Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Podsumowanie

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Streszczenie

Aby zrozumieć związek między transportem mitochondrialnym a funkcją neuronalną, kluczowe jest obserwowanie zachowania mitochondriów w żywych hodowlach neuronów przez dłuższy czas^1-3. Jest to obecnie możliwe dzięki zastosowaniu barwników witalnych i białek fluorescencyjnych, za pomocą których można znakować komponenty cytoszkieletu, organelle oraz inne struktury w żywych komórkach, a następnie wizualizować je przy użyciu dynamicznej mikroskopii fluorescencyjnej. Na przykład w embrionalnych neuronach współczulnych kurczaka ruch mitochondriów opisano z wykorzystaniem barwnika witalnego rhodamine 123⁴. W innym badaniu mitochondria w neuronach przedniego mózgu szczura wizualizowano poprzez transfekcję eYFP ukierunkowanego na mitochondria⁵. Jednak obrazowanie pierwotnych neuronów przez minuty, godziny, a nawet dni wiąże się z szeregiem problemów. Do najważniejszych z nich należą: 1) utrzymanie warunków hodowli, takich jak temperatura, wilgotność i pH podczas długich sesji obrazowania; 2) silny, stabilny sygnał fluorescencyjny, aby zapewnić zarówno jakość pozyskanych obrazów, jak i dokładny pomiar intensywności sygnału podczas analizy obrazu; oraz 3) ograniczenie czasu ekspozycji podczas akwizycji obrazu w celu zminimalizowania fotobleachingu i uniknięcia fototoksyczności.

W niniejszej pracy opisujemy protokół umożliwiający obserwację, wizualizację i analizę ruchu mitochondriów w hodowanych neuronach hipokampa z wysoką rozdzielczością czasową i w optymalnych warunkach podtrzymywania życia. Skonstruowaliśmy przystępny cenowo inkubator nakładkowy na stolik mikroskopu, który zapewnia dobrą regulację temperatury i przepływ gazów atmosferycznych, a także ogranicza stopień odparowywania medium, zapewniając stabilne pH i osmolarność. Inkubator ten jest połączony, za pomocą węży wlotowych i wylotowych, ze standardowym inkubatorem do hodowli tkanek, który zapewnia stały poziom wilgotności oraz atmosferę zawierającą 5-10% CO₂/powietrza. Taka konstrukcja stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla znacznie droższych inkubatorów mikroskopowych, które niekoniecznie gwarantują żywotność komórek przez wiele godzin, a nawet dni. Aby zwizualizować mitochondria, infekujemy komórki lentiwirusem kodującym czerwone białko fluorescencyjne ukierunkowane na mitochondrium. Zapewnia to silny i trwały sygnał, który w połączeniu z zastosowaniem stabilnego źródła światła ksenonowego pozwala nam ograniczyć czasy ekspozycji podczas akwizycji obrazu i niemal całkowicie eliminuje fotoblaknięcie oraz fototoksyczność. Dwa porty wtryskowe na górze inkubatora nakładkowego umożliwiają ostre podawanie neuroprzekaźników i innych odczynników mających na celu modulację ruchu mitochondriów. Podsumowując, ekspresja czerwonego białka fluorescencyjnego ukierunkowanego na organellum za pośrednictwem lentiwirusa oraz połączenie naszego inkubatora nakładkowego, konwencjonalnego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, kamery CCD i źródła światła ksenonowego pozwalają nam pozyskiwać obrazy time-lapse transportu mitochondriów w żywych neuronach przez dłuższy czas, niż jest to możliwe w badaniach wykorzystujących konwencjonalne barwniki witalne i gotowe systemy podtrzymywania życia.

Protokół

1. Opis inkubatora stołowego zbudowanego w laboratorium

Utrzymywanie żywych komórek na stoliku mikroskopu przez dłuższy czas wiąże się z trzema głównymi wyzwaniami: 1) kontrolą i regulacją temperatury otoczenia; 2) kontrolą wilgotności, czyli utrzymaniem wilgotności atmosfery środowiska; oraz 3) utrzymaniem odpowiedniego pH w pożywce hodowlanej. Te kwestie „podtrzymywania życia” są kluczowe w eksperymentach obejmujących długoterminową obserwację hodowli neuronów, które są szczególnie wrażliwe na zmiany temperatury i pH. Poniżej opisujemy prosty, zbudowany w laboratorium inkubator nakładany na stolik mikroskopu, który zaprojektowaliśmy i skonstruowaliśmy do obrazowania żywych neuronów w dłuższych odstępach czasu. Inkubator ten jest połączony zamkniętym obwodem ze standardowym inkubatorem do hodowli tkanek (Thermo Scientific, Asheville, NC), który zapewnia stabilną, ogrzewaną (37°C), nawilżoną atmosferę składającą się z 10% CO₂/90% powietrza.

