Opisano dokładną metodę oceny śmierci komórek. Protokół ten stanowi ulepszenie konwencjonalnych protokołów z użyciem Annexin V/jodku propidyny (PI), które wykazują do 40% wyników fałszywie dodatnich w liniach komórkowych i komórkach pierwotnych pochodzących z szerokiej gamy modeli zwierzęcych.
Artykuł metodologiczny
Zmodyfikowany test apoptozy z użyciem Annexin V i jodku propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania nad apoptozą komórkową zostały znacząco usprawnione od czasu wprowadzenia metod opartych na cytometrii przepływowej. Jodek propidyny (PI) jest powszechnie stosowany w połączeniu z Aneksyną V w celu określenia, czy komórki są żywe, apoptotyczne czy nekrotyczne, poprzez analizę różnic w integralności i przepuszczalności błony plazmatycznej1,2. Protokół Aneksyna V/PI jest powszechnie stosowanym podejściem w badaniach komórek apoptotycznych3. PI jest używany częściej niż inne barwniki jądrowe, ponieważ jest ekonomiczny, stabilny i stanowi dobry wskaźnik żywotności komórek ze względu na zdolność do wykluczania barwnika w komórkach żywych 4,5. Zdolność PI do wnikania do komórki zależy od przepuszczalności błony; PI nie barwi komórek żywych ani we wczesnej fazie apoptozy ze względu na obecność nienaruszonej błony plazmatycznej 1,2,6. W komórkach w późnej fazie apoptozy oraz w komórkach nekrotycznych integralność błon plazmatycznych i jądrowych ulega zmniejszeniu7,8, co pozwala PI na przeniknięcie przez błony, interkalację do kwasów nukleinowych i emisję czerwonej fluorescencji 1,2,9. Niestety stwierdzono, że konwencjonalne protokoły Aneksyna V/PI prowadzą do znacznej liczby wyników fałszywie dodatnich (do 40%), które są związane z barwieniem przez PI RNA w kompartmencie cytoplazmatycznym10. Zjawisko to dotyczy komórek pierwotnych i linii komórkowych w szerokim zakresie modeli zwierzęcych, przy czym najwyższą częstotliwość występowania odnotowano w dużych komórkach (stosunek jądra do cytoplazmy <0,5)10. W niniejszej pracy przedstawiamy zmodyfikowaną metodę Aneksyna V/PI, która zapewnia znaczną poprawę oceny śmierci komórkowej w porównaniu z metodami konwencjonalnymi. Protokół ten wykorzystuje zmiany w przepuszczalności komórkowej podczas utrwalania komórek, aby wspomóc wnikanie RNazy A do wnętrza komórek po barwieniu. Zarówno czas, jak i stężenie RNazy A zostały zoptymalizowane w celu usunięcia RNA cytoplazmatycznego. Wynikiem jest znacząca poprawa w stosunku do konwencjonalnych protokołów Aneksyna V/PI (< 5% zdarzeń z cytoplazmatycznym barwieniem PI).
Protokół
Tę procedurę można przeprowadzić w silikonizowanych probówkach o pojemności 500 μL lub polistyrenowych probówkach FACS z okrągłym dnem o pojemności 6 mL. Z tych drugich korzysta się zazwyczaj podczas przeprowadzania analizy żywotności w połączeniu z innymi procedurami. Wszystkie podane objętości dotyczą polistyrenowych probówek FACS z okrągłym dnem o pojemności 6 mL. W przypadku probówek silikonizowanych o pojemności 500 μL należy zmniejszyć wszystkie objętości pięciokrotnie.
Optymalne stężenie do analizy cytometrycznej jest wynikiem 2-4 x 106 komórek w objętości 200 μL. W wyniku tej procedury mogą wystąpić straty komórek, dlatego zalecamy, aby każda próbka na początku procedury zawierała 4 x 106 komórek.
1. Przygotowanie komórek
- Zbiór komórek – należy odnieść się do konkretnych procedur dla odpowiednich linii komórkowych lub izolacji komórek pierwotnych.
