Niniejsza metoda opisuje generowanie organotypowych kultur móżdżku oraz wpływ określonych bodźców apoptotycznych na żywotność różnych typów komórek móżdżku.
Artykuł metodologiczny
Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Organotypowe hodowle tkanki neuronalnej zostały po raz pierwszy wprowadzone przez Hogue'a w 1947 roku 1,2 i stanowiły przełom w dziedzinie neuronauki. Od tego czasu technika ta została dalej rozwinięta i obecnie istnieje wiele różnych sposobów przygotowywania hodowli organotypowych. Metoda zaprezentowana w niniejszym opracowaniu została zaadaptowana z protokołu opisanego przez Stoppini et al. w zakresie przygotowania skrawków oraz z metody Gogolla et al. w zakresie procedury barwienia 3,4.
Wyjątkową cechą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie różnych części mózgu, takich jak hipokamp czy móżdżek, w ich oryginalnej strukturze, co stanowi znaczną zaletę w porównaniu z kulturami dysocjowanymi, w których cała organizacja komórkowa i sieci neuronalne zostają zaburzone. W przypadku móżdżku jest to jeszcze bardziej korzystne, ponieważ umożliwia badanie komórek Purkinjego, które są niezwykle trudne do uzyskania w formie dysocjowanej kultury pierwotnej. Metoda ta może być stosowana do badania określonych cech rozwojowych móżdżku in vitro, a także do eksperymentów elektrofizjologicznych i farmakologicznych zarówno u myszy typu dzikiego, jak i mutantów.
Opisana tutaj metoda została opracowana w celu zbadania wpływu bodźców apoptotycznych, takich jak ligand Fas, w rozwijającym się móżdżku, z wykorzystaniem barwienia TUNEL do pomiaru apoptycznej śmierci komórek. Jeśli barwienie TUNEL zostanie połączone z markerami specyficznymi dla danego typu komórek, takimi jak kalbindyna dla komórek Purkinjego, możliwe jest ocenienie śmierci komórek w sposób specyficzny dla danej populacji komórkowej. Barwienie na kalbindynę służy również do oceny jakości kultur móżdżku.
Protokół
1. Organotypowe hodowle móżdżku:
- Aby skutecznie wytworzyć organotypowe hodowle móżdżka, należy użyć myszy w wieku od P0-P3 lub P8-P12. W naszym eksperymencie wykorzystaliśmy myszy w przedziale P8-P12, ponieważ ten etap rozwojowy był bardziej odpowiedni dla naszego badania.
- Przygotuj zestaw do sekcji oraz pożywkę hodowlaną:
- Sekcję mózgu i przygotowanie skrawków przeprowadza się w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) o niskiej zawartości sodu, zawierającym 1mM chlorku wapnia, 10mM D-glukozy, 4mM chlorku potasu, 5mM chlorku magnezu, 26mM wodorowęglanu sodu, 246mM sacharozy oraz roztwór czerwieni fenolowej (1:100), pH 7,3. W celu sterylizacji roztworu należy przefiltrować go przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Skrawki móżdżka hoduje się w 75% Minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% inaktywowanym ciepłem surowicy konia, 25mM HEPES, 1mM glutaminy, 5mg/mL glukozy, penicyliny (10 U/mL) i streptomycyny (10 U/mL). Pożywkę należy przefiltrować przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie.
- Przeprowadź sekcję mózgu w lodowatym medium ACSF, uprzednio napowietrzonym Karbogenem (95% tlenu i 5% dwutlenku węgla). Należy pamiętać, że nasycenie Karbogenem zmieni pH roztworu, w wyniku czego jego kolor zmieni się z czerwonego na pomarańczowy. Sekcję należy przeprowadzić w jak najkrótszym czasie, uważając, aby nie uszkodzić struktury mózgu.
- Przygotuj przekroje mózgu w płaszczyźnie strzałkowej o grubości 40 μm przy użyciu wibrotomu.
