Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa

Podsumowanie

Metoda FRAP była wykorzystywana do ilościowego określania mobilności białek znakowanych zieloną białko fluorescencyjnym (GFP) w hodowlach komórkowych. Zbadaliśmy frakcje mobilne i niemobilne GFP, analizując procent odzysku fluorescencji po fotowybielaniu. W niniejszym badaniu FRAP przeprowadzono w kolcach dendrytycznych neuronów hipokampa.

Streszczenie

Metoda FRAP jest wykorzystywana do ilościowego określania mobilności białek znakowanych GFP. Przy użyciu silnego lasera wzbudzającego dochodzi do wybielenia fluorescencji białka znakowanego GFP w obszarze zainteresowania. Fluorescencja w tym obszarze powraca, gdy niezawybielone białko znakowane GFP z zewnątrz dyfunduje do obszaru zainteresowania. Mobilność białka jest następnie analizowana poprzez pomiar szybkości powrotu fluorescencji. Technika ta może być stosowana do charakteryzacji mobilności białek oraz szybkości ich wymiany.

W niniejszym badaniu wykazujemy ekspresję wektora (ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego) EGFP w hodowlach neuronów hipokampa. Przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss 710 przeprowadzamy fotowybielanie sygnału fluorescencji białka GFP w pojedynczym kolcu dendrytycznym, a następnie wykonujemy obrazy w odstępach czasowych (time-lapse), aby zarejestrować powrót fluorescencji po fotowybielaniu. Na koniec szacujemy procentowy udział frakcji mobilnej i nieruchomej GFP w kolcach, analizując dane obrazowe za pomocą oprogramowania ImageJ oraz Graphpad.

Niniejszy protokół FRAP przedstawia sposób przeprowadzenia podstawowego eksperymentu FRAP, a także metodę analizy uzyskanych danych.

Protokół

1. Transfekcja neuronów

1. Hodować neurony hipokampa szczura z 18. dnia embrionalnego (E18) na naczyniach szklanych MatTek o średnicy 35 mm pokrytych poli-d-lizyną¹. W dniach 16-18 in vitro (DIV) przeprowadzić transfekcję neuronów przy użyciu zestawu Clontech CalPhos Mammalian Transfection Kit. Najpierw, na 0,5 godziny przed transfekcją, zastąpić medium hodowlane 1,5 ml podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) na każde naczynie o średnicy 35 mm. Oryginalne medium hodowlane zachować w sterylnej probówce 15 ml do późniejszego zastosowania (krok 1.6).
2. Wymieszać 10 μg plazmidowego DNA pEGFP-N1 ze sterylną wodą H₂O (Clontech) oraz 12,4 μl 2 M roztworu wapnia (Clontech) do uzyskania całkowitej objętości 100 μl.
3. Mieszaninę z kroku 1.2 dodawać kroplami do 100 μl 2×HBS podczas mieszania 2×HBS w wirówce vorteksowej z umiarkowaną prędkością.
4. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 20 minut, a następnie dodać końcową mieszaninę z kroku 1.3 do neuronów inkubowanych w DMEM.
5. Przenieść neurony z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C na 1-1,5 godziny.
6. Usunąć medium zawierające fosforan wapnia, a następnie trzykrotnie przemyć komórki podłożem DMEM. Przed ponownym umieszczeniem naczynia hodowlanego w inkubatorze, wymienić podłoże DMEM na oryginalne medium hodowlane.