- Wirowanie próbek przy 335 x g przez 10 minut i odlanie nadsączu.
- Resuspensja komórek w 2 mL 1 x fosforanie buforze soli (PBS) -/- (bez wapnia, bez magnezu).
- Wirowanie próbek przy 335 x g przez 10 minut i odlanie nadsączu.
- Resuspensja komórek w 1 mL 1 x buforze wiążącym Annexin V.
- Wirowanie próbek przy 335 x g przez 10 minut i odlanie nadsączu.
- Resuspensja komórek w 100 μL 1 x buforze wiążącym Annexin V.
2. Zastosowanie barwienia Aneksyną V/PI
- Dodać Annexin V zgodnie z zaleceniami producenta [np. 5 μL Annexin V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
- Inkubować probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Do każdej probówki z reakcją dodać 100 μL 1 x buforu wiążącego Annexin V. W każdej probówce powinno znaleźć się około 200 μL.
- Dodać 4 μL PI (Sigma, Cat# P-4864-10ML) rozcieńczonego 1:10 w 1 x buforze wiążącym Annexin V (tj. 1 μL PI z 9 μL 1 x buforu wiążącego Annexin V). Pozwoli to uzyskać końcowe stężenie PI wynoszące 2 μg/mL w każdej próbce.
- Inkubować probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- W celu przemycia komórek dodać 500 μL 1 x buforu wiążącego Annexin V.
- Wirować próbki z prędkością 335 x g przez 10 minut, a następnie odlać nadsącz.
- Resuspendować komórki w 500 μL 1 x buforu wiążącego Annexin V i 500 μL 2% formaldehydu, aby przygotować 1% roztwór formaldehydu (utrwalacza). Wymieszać zawartość probówek poprzez delikatne potrząsanie.
- Utrwalać próbki na lodzie przez 10 minut. Alternatywnie próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4°C w ciemności. W przypadku wyboru tej drugiej metody należy zachować spójność we wszystkich probówkach oznaczonych jako Annexin V/PI (łącznie z kontrolami kompensacji).
- Do każdej próbki dodać 1 mL 1 x PBS-/- i delikatnie wymieszać poprzez potrząsanie.
- Wirować probówki z prędkością 425 x g przez osiem minut, a następnie odlać nadsącz.
- Powtórzyć kroki 2.10 i 2.11.
- Resuspendować osad poprzez potrząsanie probówką.
- Dodać 16 μL RNazy A (Sigma, R4642) rozcieńczonej 1:100, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/mL. Inkubować przez 15 min w temperaturze 37°C.
- Dodać 1 mL 1 x PBS-/- i delikatnie wymieszać poprzez potrząsanie.
- Wirować probówki z prędkością 425 x g przez osiem minut.
- Próbki są teraz gotowe do analizy. Alternatywnie próbki można wykorzystać w kolejnych etapach barwienia, jeśli barwienie Annexin/PI jest wykonywane równolegle z innymi procedurami.
3. Reprezentatywne wyniki:
Przykłady typów komórek i linii komórkowych wykazujących różny stopień fałszywie dodatniego barwienia PI przedstawiono na rysunku 1. Aby wyeliminować zdarzenia fałszywie dodatnie, komórki utrwalono, a następnie poddano działaniu RNazy A. Skutkuje to znacznym spadkiem liczby zdarzeń fałszywie dodatnich w porównaniu z komórkami, które nie zostały poddane traktowaniu RNazą (rysunek 2B). Rysunek 2C przedstawia reprezentatywne obrazy komórek poddanych działaniu RNazy w porównaniu z komórkami, których nie traktowano RNazą. Rysunek 3 pokazuje, w jaki sposób zmodyfikowany protokół Annexin V/PI, obejmujący etapy utrwalania i traktowania RNazą, usprawnia konwencjonalne protokoły poprzez ograniczenie liczby fałszywie dodatnich zdarzeń barwienia.