- Wykonaj cięcie strzałkowe żyletką w jednej półkuli, starając się wyciąć jak najmniej z móżdżka; zapewni to płaską powierzchnię do krojenia. Kora służy jedynie jako podparcie w celu ułatwienia krojenia, ale ze względu na ograniczony czas wygodniej jest wyciąć przednią połowę kory żyletką.
- Użyj cyjanoakrylanu (Superglue), aby ustabilizować pozycję mózgu na metalowej płytce wibrotomu. Ważne jest, aby schłodzić płytkę na lodzie przed dodaniem kleju i dobrze go rozprowadzić końcówką tubki, tworząc cienką warstwę adhezyjną. W przypadku nadmiaru Superglue, odklei się on od płytki w kontakcie z ACSF, co może doprowadzić do utraty próbki.
- Po przymocowaniu mózgu do płytki wibrotomu, dodaj wystarczającą ilość medium ACSF, aby przykryć mózg, i umieść lód pod płytką, aby utrzymać niską temperaturę.
- Wytnij skrawki o grubości 40 μm i przenieś je za pomocą plastikowej pipety Pasteura (odciąć końcówkę, aby ją poszerzyć i uniknąć uszkodzenia skrawków) do 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej ACSF na lodzie.
- Oddziel móżdżek od reszty mózgu za pomocą dwóch strzykawek insulinowych (strzykawki z cienkimi igłami 28G) pod mikroskopem sekcyjnym. Niektóre skrawki mogą mieć przyczepiony do krawędzi Superglue: jest to moment, w którym należy spróbować go usunąć, ponieważ może on wpływać na żywotność skrawka. Operację tę należy przeprowadzić ostrożnie, aby nie uszkodzić struktury móżdżku.
- Przenieś skrawki móżdżku do płytek 6-dołkowych zawierających wkładki do płytek hodowlanych o średnicy 30 mm z porami 0,4 μm. Do każdego dołka dodaj 1 mL pożywki hodowlanej, która została wcześniej przygotowana poprzez inkubację przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2 (w inkubatorze do hodowli komórek). Umieść wkładki na powierzchni pożywki, upewniając się, że pod nimi nie uwięzły pęcherzyki powietrza, a następnie umieść na wkładkach skrawki móżdżku (1-3 na wkładkę), dbając o to, aby były całkowicie rozwinięte i nie były przykryte cieczą. W razie potrzeby odessaj nadmiar pożywki. Inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO2, wymieniając pożywkę co 2 lub 3 dni. Zaleca się wymianę tylko części pożywki (np. ½ objętości) za jednym razem, ponieważ zużyte medium zawiera pochodne z tkanek czynniki troficzne, które są ważne dla przetrwania komórek.
2. Obróbka Fas i barwienie skrawków móżdżku:
- W eksperymencie z wywoływaniem apoptozy najpierw hodujemy skrawki przez 5 dni, zmieniając medium w 3. dobie in vitro (DIV3). W dniu DIV5 hodowle traktujemy 0,5 μg/mL przeciwciała Jo2 (agonistą Fas), dodając je bezpośrednio do medium, aby uzyskać czyste tło śmierci komórkowej, ponieważ wymiana mediów może indukować pewną śmiertelność w hodowlach. Połowę dołków pozostawiamy niepotraktowanych jako kontrolę.
- Po 24 godzinach usuwamy medium spod wkładkek za pomocą odsysania. Aby utrwalić skrawki, dodajemy 1 mL lodowatego 4% PFA pod wkładkę i 1 mL powyżej wkładki. Inkubujemy przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Po 10 minutach usuwamy PFA i krótko płuczemy zimnym PBS.
- Następnie usuwamy PBS i dodajemy 1 mL pod wkładkę i 1 mL powyżej wkładki 20% lodowatego metanolu w PBS i inkubujemy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Ponownie płuczemy PBS i dodajemy 1 mL pod wkładkę i 1 mL powyżej wkładki 0,5% Triton-X-10 w PBS w celu permeabilizacji. Inkubujemy przez minimum 12 godzin w 4°C.