1. Obudowa inkubatora: Korpus inkubatora (Rysunek 1(I, II); A) został wykonany na komputerowym C&frezarka CNC z litego kawałka czarnego tworzywa Delrin. Ma wymiary 97,74 mm (D) x 73,60 mm (S) x 28,58 mm (W) (wymiary wewnętrzne 96,74 mm x 72,60 mm x 27,58 mm), co zapewnia objętość zamkniętą wynoszącą około 19 370 cm³³Na obu końcach obudowy wywiercono dwa otwory, w których zamontowano gwintowane mosiężne króćce, aby umożliwić podłączenie węży doprowadzających i odprowadzających powietrze z i do inkubatora do hodowli tkankowych. W górnej części obudowy wyfrezowano prostokątny otwór o wymiarach 70,0 mm x 43,0 mm, aby umożliwić montaż okna z poliwęglanu (Rycina 1(I, II); B). Podstawa inkubatora (Rysunek 1(I, II, III); C; widok z góry oraz profil przedstawiony szczegółowo w lewym górnym rogu), wyfrezowany z aluminium o grubości 3/16", o wymiarach 159,77 mm (dług.) x 109,86 mm (szer.) x 3,175 mm (grub.), zaprojektowany tak, aby pasował do gniazda wkładki zmotoryzowanego stolika 3-płytkowego Leica (model 11-522-068, Leica GmBh, Lipsk, Niemcy). Do narożników podstawy za pomocą wpuszczanych śrub z płaskim łbem przymocowano cztery stalowe słupki z wewnętrzym gwintem. Stanowią one stabilne punkty mocowania obudowy inkubatora, w której w każdym narożniku wywiercono otwory na słupki (Rycina 1(II, III); D). Uszczelkę z sorbotanu (McMaster Carr, Inc., Elmhurst, IL) wycięto i dopasowano do podstawy, aby zapewnić szczelność na styku obudowy i podstawy. Do przymocowania obudowy do podstawy użyto czterech mosiężnych śrub motylkowych z gwintem dopasowanym do gwintów słupków (Rysunek 1(II, III); D). W centralnej części podstawy inkubatora wycięto otwór o średnicy 35,1 mm z cienkim wgłębieniem na krawędzi, aby pomieścić 35-milimetrowe GBM (Rysunek 1(III); E; szczegół w lewym górnym rogu); zaprojektowano dodatkowe podstawy, aby umożliwić zastosowanie innych rozmiarów naczyń hodowlanych.
2. Elementy grzejne: dwa rezystory radiatorowe o rezystancji 10 kΩ (Digi-Key Corp., Thief River Falls, MN) są przymocowane do wewnętrznych ścian obudowy inkubatora. Są one podłączone do transformatora 9 V DC, 500 mA, który jest wpięty do sterownika temperatury terrarium Alife 1000 W (Carolina Pet Supply, Irmo, SC). Sonda przewodowa umieszczona w uszczelce poliwęglanowego okna obudowy inkubatora wykrywa wewnętrzną temperaturę otoczenia i steruje przepływem prądu do rezystorów. Rezystory te, działając wspólnie z inkubatorem do hodowli tkankowych, zapewniają dodatkowy stopień kontroli temperatury otoczenia.
