Wysiłek fizyczny może indukować apoptozę w komórkach odpornościowych. Istnieją różne ograniczenia pomiarowe, szczególnie w odniesieniu do czasu wymaganego na izolację i przygotowanie próbki krwi przed przeprowadzeniem oceny. Przedstawiono szybką i małoinwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metodyka pobierania krwi z palca w celu oznaczenia apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ćwiczenia fizyczne są bodźcem fizjologicznym zdolnym do indukowania apoptozy w komórkach odpornościowych. Do tej pory zidentyfikowano szereg ograniczeń w pomiarze tego zjawiska, szczególnie w odniesieniu do czasu wymaganego do izolacji i przygotowania próbki krwi przed oceną śmierci komórkowej. Z tego powodu trudno jest ustalić, czy zgłaszane zwiększenie apoptozy komórek odpornościowych wynika z rzeczywistego wpływu wysiłku fizycznego na organizm, czy jest odzwierciedleniem czasu i procesów niezbędnych do przeprowadzenia tego pomiaru. W niniejszym artykule prezentujemy szybką i małoinwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym. W przeciwieństwie do innych technik, krew pełną dodaje się do panelu przeciwciał natychmiast po pobraniu próbki. Po okresie inkubacji erytrocyty ulegają lizie, a próbki są gotowe do analizy. Zastosowanie procedury pobierania krwi z palca zmniejsza objętość wymaganej krwi i minimalizuje dyskomfort badanego.
Protokół
1. Pobieranie krwi z palca
- Pobieranie krwi pełnej zazwyczaj przeprowadza się w spoczynku w celu uzyskania pomiaru bazowego (zazwyczaj po 10–15 min odpoczynku w pozycji siedzącej), w trakcie lub bezpośrednio po wysiłku fizycznym oraz w okresie po wysiłku (zazwyczaj od 1 do 3 godzin po zakończeniu ćwiczeń).
- Stosując uniwersalne środki ostrożności, należy najpierw zdezynfekować opuszkę palca 70% alkoholem izopropylowym.
- Następnie nakłuć miejsce pobrania za pomocą automatycznego lancetu lub urządzenia o podobnym działaniu. W celu zapewnienia komfortu badanemu stosujemy lancet o rozmiarze 30G, jednak można użyć igły o większym rozmiarze.
- Przetrzeć pierwszą kroplę krwi, a następnie pobrać krew do kapilar lub mikrowet kuchennych z dodatkiem heparyny litowej w celu zapobiegania krzepnięciu.
2. Fenotypowanie komórek i barwienie na apoptozę
- Do miareczkowanego panelu przeciwciał w 250 μL buforu wiążącego dodać 10 μL heparynowanej krwi pełnej (patrz schemat w tabeli 1). Z powodzeniem zastosowano czynnik rozcieńczenia 1:20, jednak każde laboratorium powinno zmiareczkować odczynniki, aby ustalić optymalny roztwór roboczy.
Tabela 1. Panel przeciwciał do oznaczania apoptozy indukowanej wysiłkiem w subpopulacjach leukocytów. Wczesną apoptozę definiowano poprzez ekspresję Annexin V, natomiast późną apoptozę poprzez podwójne znakowanie Annexin V i 7-AAD. Komórki nekrotyczne to wyłącznie komórki Annexin V- i 7-AAD+.
Probówka 1 Probówka 2 Probówka 3 Probówka 4 Probówka z samymi komórkami Annexin V - FITC Annexin V - FITC Annexin V - FITC Anti Human CD4 - PE Anti Human CD8 - PE Anti Human CD19 - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD Anti Human CD45RA - APC Anti Human CD45RA - APC
7-AAD = 7-aminoaktynominyna D, APC = allofikocyjanina, CD4 = limfocyty T pomocnicze, CD8 = limfocyty T supresoryjne/cytotoksyczne, CD19 = limfocyty B, CD45RA = naiwne subpopulacje komórek, FITC = izotiocyjanian fluoresceiny, PE = fikoerytryna. - Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
- Wirować przy 1075 x g przez 5-10 minut.
- Zlać nadsącz, dodać 300 μL buforu do lizy erytrocytów i dokładnie wymieszać na wortexie.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Dodać 300 μL PBS, aby zatrzymać reakcję lizy erytrocytów.
- Wirować przy 1075 x g przez 5-10 minut.
- Zlać nadsącz, ustawić w statywie i dodać 50 μL buforu wiążącego.
- Analizować za pomocą cytometrii przepływowej.
Zaleca się zastosowanie co najmniej następujących kontroli: probówki zawierającej wyłącznie komórki jako kontroli negatywnej w celu wykrycia tła autofluorescencji oraz probówek zawierających każdy z fluorochromów osobno w celu ustawienia kompensacji podczas wstępnej konfiguracji cytometru przepływowego. Dodatkowo, do przygotowania naszych eksperymentów z sukcesem wykorzystaliśmy standardowe kulek kompensacyjne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiono małoinwazyjną procedurę pobierania próbek i późniejszej analizy w celu badania zarówno wczesnej, jak i późnej fazy apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym. Możliwe jest również wyraźne wykluczenie komórek nekrotycznych, które nie wykazują cech apoptozy. Procedura ta eliminuje wady i dyskomfort związane z inwazyjnym nakłuciem żył w regionie łokciowym w wielu punktach czasowych przed, w trakcie i bezpośrednio po wysiłku, a także konieczność zakładania cewnika na cały czas trwania sesji ćwiczeń. Z ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania te zostały sfinansowane z grantu dla nowej kadry naukowej (New Faculty Grant) przyznanego przez Radę Stypendialną Wydziału (Faculty Scholarship Council) na Western Kentucky University.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Bufor wiążący do cytometrii przepływowej | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| Bufor do lizy erytrocytów (RBC) | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Nakłuwacz | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Kapilary | Kapilary heparynowane | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Wirówka | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Aneksyna V sprzężona z FITC | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4 sprzężone z PE | Przeciwciało antyludzkie, klon RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8 sprzężone z PE | Przeciwciało antyludzkie, klon OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19 sprzężone z PE | Przeciwciało antyludzkie, klon HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| Roztwór do barwienia żywotności 7-AAD | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA sprzężone z APC | Przeciwciało antyludzkie, klon HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Cytometr przepływowy | C6 | Accuri |
Bibliografia
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