- Po permeabilizacji blokujemy 20% BSA w PBS przez minimum 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C. Na tym etapie skrawki można przechowywać w roztworze blokującym przez co najmniej 3 dni w 4°C.
- Aby zbarwić skrawki, ostrożnie wycinamy fragment membrany wkładki przytwierdzonej do skrawka móżdżka i przenosimy go na płytki 24-dołkowe zawierające PBS.
- Immunobarwienie wykonuje się sekwencyjnie, najpierw odczynnikiem TUNEL przez jedną godzinę, a następnie przeciwciałem przeciwko kalbindynie przez noc.
- Odsysamy PBS i dodajemy 250 μL odczynnika TUNEL do każdego dołka, upewniając się, że pokrywa on całą powierzchnię skrawka. Inkubujemy w 37°C przez jedną godzinę w ciemności.
- Po godzinie usuwamy mieszankę TUNEL i płuczemy PBS trzy razy po 10 minut.
- Po ostatnim płukaniu usuwamy PBS i dodajemy 250 μL rozcieńczenia 1/10 przeciwciała przeciwko kalbindynie w PBS i inkubujemy przez noc w 4°C w ciemności.
- Usuwamy roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i płuczemy PBS trzy razy po 10 minut.
- Dodajemy 250 μL przeciwciała wtórnego rozcieńczonego 1/50 w PBS i inkubujemy przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Użyty przez nas zestaw TUNEL jest znakowany TMR red, dlatego nasze przeciwciało wtórne dla kalbindyny jest sprzężone z Alexa-48.
- Płuczemy trzy razy po 10 minut PBS i montujemy skrawki na szklanym preparacie mikroskopowym, używając medium montażowego zawierającego DAPI.
- Wykonujemy obrazowanie skrawków za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając długości fal wzbudzenia 48 nm dla kalbindyny i 561 nm dla TUNEL.
3. Reprezentatywne wyniki:
Głównym wyzwaniem w tym protokole jest możliwość wytworzenia zdrowych kultur przekrojów móżdżku, zwłaszcza że końcowym odczytem będzie śmierć komórkowa. Zdrowa kultura charakteryzuje się półprzezroczystą warstwą ciał komórkowych, co pozwala na obserwację liściastej struktury móżdżku pod mikroskopem (Rycina 1). Po kilku dniach hodowli przekroje zaczynają cieńczeć, a komórki nie-neuronalne mogą migrować poza krawędzie przekroju. Ciemne, okrągłe komórki (najprawdopodobniej makrofagi), które pokrywają przekroje po kilku dniach hodowli, ostatecznie zmniejszą swoją liczebność po 10-14 dniach in vitro (Rycina 2) 5. Ostatecznym dowodem żywotności przekrojów jest barwienie na różne markery komórkowe, takie jak kalbindyna dla komórek Purkinjego. Rycina 3 przedstawia reprezentatywny obraz z mikroskopu konfokalnego warstwy komórek Purkinjego z kilkoma jądrami dodatnimi w teście TUNEL.
Należy wziąć pod uwagę, że nawet jeśli niektóre skrawki poddano stymulacji apoptotycznej, ekspozycja trwała jedynie 24 godziny. Pozwoliło to na wystarczający czas do zaobserwowania fragmentacji DNA w obumierających komórkach za pomocą barwienia TUNEL, jednak wciąż obecna była wyraźna warstwa komórek Purkinjego.
Rysunek 1. Zdrowy skrawek móżdżku w 2. dobie in vitro (DIV2). Na tym obrazie widoczna jest półprzezroczysta warstwa ciał komórek oraz liściasta struktura móżdżku w zdrowym preparacie.
