Artykuł metodologiczny

Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

50.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2563

⸱

27 lutego 2011

 , 
1UT Health Science Center at San Antonio, Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology

W tym artykule

Podsumowanie

Formalna prezentacja sekcji oka myszy, prowadząca do uzyskania preparatu całego nabłonka barwnikowego siatkówki.

Streszczenie

Nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) znajduje się w tylnej części oka ssaków, bezpośrednio pod siatkówką nerwową, która zawiera fotoreceptory (pręciki i czopki). RPE stanowi monowarstwa pigmentowanych komórek sześcianowatych i ściśle przylega do znajdującej się powyżej siatkówki nerwowej. Ta bliskość sprawia, że RPE jest niezwykle interesujący dla badaczy zajmujących się chorobami siatkówki. RPE jest również miejscem przeprowadzania testu in vivo naprawy DNA kierowanej przez homologię, znanego jako test pun . Oko mysie jest szczególnie trudne do wypreparowania ze względu na niewielki rozmiar (około 3,5 mm średnicy) i kulisty kształt. Niniejszy artykuł szczegółowo demonstruje procedurę sekcji oka, która pozwala na uzyskanie preparatu całego nabłonka RPE. W tej procedurze pokazujemy, jak pracować z wykorzystaniem, a nie przeciwko, kulistej strukturze oka. W skrócie, z tylnej części oka usuwa się tkankę łączną, mięśnie i nerw wzrokowy. Następnie usuwa się rogówkę i soczewkę. Kolejno wykonuje się strategiczne cięcia, które prowadzą do znacznego spłaszczenia pozostałej tkanki. Na koniec delikatnie oddziela się siatkówkę nerwową, odsłaniając nienaruszony RPE, który pozostaje przytwierdzony do leżącej poniżej błony naczyniowej i twardówki. Taki preparat całego nabłonka może być wykorzystany do przeprowadzenia testu pun , a także do badań immunohistochemicznych lub immunofluorescencyjnych tkanki RPE.

Protokół

1. Usunięcie zbędnych tkanek z zewnętrznej strony oka

  1. Nalać 1X PBS do pokrywki szalki 35mm. Poziom cieczy powinien znajdować się tuż poniżej krawędzi pokrywki.
  2. Za pomocą prostych pęset przenieść oko (lub oka) z probówki do szalki 35mm. Zanurzenie oczu w PBS służy dwóm celom: 1. Obce tkanki „odpłyną” od oka, co umożliwi ich łatwe zauważenie i usunięcie, oraz 2. Podczas sekcji oko w zawiesinie naturalnie zachowa swój kulisty kształt, co pozwala na pracę zgodnie z tą formą, a nie przeciwko niej.
  3. Używając obu par pęset kątowych (45° i 15°), delikatnie usunąć jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej, odciągając tkankę przeciwnie do kierunku włókien (tj. w stronę rogówki). Część tkanki łącznej pozostanie. Należy dążyć do tego, aby jak najmniej uciskać gałkę oczną.
  4. Zamienić pęsetę 15° na nożyczki sprężynowe. Trzymając oko stabilnie pęsetą 45°, użyć nożyczek sprężynowych do wycięcia pozostałych mięśni i tkanki łącznej, a także nerwu wzrokowego. *Wskazówka: Użyć zewnętrznej krawędzi nożyczek, aby odepchnąć tkankę przeciwnie do kierunku włókien (w stronę granicy rogówkowo-twardówkowej), a następnie ją przyciąć. Kontynuować proces do momentu usunięcia wszystkich obcych tkanek z oka.

2. Usunięcie rogówki i soczewki

  1. Ustawiając rogówkę skierowaną do góry, użyj pęsety 45°, aby chwycić i unieść niewielki fałd w centrum rogówki.
  2. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj niewielkie nacięcie u podstawy fałdu. Następnie puść fałd.
  3. Unieruchamiając oko pęsetą, wprowadź dolne ostrze nożyczek do nacięcia, prostopadle do niego, i wykonaj cięcie w kierunku granicy rogówkowo-twardówkowej. Staraj się utrzymać dolne ostrze pod tęczówką, aby przeciąć zarówno rogówkę, jak i tęczówkę. Nie docinaj do samej granicy rogówkowo-twardówkowej. Pozostaw nożyczki wprowadzone do oka.
  4. Używając pęsety 45°, ostrożnie obróć oko tak, aby nożyczki były równoległe do granicy rogówkowo-twardówkowej, i wykonaj niewielkie cięcie. Powoli obróć oko o 360°, wykonując niewielkie nacięcia wokół całego obwodu. Ponownie staraj się utrzymać dolne ostrze nożyczek sprężynowych pod tęczówką, aby przeciąć zarówno tęczówkę, jak i rogówkę. Oddziel tęczówkę i rogówkę od reszty oka i je usuń.
  5. Przechyl oko na bok i delikatnie naciśnij tylną połowę gałki ocznej, aby wypchnąć soczewkę. Usuń soczewkę. Wnętrze pozostałej części oka wyściela siatkówka nerwowa, która powinna być gładka i nieprzezroczysta.