Rysunek 1. Konwencjonalne protokoły barwienia jodkiem propidyny prowadzą do znacznej liczby wyników fałszywie dodatnich. Wcześniej oceniliśmy zakres barwienia fałszywie dodatniego w komórkach pierwotnych w szerokim zakresie modeli zwierzęcych, a także w różnych liniach komórkowych 10. Reprezentatywne obrazy pokazują zakres barwienia fałszywie dodatniego w trzech unikalnych populacjach komórek (jedna powszechnie stosowana linia komórkowa – makrofagi RAW oraz dwie komórki pierwotne – mysie makrofagi szpiku kostnego (BMM) i pierwotne makrofagi nerkowe złotej rybki (PKM)). Wyniki prawdziwie dodatnie wykazują oczekiwaną kolokalizację PI i DRAQ5 w obrębie jądra komórkowego (obszary żółte przedstawiają kolokalizację PI i DRAQ5). DRAQ5 jest barwnikiem o wysokiej przepuszczalności przez błony, który precyzyjnie barwi jądra zarówno w komórkach żywych, jak i martwych 10,11,12. W celu ułatwienia wizualnego określenia kolokalizacji, barwieniu DRAQ5 nadano zielony pseudokolor.
Rysunek 2. Poprawa dokładności jądrowego barwienia PI. (A) Oceńiono dokładność jądrowego barwienia PI na podstawie stopnia podobieństwa szeregu dobrze scharakteryzowanych barwników jądrowych (BrdU, 7-AAD i DAPI) do DRAQ5. BrdU jest syntetycznym nukleozydem, który wbudowuje się w DNA proliferujących komórek, a zatem barwi wyłącznie w obrębie przedziału jądrowego. 7-AAD wykazuje wysokie powinowactwo do DNA i, podobnie jak PI, nie może przekroczyć nienaruszonej błony plazmatycznej. DAPI również wykazuje silne powinowactwo do DNA i jest najczęściej stosowanym barwnikiem jądrowym w mikroskopii fluorescencyjnej. Stopień podobieństwa między BrdU, 7-AAD, DAPI a DRAQ5 wyniósł >99%, co podkreśla ich zdolność do dokładnego barwienia jądra komórkowego w makrofagach RAW 264.7. W przeciwieństwie do tego, cytoplazmatyczne barwienie PI oparte na konwencjonalnych protokołach prowadzi do wyraźnego spadku procentowego podobieństwa barwienia w stosunku do DRAQ5. (B) Podobne wyniki zaobserwowano w dwóch badanych typach komórek pierwotnych: mysich makrofagach szpiku kostnego (BMM) oraz pierwotnych makrofagach nerkowych złotej rybki (PKM). Wprowadzenie 50 μg/mL RNazy A na konkretnym etapie procedury barwienia usuwa pozajądrowe barwienie PI i znacząco zwiększa stopień podobieństwa w stosunku do barwienia DRAQ5. (C) Reprezentatywne obrazy pierwotnych makrofagów nerkowych pokazują stopień podobieństwa komórek z zastosowaniem i bez zastosowania obróbki RNazą. Aby ułatwić wizualne określenie różnic między metodami, DRAQ5 oznaczono kolorem zielonym. Obszary żółte przedstawiają kolokalizację BrdU i DRAQ5 oraz PI i DRAQ5.