2. Eksperyment FRAP na kolcu dendrytycznym

1. Do eksperymentu FRAP wykorzystuje się neurony od dwóch do czterech dni po transfekcji.
2. Wymień pożywkę w szalkach z szklanym dnem o średnicy 35 mm, dodając natychmiast uprzednio ogrzany roztwór Tyrode'a, który zawiera (w mM) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, glukozę 10, glicynę 0,005, CaCl₂ 2,6 oraz MgCl₂ 1,3 (pH dostosowane do 7,4 za pomocą NaOH).
3. Do eksperymentu FRAP wykorzystuje się konfokalny mikroskop Zeiss LSM 710. System Zeiss TempModule służy do kontroli temperatury (37°C), wilgotności i stężenia CO₂ (5%) w układzie roboczym. Upewnij się, że butla z CO₂ jest podłączona, a butelka z wodą, służąca do stabilizacji wilgotności, jest pełna.
4. Za pomocą obiektywu 100× (αplan-APOCHROMAT 100×/1,46 oil) zlokalizuj dojrzały,y transfekowany dendryt. Jeśli transfekowane komórki w szalce są rzadkie, wyszukaj odpowiednią komórkę za pomocą obiektywu 40× (plan-NEOFLUAR 40×/1,3 oil), a następnie przełącz na obiektyw 100× w celu wykonania obrazowania.
5. Użyj 5-krotnego zoomu optycznego oraz rozdzielczości 256×256 pikseli, aby zobrazować krótki odcinek dendrytu z kilkoma kolcami. Do przechwytywania obrazów użyj prędkości nominalnej 9 (czas przebywania piksela 3,15 μsec), co pozwala na zakończenie skanowania w 0,5 sekundy. Pinhole ustawiono na 2μm w celu uzyskania silnej fluorescencji. Podczas obrazowania staraj się stosować niską transmisję lasera, np. 1-5%, aby uniknąć fotobleachingu całego obrazu.
6. Wybierz interesujący Cię kolce. W naszym eksperymencie wybieramy kolce grzybowate o średnicy główki ok. 1 μm.
7. Aby przeprowadzić eksperyment FRAP, wykonaj 5 obrazów kontrolnych przed wybielaniem, następnie wybiel wybrany kolce 10-krotnie przy nominalnej 100% transmisji lasera [moc lasera argonowego wynosi 30 mW, z czego 50% (15 mW) przypada na linię lasera 488, a do mikroskopu dociera około 3-4 mW przez linię lasera 488], a następnie wykonaj serię obrazów bezpośrednio po wybielaniu. W tym eksperymencie obrazy są przechwytywane co 1 sekundę przez 15 sekund po wybielaniu. Przedział czasowy należy dostosować do różnych białek docelowych i różnych projektów eksperymentalnych (Rys. 1).
8. Zapisz obrazy.

3. Analiza danych

1. Otwórz obrazy w programie ImageJ.
2. Wyrównaj stos obrazów za pomocą narzędzia do wyrównywania ('plugins' →'stacks - shuffling' →'align slices in stack' →'translation' i/lub 'rigid body') w ImageJ, tak aby analizowana kolca nie „pływała”, innymi słowy – aby pozostawała w tej samej pozycji na obrazie.
3. Zmierz względną intensywność fluorescencji analizowanej kolca (F_s), regionu przetransfekowanego, ale niewybielonego (kontrola) oraz regionu tła (F_b) na obrazach z serii czasowej, korzystając z narzędzia 'Intensity v Time Monitor' w ImageJ ('plugins' →'stacks - shuffling' →'Intensity v Time Monitor'). Region kontrolny może stanowić fragment dobrze ostrzonego dystalnego dendrytu. Region tła to obszar niefluorescencyjny.
4. Oblicz szybkość fotowybielania (r), porównując fluorescencję regionu kontrolnego przed (F_c0) i po (F_c) fotowybielaniu.
   r = F_c/F_c0.
5. Znormalizuj intensywność fluorescencji docelowej kolca (F) w następujący sposób:
   F = (F_s - F_b) / r.
6. Dopasuj krzywą intensywności fluorescencji docelowej kolca za pomocą jednofazowego równania wykładniczego w programie Graphpad Prism (Rys. 2) lub innym podobnym oprogramowaniu.
7. Oblicz frakcję mobilną (f_m) i frakcję niemobilną (f_i) za pomocą następujących równań:
   f_m = F_∞/ F_0,
   gdzie F_∞ to intensywność fluorescencji po pełnym powrocie, a F₀ to intensywność fluorescencji przed fotowybielaniem.
   f_i = 1 - f_m.

4. Reprezentatywne wyniki:

W niniejszym badaniu przeprowadzamy eksperyment FRAP na dojrzałych neuronach hipokampa. W 18-22 DIV utworzone są już kolce grzybiaste. Dzięki zastosowaniu naszej metody można rejestrować dynamiczne zmiany natężenia fluorescencji w małym obszarze, takim jak kolce dendrytyczne.

Aby przeanalizować proces odzyskiwania fluorescencji EGFP, wykonujemy 5 obrazów kontrolnych przed wybielaniem, a następnie 1 obraz co 1 sekundę bezpośrednio po wybielaniu przez 15 sekund. Rozdzielczość obrazu jest wystarczająca do analizy ilościowej. Profile odzyskiwania fluorescencji znakowanych białek fluorescencyjnych są wysoce powtarzalne.