3. Podziel powstały kielich gałkowy na cztery części, tworząc strukturę przypominającą czteropłatkowy kwiat

  1. Oko należy ustawić tak, aby otwór oczodołu był prostopadły do ciała operatora. Do stabilizacji i pozycjonowania oczodołu należy użyć pęsety pod kątem 45°.
  2. Trzymając nożyczki sprężynowe przed sobą, prostopadle do ciała, należy wprowadzić dolne ostrze nożyczek w górną krawędź otwartego oczodołu. Za pomocą pęsety pod kątem 45° należy ostrożnie wyrównać oczodół tak, aby można było wykonać jedno proste cięcie od granicy rogówki i twardówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Wszystkie cięcia powinny być prostopadłe do granicy rogówki i twardówki i, o ile nie określono inaczej, powinny przebiegać jak najbliżej głowy nerwu wzrokowego, nie uszkadzając jej.
  3. Należy obrócić oczodół o 180°, zachowując jego prostopadłe ustawienie względem ciała. Stosując technikę opisaną w kroku 3.2, należy wykonać drugie cięcie prostopadłe.
  4. Należy obrócić oczodół i powtórzyć technikę opisaną w punkcie 3.2, aby wykonać dwa kolejne cięcia. Wszystkie cztery cięcia powinny być rozmieszczone pod kątem jak najbliższym 90°. Należy pamiętać, że oko nie jest idealną sferą, zatem wystąpi pewna zmienność.

4. Przetnij każdy z czterech „płatków” na pół, w wyniku czego powstanie struktura przypominająca kwiat o ośmiu płatkach

  1. Przenieś ćwiartkę gałki ocznej z płytki 35mm na czyste szkiełko. Ustawiając gałkę oczną stroną górną do góry, podważ ją pęsetą pod kątem 45°. Ostrożnie wyjmij ją z cieczy i umieść na czystym szkiełku.
  2. Używając obu par pęset kątowych, delikatnie rozchyl oko, tak aby siatkówka neuronalna była skierowana do góry. NIE USUWAJ SIATKÓWKI NEURONALNEJ – pomaga ona utrzymać kulisty kształt oka, co ułatwia pracę. Chroni ona również nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) przed przypadkowym uszkodzeniem podczas kolejnych etapów procedury.
  3. Obróć szkiełko tak, aby jeden z „płatków” znajdował się prostopadle do Twojego ciała.
  4. Używając pęsety pod kątem 15°, delikatnie chwyć róg płatka. Róg płatka powinien stanowić rogówka, a nie siatkówka neuronalna lub RPE. Delikatnie unieś róg, pozwalając mu zachować naturalne zakrzywienie.
  5. Wsuń dolne ostrze nożyczek sprężynowych pomiędzy płatek a szkiełko. Ustaw nożyczki tak, aby można było wykonać pojedyncze, proste, prostopadłe cięcie od granicy rogówkowo-twardówkowej w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Tnij jak najbliżej głowy nerwu wzrokowego, uważając, aby w nią nie wciąć. Puść płatek, pozwalając mu opaść na szkiełko.
  6. Obróć szkiełko o 90°, aby kolejny płatek znajdował się prostopadle do Twojego ciała. Powtórz krok 4.5.
  7. Powtórz kroki 4.5 i 4.6 jeszcze dwukrotnie. Powstała struktura powinna przypominać ośmiopłatkowy kwiat.