Rysunek 3. Modyfikowany protokół Annexin V/PI znacząco redukuje liczbę fałszywie dodatnich zdarzeń apoptozy/nekrozy. Pierwotne makrofagi nerkowe złotej rybki (PKM) barwiono zgodnie z konwencjonalnym i zmodyfikowanym protokołem Annexin V/PI. Wykresy rozrzutu przedstawiają barwienie Annexin V/PI w PKM złotej rybki. Wykres po lewej stronie pokazuje konwencjonalne barwienie Annexin V/PI (bez RNazy) komórek PKM. Wykres po prawej stronie pokazuje komórki PKM barwione zmodyfikowanym protokołem Annexin V/PI (z RNazą). Dodatek RNazy skutkuje wyraźną redukcją barwienia PI dzięki usunięciu fałszywie dodatnich sygnałów. Następnie komórki PKM analizowano w oparciu o odrębne populacje w kulturach: wczesne progenitory (EP), monocyty (Mono) i dojrzałe makrofagi (Mat mac). Redukcja liczby zdarzeń dodatnich dla PI, wynikająca z usunięcia zdarzeń fałszywie dodatnich, jest bardziej wyraźna w dużych, dojrzałych komórkach makrofagów niż w mniejszych komórkach wczesnych progenitorów. Wnioski wyciągnięte na podstawie konwencjonalnych protokołów błędnie sugerowałyby pozytywną korelację między śmiercią komórkową a stopniem dojrzałości subpopulacji makrofagów.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół Annexin V/PI jest zmodyfikowaną wersją konwencjonalnych protokołów i uwzględnia obecność RNA w cytoplazmie, które również wykazuje wysokie powinowactwo do PI. Wprowadzenie RNazy A (50 μg/mL) po etapie utrwalania 1% formaldehydem w późnej fazie procedury barwienia znacząco poprawia dokładność barwienia jąder PI. Nie zaobserwowano negatywnego wpływu na barwienie jąder PI ani barwienie błony plazmatycznej Annexin V. Bez zastosowania RNazy A, nawet 40% wyników barwienia PI może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich, co może mieć znaczący i negatywny wpływ na dalsze wnioski10.
Nasz zmodyfikowany protokół barwienia Annexin V/PI jest prosty i był skutecznie stosowany w szerokim zakresie typów komórek (Komórki pierwotne: makrofagi szpiku kostnego i splenocyty mysie; komórki rezydentne płuc świń, makrofagi pęcherzykowe płuc, izolaty węzłów chłonnych krezkowych, leukocyty krwi obwodowej, splenocyty; komórki blastodermy kurczaka; pierwotne makrofagi nerek złotej rybki; leukocyty krwi obwodowej karpia; Linie komórkowe: makrofagi RAW 264.7, limfocyty T Jurkat, makrofagi świńskie 3D4/31, fibroblasty płetwy złotej rybki CCL-71, limfocyty B suma 3B11 10). Należy zauważyć, że komórki w różny sposób reagują na fałszywie dodatnie barwienie PI, przy czym komórki pierwotne zazwyczaj wykazują większą liczbę zdarzeń fałszywie dodatnich 10. Różnice w fałszywie dodatnim barwieniu PI pomiędzy tymi populacjami komórkowymi mogą wynikać częściowo z różnic w wielkości komórek, ale mogą być również rezultatem różnic w zawartości RNA. W związku z tym wdrożenie tej procedury jest szczególnie istotne dla systemów eksperymentalnych wykorzystujących między innymi komórki poddane stresowi genotoksycznemu, komórki traktowane lekami zatrzymującymi cykl komórkowy, takimi jak tymydyna lub hydroksymocznik, komórki zainfekowane wirusowo, a także w badaniach nad komórkami embrionalnymi, w których postęp rozwoju charakteryzuje się dyskretnymi zmianami w syntezie RNA komórkowego.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badanie to zostało sfinansowane z grantu badawczego Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) oraz grantu Alberta Agriculture Funding Consortium przyznanego DRB. AMR otrzymał wsparcie w ramach NSERC Vanier Canadian Graduate Scholarship, stypendium dla asystenta nauczania University of Alberta oraz stypendium dla doktorantów Queen Elizabeth II.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Bufor wiążący Anneksynę V | BD Biosciences | 556454 | |
| Anneksyna V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Jodek propidyny (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL w H2O |
| 2% Formaldehyd | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNaza A z trzustki bydlęcej | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Rozcieńczyć 1:60 w 1 x PBS-/- |
Bibliografia
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
Przedruki i uprawnienia
