerolu. NIE NACISKAJ SZKIEŁKA NAKRYWKI – glicerol zostanie wypchnięty spod niej, co spowoduje bardzo słabą adhezję.
- Za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci zamaluj obwód w miejscu styku szkiełka nakrywki i przedmiotowego.
- Umieść szkiełko na pustym statywie w celu wyschnięcia.
7. Reprezentatywne wyniki:
Wynikiem tej procedury powinna być struktura przypominająca kwiat, która powinna być w znacznym stopniu symetryczna.
Rysunek 1. Całkowity preparat RPE z myszy szczepu C67Bl/6J typu dzikiego. RPE zwierząt o czarnym lub agouti umaszczeniu powinno mieć ciemnobrązowy kolor i gładką powierzchnię. Występowanie pofalowań w topografii płatków jest zjawiskiem normalnym. Pigmentacja poszczególnych preparatów może być zróżnicowana ze względu na różną gęstość barwnika zarówno w RPE, jak i w znajdującej się pod nim naczyniówce. Białe strzałki wskazują hipopigmentowane „kanały” – jest to zjawisko prawidłowe, wynikające z obecności naczyń krwionośnych oka. Niebieska strzałka wskazuje uszkodzenie mechaniczne RPE oraz leżącej pod nią naczyniówki.
Rysunek 2. Całkowity preparat RPE od myszy typu dilute. Okazy pobrane od zwierząt z mutacją dilute mogą mieć kolor od niemal przezroczystego do kawy z mlekiem, a każdy pojedynczy okaz prawdopodobnie wykazuje zmienność w obrębie tkanki, co zaznaczono tutaj czarnymi okręgami. Zasadniczo RPE pobrane od młodszych zwierząt są jaśniejsze, a od starszych – ciemniejsze. Czarne strzałki wskazują część leżącego poniżej unaczynienia, które wydaje się hipopigmentowane.
Rysunek 3. Barwienie falloidyną może być wykorzystane do wykrywania uszkodzeń fizycznych RPE. Barwienie falloidyną wyraźnie obrysowuje błony komórkowe, ukazując sześciokątny kształt nabłonka. (A) Przykład od czarnej myszy. (B) Przykład od myszy dilute.
Rysunek 4. Niewłaściwie wypreparowany RPE od myszy linii dilute. (A) Nawiasy wskazują zbyt szerokie brzegi rogówki, co może powodować wybrzuszenia i/lub fałdowanie. Wewnątrz czarnego koła widoczne są nadmierne ilości tkanki obcej, która nie została usunięta z tylnej części oka. Są one szczególnie widoczne, ponieważ próbka pochodzi od zwierzęcia linii dilute. Płatek w lewym dolnym rogu jest częściowo złożony. (B) Ten preparat całego organu ma wygląd wiatraczka. Czarne strzałki wskazują niektóre wykonane nacięcia. Wiele nacięć od podziału rogówkówkowo-twardówkowego w kierunku głowy nerwu wzrokowego nie pokrywa się z średnicą. (C) Czarne strzałki wskazują, w jaki sposób nacięcia powinny zostać wykonane: zgodnie z średnicą i prostopadle do stycznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
RPE jest miejscem przeprowadzania testu pun , który jest badaniem in vivo naprawy kierowanej homologią. Test pun był wykorzystywany do badania wpływu różnych uszkodzeń DNA1,2 oraz genów sygnałowych i naprawczych DNA3,4,5 na częstotliwość naprawy kierowanej homologią. Badanie to jest wysoce czułe, umożliwiając wykrywanie zdarzeń w pojedynczych komórkach RPE1. Może ono również wykrywać różnice w czasie występowania zdarzeń naprawy kierowanej...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez National Institute of Environmental Health Sciences [K22ES012264 dla A.J.R.B.] oraz grant badawczy Institutional Research Grant American Cancer Society [ACS-IRG-00-173-04] w ramach projektu pilotażowego [dla A.J.R.B.]. Dziękujemy również członkom laboratorium Bishopa za krytyczną lekturę manuskryptu oraz uwagi do filmu, a w szczególności Adamowi Brownowi za przykład tego, czego nie należy robić. Dziękujemy dr. Donaldowi McEwenowi z Greehey Children's Cancer Research Institute za umożliwienie nam skorzystania z jego zestawu składającego się z mikroskopu sekcyjnego i kamery wideo do nagrania procesu sekcji. Dziękujemy Daronowi Brownowi z Corte Instruments za naostrzenie i naprawę naszych narzędzi do mikrosekcji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| pinceta prosta | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | końcówka: .08 x .04 mm materiał: INOX |
| pinceta 45° | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | końcówka: .05 x.01 mm materiał: INOX |
| pinceta 15° "wygięta w górę" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | końcówka: .1 x.06 mm materiał: INOX |
| nożyczki sprężynowe | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | szerokość końcówki grzebieniowej 0.3mm długość ostrza 3mm materiał: stal nierdzewna |
| stereomikroskop binokularny | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | z zastosowaniem źródła światła odbitego |
| faloidyna | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
Bibliografia
- Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
- Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
- Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
- Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
- Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).
- Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
- Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
- Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt? Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