5. Usunięcie siatkówki neuronalnej

  1. Nanieś pipetą 100-200 μL 1X PBS na preparat. Zapobiegnie to przywieraniu siatkówki neuronalnej podczas oddzielania jej od RPE.
  2. Zazwyczaj siatkówka neuronalna jest luźno przytwierdzona do RPE. Jednak usunięcie wyłącznie siatkówki neuronalnej bez uszkodzenia RPE wymaga wprawy i umiejętności. Delikatnie chwyć fragment siatkówki neuronalnej jedną parą pęsety kątnej, stabilizując (dociskając) resztę oka drugą parą pęsety kątnej. Odciągnij siatkówkę neuronalną od pozostałej części oka. Kontynuuj tę procedurę, aż cała siatkówka neuronalna zostanie usunięta. *Wskazówka: wsuń końcówkę pęsety 15° w głowę nerwu wzrokowego, aby zakotwiczyć oko. Następnie użyj pęsety 45°, aby podsunąć ją pod siatkówkę neuronalną i podnieść ją do góry i na zewnątrz. Zazwyczaj najlepiej jest odrywać siatkówkę neuronalną, kierując się od głowy nerwu wzrokowego w stronę granicy rogówkowo-twardówkowej. Pamiętaj o usunięciu wszelkich luźnych resztek tęczówki. Tęczówka jest dość lepka i może w przeciwnym razie przywrzeć do RPE.
  3. Przepłucz preparat 1X PBS. Nanieś pipetą 100-200 μL 1X PBS na preparat, a następnie odessa go. Wylej PBS. Powtarzaj czynność w razie potrzeby, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia.

6. Zamocuj preparat(y) na szkiełku

  1. Nanieś pipetą 80-90 μL 90% glicerolu na nowe szkiełko przedmiotowe, formując kształt prostokąta. Użyj boku końcówki pipety, aby stworzyć równomierny, prostokątny rozmaz glicerolu. (Jest to procedura montowania dwóch preparatów RPE na jednym szkiełku).
  2. Wsuń dolne ramię pincety 15° pod preparat. Delikatnie unieś preparat ze szkiełka sekcyjnego.
  3. Powoli opuść preparat do glicerolu. Delikatnie poruszaj pincetą podczas wyciągania jej spod preparatu.
  4. Powtórz kroki 6.1-6.3 dla drugiego preparatu.
  5. Obróć szkiełko tak, aby jego dłuższy bok był prostopadły do Twojego ciała. Trzymaj szkiełko nakrywowe pod kątem 45° do szkiełka przedmiotowego, tak aby się stykały. Przesuwaj je w stronę rozmazu glicerolu, aż do momentu kontaktu. Zachowując kontakt między szkiełkiem nakrywającym a przedmiotowym, powoli przesuwaj szkiełko nakrywające w kierunku przeciwległym do rozmazu, w stronę krawędzi szkiełka. Wyrównaj długie boki szkiełka przedmiotowego i nakrywek tak, aby były równoległe. Trzymaj rogi szkiełka nakrywającego między kciukiem a palcem wskazującym.
  6. Chwyć pincetę 15° w drugą rękę. Oprzyj górną (wolną) krawędź szkiełka nakrywającego w zgięciu ramienia pincety. Bardzo powoli opuszczaj szkiełko nakrywające. W momencie kontaktu szkiełka nakrywającego z glicerolem zatrzymaj się i poczekaj, aż glicerol się rozprzestrzeni. Powtarzaj proces opuszczania i oczekiwania, aż całe preparaty RPE zostaną w pełni pokryte. Ma to na celu zapobieganie uwięzieniu pęcherzyków powietrza w bardzo lepkim glicerolu. NIE DOCISKAJ SZKIEŁKA NAKRYWAJĄCEGO – glicerol zostanie wypchnięty spod niego, co znacznie pogorszy adhezję.
  7. Za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci pomaluj obwód w miejscu styku szkiełka nakrywającego i przedmiotowego.
  8. Połóż szkiełko na pustym statywie w celu wysuszenia.