Krótko przedstawiamy również sposób określania frakcji mobilnej i niemobilnej białka fluorescencyjnego przy użyciu oprogramowania ImageJ oraz Graphpad Prism. Metoda FRAP i analiza zaprezentowana w tym materiale mogą znaleźć szerokie zastosowanie w neuronauce, biologii komórki oraz innych badaniach.

Rysunek 1. Pomiary FRAP fluorescencji EGFP w kolcu hodowanego neuronu hipokampa. Czerwone groty strzałek wskazują czas fotobleakingu. Zdjęcia przedstawiają ten sam obszar przed (Pre) oraz w 0, 1, 5, 10, 15 sekundach po fotobleakingu. Obszar kolca, kontrola i tło są oznaczone odpowiednio literami S, C i B. Neurony były utrzymywane w temperaturze 37°C podczas eksperymentu. Pasek skali, 1 μm.

Rysunek 2. Krzywe FRAP fluorescencji EGFP w okresie 15 sekund. Linia zielona przedstawia krzywą oryginalną; linia czerwona przedstawia krzywą znormalizowaną. Punkty na krzywych wskazują pomiary FRAP co 1 s. Krzywe zostały dopasowane za pomocą jednofazowych równań wykładniczych. Średnią fluorescencję przed fotowybielaniem przyjęto za 100%. W tym doświadczeniu frakcja ruchoma (MF) wynosi 94%, a frakcja nieruchoma (IF) 6%.

Dyskusja

Analiza FRAP jest szeroko stosowana w badaniach in vivo oraz in vitro^1-2. Technika ta powszechnie wykorzystuje białka fuzyjne GFP, choć mogą być również stosowane białka fuzyjne z czerwonych alg³. Analiza ta jest czuła i może być wykorzystana do charakteryzowania mobilności białek znakowanych GFP.

Aby uzyskać wiarygodną analizę FRAP, należy unikać niepotrzebnego fotoblaknięcia przed i w trakcie eksperymentu FRAP. Można to osiągnąć na dwa sposoby. Po pierwsze, proces wyszukiwania i obserwacji badanego neuronu powinien być szybki. W szczególności długotrwała obserwacja neuronów przy użyciu obiektywu 100X powoduje znaczne wyblaknięcie fluorescencji. Po drugie, wysoka moc lasera oraz częste skanowanie często zwiększają prawdopodobieństwo fotoblaknięcia. W związku z tym konieczne będzie obliczenie szybkości fotoblaknięcia w obszarze kontrolnym, a następnie normalizacja krzywej FRAP w obszarze badawczym. Metoda normalizacji została opisana w protokole (szczegóły w krokach 3.3-3.5).

Etap fotowybielania jest również krytyczny dla zapewnienia dobrych wyników FRAP. W tym eksperymencie wybielamy interesującą nas kolbę dendrytyczną 10 razy przy 100% transmitancji lasera. Warunek ten jest wystarczający, aby wybielić fluorescencję kolby do poziomu tła w preparacie utrwalonym. W związku z tym ustawiamy intensywność fluorescencji na tę samą wartość, co tło w 0 sekundach po fotowybielaniu. W zależności od prędkości pierwszego skanu, w przypadku białek o wysokiej mobilności, może zostać wykryty już znaczny stopień powrotu fluorescencji.

W celu badania dynamiki białek za pomocą techniki FRAP opracowano wiele fluorescencyjnych sond białkowych. Podejściem komplementarnym jest na przykład zastosowanie fotoaktywnego białka GFP (PA-GFP) lub jego fotokonwertowalnych wariantów. Wraz z techniką FRAP narzędzia te stają się niezastąpione w badaniach obrazowania żywych komórek^4-6.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szalki z szklanym dnem 35 mm	MatTek Corp.	P35GC-1.0-14-C
Zestaw do transfekcji ssaczych CalPhos Mammalian Transfection Kit	Clontech Laboratories	631312
plazmid pEGFP-N1	Clontech Laboratories	6085-1
konfokalny mikroskop Zeiss	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710
system Zeiss TempModule	Carl Zeiss, Inc.	N.A.
oprogramowanie ImageJ	National Institutes of Health	N.A.
oprogramowanie Graphpad Prism	GraphPad Software Inc.	N.A.