Artykuł metodologiczny

Metodologia pobierania krwi z opuszki palca w celu określenia apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym

DOI:

10.3791/2595

⸱

24 lutego 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology, Recreation, and Sport, Western Kentucky University, 2Department of Health and Human Performance, University of Houston

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ćwiczenia są w stanie wywołać apoptozę w komórkach odpornościowych. Istnieją różne ograniczenia pomiarowe, w szczególności dotyczące czasu wymaganego do wyizolowania i leczenia próbki krwi przed oceną. Zademonstrowano szybką i minimalnie inwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ćwiczenie jest bodźcem fizjologicznym zdolnym do wywołania apoptozy w komórkach odpornościowych. Do tej pory zidentyfikowano różne ograniczenia w pomiarze tego zjawiska, w szczególności w odniesieniu do czasu wymaganego do wyizolowania i poddania działaniu substancji chemicznej przed oceną śmierci komórki. Z tego powodu trudno jest określić, czy zgłoszony wzrost apoptozy komórek odpornościowych może być spowodowany faktycznym wpływem ćwiczeń na system, czy też jest odzwierciedleniem czasu i przetwarzania niezbędnego do ostatecznego uzyskania tego pomiaru. W tym artykule przedstawiono szybką i małoinwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym. W przeciwieństwie do innych technik, krew pełną dodaje się do panelu przeciwciał natychmiast po uzyskaniu próbki. Po okresie inkubacji czerwone krwinki są poddawane lizie, a próbki są gotowe do analizy. Zastosowanie procedury pobierania próbek z opuszki palca zmniejsza wymaganą objętość krwi i minimalizuje dyskomfort u badanych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie próbek krwi z palca

  1. Pobieranie krwi pełnej jest zwykle pobierane w spoczynku w celu pomiaru wyjściowego (zwykle po 10-15 minutach odpoczynku w pozycji siedzącej), podczas lub bezpośrednio po treningu oraz przez cały okres po wysiłku (zwykle od 1 do 3 godzin po zaprzestaniu ćwiczeń).
  2. Stosując uniwersalne środki ostrożności, najpierw wysterylizuj opuszek palca 70% alkoholem izopropylowym.
  3. Następnie nakłuj miejsce za pomocą automatycznego lancetu lub podobnego urządzenia. Chociaż używamy lancetu o rozmiarze 30, aby zapewnić komfort obiektu, można użyć igły o większej średnicy.
  4. Zetrzyj pierwszą kroplę krwi, a następnie zbierz krew do kapilar lub mikrowetek potraktowanych heparyną litową, aby zapobiec krzepnięciu.

2. Fenotypowanie komórek i barwienie apoptozy

  1. Dodać 10 μl heparynizowanej krwi pełnej do panelu przeciwciał miareczkowanych w 250 μl buforu wiążącego (patrz schemat tabeli 1). Z powodzeniem zastosowaliśmy współczynnik rozcieńczenia 1:20, ale każde laboratorium powinno mianować swoje odczynniki, aby określić najlepszy roztwór roboczy.
    Tabela 1. Panel przeciwciał do oznaczania apoptozy wywołanej wysiłkiem fizycznym w podzbiorach leukocytów. Wczesna apoptoza została zdefiniowana przez ekspresję aneksyny V, podczas gdy późna apoptoza została zdefiniowana przez podwójnie dodatnie znakowanie aneksyną V i 7-AAD. Komórki martwicze były tylko komórkami aneksyny V i 7-AAD+.
    Rura 1 Rura 2 Rura 3 Rura 4 Rurka tylko ogniwa Załącznik V – FITC Załącznik V – FITC Załącznik V – FITC   Anty Ludzki CD4 - PE Anty Ludzki CD8 - PE Anty Ludzki CD19 - PE   7-AAD 7-AAD 7-AAD   Anty Human CD45RA - APC Anty Human CD45RA - APC  
    7-AAD = 7-amino-aktynomycyna D, APC = allofikocyjanina, CD4 = limfocyty T pomocnicze, CD8 = limfocyty T-supresorowe/cytotoksyczne, CD19 = limfocyty B, CD45RA = podzbiory komórek naiwnych, FITC = izotiocyjanian fluoresceiny, PE = fikoerytryna.
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
  3. Wirować przy 1075 x g przez 5-10 minut.
  4. Zdekantować, dodać 300 μl buforu do lizy czerwonych krwinek i dokładnie odwirować.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  6. Dodać 300 μl PBS, aby zatrzymać reakcję lizy RBC.
  7. Wirować przy 1075 x g przez 5-10 minut.
  8. Zdekantować, zawiesić i dodać 50 μl buforu wiążącego.
  9. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej.

Zaleca się, aby przynajmniej zastosować następujące kontrole: probówkę tylko komórek, która służy jako kontrola negatywna w wykrywaniu autofluorescencji tła, oraz probówki zawierające każdy pojedynczy fluorochrom do ustawiania kompensacji podczas początkowej konfiguracji cytometru przepływowego. Ponadto z powodzeniem użyliśmy standardowych koralików kompensacyjnych do skonfigurowania naszych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minimalnie inwazyjna procedura pobierania próbek i późniejsza analiza są demonstrowane do analizy zarówno wczesnych, jak i późnych faz apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym. Możliwe jest również wyraźne wykluczenie tych komórek, które są nekrotyczne, a nie apoptotyczne. Procedura ta przezwycięża wady i dyskomfort związany z inwazyjnym nakłuciem żyły z okolicy łokciowej w wielu punktach czasowych przed, w trakcie i bezpośrednio po wysiłku lub zabezpieczeniu cewnika na czas trwania wysiłku. Jeśli chodzi o badac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało wsparte przez Nowy Grant Wydziałowy od Wydziałowej Rady Stypendialnej na Uniwersytecie Western Kentucky.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor wiążący cytometrię przepływowąeBioscience00-4222-26
501
WirówkaGmC Lab Gilson, Inc.PMS-880
Aneksin V-FITC SprzężonaBiowizja Inc.K201-400-1
CD4-PE Sprzężonyanty-ludzki, klon RPA-T4eBioscience12-0049-42
CD8-PE Sprzężonyanty-ludzki, klon OKT8eBioscience12-0086-73
CD19-PE Sprzężonyanty-człowiek, klon HIB19eBioscience12-0199-42
7-AAD RoztwóreBioscience00-6993-50
CD45RA-APC Sprzężonyanty-ludzki, klon HI100eBioscience17-0458-42
Cytometr przepływowyC6Accuri
Bufor do lizy RBC eBioscience 00-4333-57 Lancet Device Accu Check Soft Touch Rurki kapilarne Roche Group Heparynizowane rurki kapilarne Chase Scientific Glass, Inc. do barwienia żywotności

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
  2. Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
  3. Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
  4. Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
  5. Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
  6. Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
  7. Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowalizowanie erytrocyt wbarwienie aneksyn Vapoptoza indukowana wysi kiemanaliza krwi pe nejsubfrakcje limfocyt wpobieranie krwi do kapilarinkubacja z panelem przeciwcia

Powiązane artykuły