Zmodyfikowany test apoptozy jodku aneksyny V/propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórki

Ta procedura może być wykonana w probówkach silikonowanych o pojemności 500 μl lub probówkach FACS z polistyrenu o okrągłym dnie 6 ml. Ta ostatnia metoda jest zwykle stosowana podczas przeprowadzania analizy rentowności w połączeniu z innymi procedurami. Wszystkie podane objętości dotyczą okrągłodennych probówek FACS z polistyrenu o pojemności 6 ml. W przypadku probówek silikonowanych o pojemności 500 μl zmniejsz wszystkie objętości o 1/5.

Optymalnym stężeniem do analizy cytometrii przepływowej jest 2-4 x 10⁶ komórek na 200 μL objętości. W wyniku tej procedury może dojść do utraty komórek, dlatego zalecamy, aby każda próbka składała się z 4 x 10⁶ komórek na początku procedury.

1. Przygotowanie komórek

1. Pobieranie komórek - zapoznaj się ze szczegółowymi procedurami dla odpowiednich linii komórkowych lub pierwotnych izolacji komórek.
2. Odwirować próbki o masie 335 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant.
3. Zawieś komórki w 2 ml 1 x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) ^-/- (bez wapnia, bez magnezu).
4. Odwirować próbki o masie 335 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant.
5. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1 x bufor wiążący Aneksyna V.
6. Odwirować próbki o masie 335 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant.
7. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1 x bufor wiążący Aneksyna V.

2. Zastosowanie załącznika V/ Bejca PI

1. Dodać aneksynę V zgodnie z zaleceniami producenta [np. 5 μL Annexin V Alexa Fluor 488 (Sondy molekularne, A13201)].
2. Inkubuj probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dodać 100 μl 1 x bufor wiążący Aneksyna V do każdej probówki reakcyjnej. W każdej probówce powinno znajdować się około 200 μl.
4. Dodać 4 μl PI (Sigma, Cat# P-4864-10ML), który został rozcieńczony w stosunku 1:10 w 1 x bufor wiążący Aneksyna V (tj. 1 μL PI z 9 μL 1 x bufor wiążący Aneksyna V). W ten sposób uzyska się końcowe stężenie PI wynoszące 2 μg/ml w każdej próbce.
5. Inkubuj probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Dodać 500 μl 1 x bufor wiążący Aneksyna V, aby przepłukać komórki.
7. Odwirować próbki o masie 335 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant.
8. Zawieś komórki w 500 μl 1 x bufor wiążący anektyna V i 500 μl 2% formaldehydu, aby utworzyć 1% roztwór formaldehydu (utrwalacz). Wymieszaj rurki, delikatnie przesuwając.
9. Utrwal próbki na lodzie na 10 minut. Alternatywnie próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4°C w ciemności. W przypadku wyboru tej drugiej metody należy upewnić się, że wszystkie probówki oznaczone załącznikiem V/PI są spójne (w tym kontrole kompensacji).
10. Dodać 1 ml 1 x PBS-^/- do każdej próbki i delikatnie wymieszać, przesuwając.
11. Odwirować probówki o masie 425 x g przez osiem minut i zdekantować supernatant.
12. Powtórz kroki 2.10 i 2.11.
13. Ponownie zawiesić pellet, przesuwając rurkę.
14. Dodać 16 μl rozcieńczonej RNazy A w stosunku 1:100 (Sigma, R4642), aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/ml. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37°C.
15. Dodaj 1 ml 1 x PBS-^/- i delikatnie wymieszaj, przesuwając światło.
16. Probówki wirować o sile 425 x g przez osiem minut.
17. Próbki są teraz gotowe do analizy. Alternatywnie, próbki mogą być używane do kolejnych etapów barwienia, jeśli barwienie aneksyną/PI jest wykonywane równolegle z innymi procedurami.

3. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady typów komórek i linii komórkowych, które mają różne stopnie fałszywie dodatniego zabarwienia PI, są pokazane na rysunku 1. Aby uwzględnić zdarzenia fałszywie dodatnie, komórki unieruchomiono, a następnie potraktowano RNazą A. Powoduje to znaczny spadek liczby zdarzeń fałszywie dodatnich w porównaniu z komórkami, które nie zostały poddane leczeniu RNazą (Figura 2B). Rycina 2C przedstawia reprezentatywne obrazy komórek, które zostały poddane leczeniu RNazą, w porównaniu z komórkami, które nie były leczone RNazą. Rycina 3 pokazuje, w jaki sposób zmodyfikowany protokół Aneksyny V/PI, z etapami fiksacji i leczenia RNazą, poprawia się w stosunku do konwencjonalnych protokołów, ograniczając liczbę fałszywie dodatnich zdarzeń barwienia.