3. System atmosfery w obiegu zamkniętym: Zapewnia stałą, nawilżoną i podgrzaną atmosferę z zawartością 10% CO2₂90% powietrza, inkubator platformowy jest połączony za pomocą węży wlotowych i wylotowych (Rysunek 1(I); F, G)do standardowego inkubatora do hodowli tkankowych z płaszczem wodnym (Rycina 1(I); H); Forma Scientific Model 3154; Thermo Scientific, Inc., Asheville, NC). Tuż przed podłączeniem do inkubatora nadstołowego, wąż doprowadzający (Rysunek 1(I); F) wpłynął do standardowej pompki akwariowej (Rycina 1(I); I; Lifegard QuietOne Model 1200, Pentair Aquatics, El Monte, CA), który został umieszczony w szczelnej obudowie z tworzywa ABS (Rycina 1(I); J; model 1150, Pelican Products, Inc., Torrance, CA), aby zachować obieg zamknięty. Pompa ta zapewnia ciągły przepływ powietrza z inkubatora do hodowli tkankowych do inkubatora nadstolikowego. Po etapie pompy wąż doprowadzający biegnie do kolby Erlenmeyera o pojemności 1500 ml (Rycina 1(I); K), który pełni funkcję tłumika w celu zminimalizowania przenoszenia drgań z pompy do inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu. Wąż wylotowy (Rysunek 1(I); G) prowadzącej z inkubatora przedmiotowego do inkubatora do hodowli tkankowych (Rysunek 1(I); H) jest wyposażony w zamknięty wentylator komputerowy (Rycina 1(I); L), który, podobnie jak pompa, ma również na celu zapewnienie ciągłego przepływu powietrza.
4. Pokrywka z membraną PTFE do 35 mm GBM: Przed umieszczeniem hodowli neuronalnej w inkubatorze nadstołowym do obrazowania, 35 mm GBM wyposaża się w specjalną pokrywkę z membraną (Rycina 1(II, IV); M(szczegół pokazany w prawym górnym rogu), aby umożliwić wymianę gazową i jednocześnie zminimalizować parowanie pożywki hodowlanej. Pokrywka ta składa się z pierścienia z tworzywa Delrin oraz wyciętego arkusza membrany PTFE (Teflon; American Durafilm Co., Inc., Holliston MA), który został naciągnięty na pierścień i utrwalony za pomocą uszczelki z Vitonu, wsuwanej w zagłębiony kanał wzdłuż boku pierścienia z tworzywa Delrin.
5. Porty wtryskowe: W oknie z poliwęglanu wywiercono dwa otwory (Rysunek 1(II), szczegół centralny, żółte strzałki przy B) inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu. Wyposażono je w końcówki strzykawek Hamilton z nierdzewnej stali, które służą jako porty wtryskowe do podawania 5-HT, DA, różnych agonistów i antagonistów receptorów oraz innych odczynników podczas danego eksperymentu.