7. Reprezentatywne wyniki:

Wynikiem tej procedury powinna być struktura przypominająca kwiat, która powinna być dość symetryczna.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Preparat całego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzący od myszy szczepu C67Bl/6J typu dzikiego. RPE od zwierząt o czarnym lub agouti ubarwieniu powinno mieć ciemnobrązowy kolor i gładką powierzchnię. Naturalne jest występowanie pofalowań w topografii płatów. Pigmentacja w poszczególnych preparatach może być zmienna ze względu na różną gęstość pigmentu zarówno w RPE, jak i w znajdującej się pod nim błonie naczyniówkowej. Białe strzałki wskazują hipopigmentowane „kanały” – jest to zjawisko normalne, wynikające z obecności naczyń krwionośnych oka. Niebieska strzałka wskazuje uszkodzenie mechaniczne zarówno RPE, jak i błony naczyniówkowej.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Całokształtowy preparat RPE z myszy z rozjaśnieniem barwnika. Próbki pobrane od zwierząt z rozjaśnieniem barwnika mogą mieć kolor od niemal przezroczystego do odcienia café au lait, a każdy pojedynczy preparat może wykazywać zmienność w obrębie tkanki, zaznaczoną tutaj czarnymi okręgami. Ogólnie RPE pobrane od młodszych zwierząt są jaśniejsze, natomiast te od starszych zwierząt są ciemniejsze. Czarne strzałki wskazują część naczyniowej sieci podścielającej, która wydaje się hipopigmentowana.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Barwienie falloidyną może być wykorzystane do wykrywania uszkodzeń fizycznych RPE.Barwienie falloidyną wyraźnie obrysowuje błony komórkowe, ukazując sześciokątny kształt nabłonka. (A) Przykład z czarnej myszy. (B) Przykład z myszy dilute.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Nieprawidłowo wypreparowany RPE od myszy dilute. (A) Nawiasy wskazują zbyt szerokie marginesy rogówki, co może powodować wybrzuszenia i/lub fałdowanie. Wewnątrz czarnego okręgu widoczne są nadmierne ilości tkanek obcych, które nie zostały usunięte z tyłu oka. Są one szczególnie widoczne, ponieważ próbka pochodzi od zwierzęcia dilute. Płatek w lewym dolnym rogu jest częściowo złożony. (B) Ten preparat całego narządu ma kształt wiatraczka. Czarne strzałki wskazują niektóre wykonane cięcia. Wiele cięć od podziału rogówkowo-twardówkowego w kierunku główki nerwu wzrokowego nie przebiega wzdłuż średnicy. (C) Czarne strzałki wskazują, jak powinny być wykonane cięcia: wzdłuż średnicy i prostopadle do stycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

RPE jest miejscem przeprowadzania testu pun , który jest badaniem in vivo naprawy kierowanej homologią. Test pun był wykorzystywany do badania wpływu różnych uszkodzeń DNA1,2 oraz genów sygnałowych i naprawczych DNA3,4,5 na częstotliwość naprawy kierowanej homologią. Badanie to jest wysoce czułe, umożliwiając wykrywanie zdarzeń w pojedynczych komórkach RPE1. Może ono również wykrywać różnice w czasie występowania zdarzeń naprawy kierowanej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była finansowana przez National Institute of Environmental Health Sciences [K22ES012264 dla A.J.R.B.] oraz grant badawczy Institutional Research Grant American Cancer Society [ACS-IRG-00-173-04] w ramach projektu pilotażowego [dla A.J.R.B.]. Dziękujemy również członkom laboratorium Bishopa za krytyczną lekturę manuskryptu oraz uwagi do filmu, a w szczególności Adamowi Brownowi za przykład tego, czego nie należy robić. Dziękujemy dr. Donaldowi McEwenowi z Greehey Children's Cancer Research Institute za umożliwienie nam skorzystania z jego zestawu składającego się z mikroskopu sekcyjnego i kamery wideo do nagrania procesu sekcji. Dziękujemy Daronowi Brownowi z Corte Instruments za naostrzenie i naprawę naszych narzędzi do mikrosekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pinceta prostaRoboz Surgical Instruments Co.RS-4903końcówka: .08 x .04 mm materiał: INOX
pinceta 45°Roboz Surgical Instruments Co.RS-5005końcówka: .05 x.01 mm materiał: INOX
pinceta 15° "wygięta w górę"Roboz Surgical Instruments Co.RS-5045Akońcówka: .1 x.06 mm materiał: INOX
nożyczki sprężynoweRoboz Surgical Instruments Co.RS-5604szerokość końcówki grzebieniowej 0.3mm długość ostrza 3mm materiał: stal nierdzewna
stereomikroskop binokularnyCarl Zeiss, Inc.Discovery V.8z zastosowaniem źródła światła odbitego
faloidynaInvitrogenA22283Alexa Fluor 546

Bibliografia

  1. Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
  2. Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
  3. Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
  4. Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
  5. Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).
  6. Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
  7. Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
  8. Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt? Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja oka myszyprzygotowanie preparatu ca ego organuusuwanie siatk wki neuronalnejoddzielenie rog wki od tward wkitechnika z u yciem no yczek spr ynowychnarz dzia do mikrodisekcjiprzygotowanie szkie ka z PBSmontowanie w glicerolunak adanie szkie ka nakrywkowego

Powiązane artykuły