Rysunek 1. Konwencjonalne protokoły barwienia jodkiem propidyny prowadzą do znacznej liczby zdarzeń fałszywie dodatnich. Wcześniej oceniliśmy zakres fałszywie dodatniego barwienia w komórkach pierwotnych w szerokim zakresie modeli zwierzęcych, a także w różnych liniach komórkowych ¹⁰. Reprezentatywne obrazy pokazują zakres fałszywie dodatniego barwienia w trzech unikalnych populacjach komórek (jedna powszechnie stosowana linia komórkowa - makrofagi RAW i dwie komórki pierwotne - makrofagi szpiku kostnego myszy (BMM) i pierwotne makrofagi nerkowe złotej rybki (PKM)). Zdarzenia prawdziwie dodatnie pokazują oczekiwaną kolokalizację między PI i DRAQ5 w przedziale jądrowym (żółte obszary przedstawiają kolokalizację między PI i DRAQ5). DRAQ5 jest barwnikiem o wysokiej przepuszczalności błony, który dokładnie barwi przedział jądrowy zarówno w żywych, jak i martwych komórkach ^10,11,12. Dla łatwiejszego wizualnego określenia kolokalizacji, barwie DRAQ5 nadano zielony pseudokolor.

Rysunek 2. Poprawa dokładności barwienia jądrowego PI. (A) Oceniliśmy dokładność barwienia jądrowego PI na podstawie stopnia podobieństwa wielu dobrze scharakteryzowanych barwień jądrowych (BrdU, 7-AAD i DAPI) do DRAQ5. BrdU jest syntetycznym nukleozydem, który jest wbudowany w DNA proliferujących komórek i jako taki plami się tylko w przedziale jądrowym. 7-AAD ma wysokie powinowactwo do DNA i, podobnie jak PI, nie może przekroczyć nienaruszonej błony plazmatycznej. DAPI ma również silne powinowactwo do DNA i jest najczęściej stosowanym barwnikiem jądrowym w mikroskopii fluorescencyjnej. Stopień podobieństwa wynosił >99% między BrdU, 7-AAD, DAPI i DRAQ5, co podkreśla ich zdolność do dokładnego barwienia jądra komórkowego w makrofagach RAW 264,7. W przeciwieństwie do tego, cytoplazmatyczne barwienie PI oparte na konwencjonalnych protokołach prowadzi do wyraźnego spadku procentowego podobieństwa barwienia w stosunku do DRAQ5. (B) Podobne wyniki obserwuje się w dwóch badanych komórkach pierwotnych: makrofagach szpiku kostnego myszy (BMM) i pierwotnych makrofagach nerkowych złotej rybki (PKM). Włączenie 50 μg/ml RNazy A na określonym etapie procedury barwienia usuwa niejądrowe barwienie PI i znacznie zwiększa stopień podobieństwa w stosunku do barwienia DRAQ5. (C) Reprezentatywne obrazy pierwotnych makrofagów nerkowych pokazują stopień podobieństwa komórek z leczeniem RNazą i bez niej. Dla łatwiejszego wizualnego określenia różnic między zabiegami, DRAQ5 otrzymał kolor zielony. Żółte obszary przedstawiają kolokalizację między BrdU i DRAQ5 oraz PI i DRAQ5.

Rysunek 3. Zmodyfikowana Aneksyna V/PI znacznie zmniejsza liczbę fałszywych zdarzeń apoptozy/martwicy. Pierwotne makrofagi nerkowe złotej rybki (PKM) barwiono konwencjonalnymi i zmodyfikowanymi protokołami Ancyny V/PI. Wykresy rozrzutu przedstawiają plamę Annexin V/PI w złotej rybce PKM. Wykres rozrzutu po lewej stronie pokazuje konwencjonalne barwienie aneksyną V / PI (bez RNazy) komórek PKM. Wykres rozrzutu po prawej stronie pokazuje komórki PKM wybarwione zmodyfikowanym protokołem Annexin V/PI (z RNazą). Dodanie RNazy powoduje wyraźne zmniejszenie barwienia PI w wyniku usunięcia fałszywie dodatnich barwień. Komórki PKM zostały następnie przeanalizowane w oparciu o odrębne populacje w obrębie kultur - wczesnych prekursorów (EP), monocytów (Mono) i dojrzałych makrofagów (Mat mac). Zmniejszenie liczby dodatnich zdarzeń PI, spowodowane usunięciem zdarzeń fałszywie dodatnich, jest bardziej wyraźne w dużych dojrzałych komórkach makrofagów niż w mniejszych wczesnych komórkach progenitorowych. Wnioski oparte na konwencjonalnych protokołach błędnie sugerowałyby dodatnią korelację w śmierci komórkowej dla bardziej dojrzałych podzbiorów makrofagów.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.