Rysunek 2. Zdrowy skrawek móżdżku w 7. dniu in vitro (DIV 7). Na tym obrazie wciąż można zaobserwować listkowatą strukturę móżdżku oraz ciemne ciała komórkowe.
Rycina 3. Reprezentatywny obraz skrawka móżdżku poddanego działaniu Fas. Ten obraz konfokalny przedstawia komórki Purkinjego zabarwione kalbindyną (kolor zielony) oraz komórki apoptotyczne wykazujące pozytywny wynik w barwieniu TUNEL (kolor czerwony). Komórki Purkinjego nie tworzą pojedynczego rzędu, lecz są skupione, tworząc strukturę przypominającą listek móżdżku.
Dyskusja
Metoda ta opisuje jedno z wielu możliwych zastosowań neuronalnych kultur organotypowych i pozwoliła nam na zbadanie wpływu bodźców apoptotycznych w plastrach móżdżka typu dzikiego oraz mutantach.
Najbardziej krytyczną częścią tego eksperymentu jest zdolność do spójnego generowania zdrowych kultur plastrów móżdżku. Kluczowymi czynnikami są technika sekcji i krojenia oraz umiejętność przeprowadzenia protokołu w jak najkrótszym czasie, przy jednoczesnym zachowaniu ostrożności, aby nie uszkodzić plastrów. Innym kluczowym czynnikiem jest przygotowanie i skład pożywek hodowlanych; kultury te są bardzo wrażliwe, dlatego musieliśmy przetestować kilka receptur i marek pożywek. Nawet różne partie surowicy lub wszelkie inne składniki pożywek mogły wpłynąć na żywotność plastrów. Najlepsze wyniki uzyskaliśmy stosując Horse Serum firmy Invitrogen, partia nr 480116.
Po przygotowaniu skrawków móżdżku można badać rozwój móżdżku, elektrofizjologię, przeżywalność komórek samodzielnie lub w odpowiedzi na bodźce apoptotyczne, ekscytotoksyczność lub deprywację tlenu. Badania porównawcze z wykorzystaniem skrawków móżdżku typu dzikiego oraz mutantów dostarczyły cennych informacji na temat wielu aspektów funkcji i rozwoju móżdżku.
Oświadczenia
Wszystkie prace z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami ustalonymi przez IACUC. Instytut Salka jest placówką akredytowaną przez AAALAC.
Podziękowania
Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez Fundację IPSEN. IMV jest profesorem biologii molekularnej w American Cancer Society i piastuje stanowisko Irwin and Joan Jacobs Chair in Exemplary Life Sciences. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z NIH, Fundacji Leducq, Fundacji Meriaux, Ellison Medical Foundation, Ipsen/Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation oraz Fundacji H.N. and Frances C. Berger. PAS jest finansowany przez McKnight Endowment Fund for Neuroscience oraz National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Autorzy chcieliby podziękować Markowi Schmittowi. Oprawa graficzna została opracowana przez Jamie T. Simona. Sponsoring został uprzejmie zapewniony przez firmę Invitrogen.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Surowica konia | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamina | Invitrogen | 25030 | |
| Penicylina/ Streptomycyna | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| Płytki do hodowli komórek 6-dołkowe / 24-dołkowe | Corning | 3506/ 3527 | |
| Wkładki do płytek hodowlanych 30 mm (pory 0,4-μm) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Oczyszczone przeciwciało chomikie anty-mysie CD95 (Jo2) NA/LE | BD Biosciences | 554254 | |
| Zestaw do detekcji śmierci komórek In situ, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Królicze przeciwciało anty-Kalbindyna D-28k | Swant | CB-38a | |
| Wtórne przeciwciało kozie anty-królicze IgG Alexa 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Medium montażowe Vectashield z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Mikroskop sekcyjny | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wibratom | Leica Microsystems | ||
| Mikroskop konfokalny | Leica Microsystems |
Bibliografia
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
Przedruki i uprawnienia