2. Przygotowanie pierwotnych kultur hipokampa

Wszystkie prace prowadzone są w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy BSL2 lub na stole z laminarnym przepływem powietrza. Pierwotne neurony hipokampa są izolowane z embrionów szczura w 18. dniu embrionalnym (E18) zgodnie ze standardowymi procedurami^6-7 i hodowane w bezzserwatkowym medium kondycjonowanym przez pierwotne astrocyty kory mózgu. Komórki glejowe są przygotowywane zgodnie z opublikowanymi metodami⁷. Medium kondycjonowane składa się z DMEM o niskiej zawartości glukozy, uzupełnionego o prolinę (1.76 ug/ml), asparaginę (0.83 ug/ml), witaminę B12 (0.34 ug/ml), glukozę (20mM), BSA bogatą w lipidy (0.5 mg/ml) oraz 2% B27^8-10. Do medium nie dodaje się antybiotyków, ponieważ mogą one zakłócać transkrypcję genów neuronalnych.

1. Pokryć centralną część szklanego zakrywek w 35mm szalce hodowlanej z szklanym dnem (GBM) poly-D-lizyną (0,05 mg/ml w PBS) i pozostawić na dwie godziny w temperaturze 37°C. Odessać roztwór poly-D-lizyny i pozostawić do wyschnięcia na 20 minut w laminarnym dygestorium BSL2. Pokryć część GBM z zakrywką powleczoną poly-D-lizyną lamininą (0,01 mg/ml w PBS) i pozostawić na minimum 40 minut przed usunięciem nadmiaru roztworu lamininy. Odstawić na 20 minut.
2. Wypreparować hipokampy z mózgów embrionów szczura w stadium E18 i poddać je dysocjacji zgodnie z opisem w Current Protocols in Neuroscience⁶.
3. Rozcieńczyć zdysocjowane komórki w pożywce wzrostowej, aby uzyskać gęstość 110 000 komórek na GBM. Obliczyć niezbędne stężenie komórek w mieszaninie głównej (master mix) w zależności od liczby przygotowywanych GBM.
4. Umieścić zasiałe GBM w inkubatorze ustawionym w temperaturze 37°C i w atmosferze składającej się z 10% CO₂/90% powietrza.
5. Po trzech do pięciu dniach, w zależności od warunków wzrostu neuronów, dodać do kultur arabinosyd C (0,14 ng/ml) w celu zahamowania proliferacji gleju.
6. Pozostawić kultury do wzrostu przez dwa tygodnie przed zakażeniem lentiwirusem. W tym czasie co trzy dni wymieniać jedną trzecią objętości pożywki w każdej GBM na świeżą pożywkę. Nie przekraczać tej ilości pożywki, ponieważ może to doprowadzić do szoku osmotycznego i śmierci komórek.

3. Przygotowanie rekombinowanego lentiwirusa kodującego czerwone białko fluorescencyjne

Badacze, którzy nie mają dostępu do zaplecza umożliwiającego wytwarzanie rekombinowanych lentiwirusów, mogą skorzystać z opcji zamówienia ich produkcji w komercyjnej firmie, np. System Biosciences (Mountain View, CA).

Gen czerwonego białka fluorescencyjnego ukierunkowanego na mitochondria (MitoTurboRFP; Axxora LLC, San Diego, CA) zostaje wprowadzony do samoinaktywującego się rekombinowanego wirusa niedoboru odporności kotów pod kontrolą transkrypcyjną enhancera z promotora głównego genu wczesnego bezpośredniego cytomegalowirusa¹¹. Rekombinowane lentiwirusy są wytwarzane poprzez przejściową transfekcję komórek 293T.

1. Wysiać komórki 293T z gęstością ~75,000 cells/ cm²; następnego dnia przeprowadzić kotransfekcję komórek plazmidami kodującymi rekombinowany wektor wirusowy, geny FIV gag i pol oraz gen glikoproteiny G wirusa zapalenia jam ustnych (VSV), używając PolyJet (SignaGen Laboratories, Gaithersburg, MD). Na każdą szalkę hodowlaną 10cm z komórkami 293T należy zużyć łącznie 12 ug DNA (4.8 μg wektora wirusowego, 4.8 μg plazmidu gagpol i 2.4 μg plazmidu VSV G).
2. Po 24 godzinach odessać medium hodowlane i przemyć komórki zrównoważonym roztworem soli Hanksa bez czerwieni fenolowej, aby usunąć pozostałości DNA. Dodać 10ml bezzserwatkowego medium bazowego dla neuronów uzupełnionego o 50μg/ml BSA bogatego w lipidy oraz Glutamax.
3. Następnego dnia zebrać nadsącz, przefiltrować go przez filtr 0.2 micron o niskim wiązaniu białek i przenieść do jednostki ultrafiltracyjnej z polietersulfonu Vivaspin 20 (Sartorius, Concord, USA). Jednostkę Vivaspin poddać wstępnemu przygotowaniu poprzez sekwencyjne płukanie 70% etanolem, wodą klasy do hodowli tkankowych oraz solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo. Skoncentrować nadsącz zawierający wirusa ok. 50-krotnie poprzez wirowanie przy 1500xg przez 30 minut. Rozdzielić preparat wirusa na alykwoaty i przechowywać w ciekłym N₂.
4. Oszacować miano wirusa poprzez zakażenie komórek szczura B104 alykwatem skoncentrowanego wirusa i pomiar ekspresji białka fluorescencyjnego za pomocą cytometrii przepływowej po 72 godzinach. Procent komórek pozytywnych pozwala oszacować ilość wirusa, tj. objętość skoncentrowanego wirusa niezbędną do uzyskania ekspresji białka fluorescencyjnego w określonej liczbie pierwotnych neuronów.

4. Infekowanie hodowlanych neuronów

Kultury neuronów hipokampa są zarażane w 14. dniu in vitro poprzez proste dodanie ilości wirusa oszacowanej na zainfekowanie do 50% wszystkich neuronów na podstawie danych z cytometrii przepływowej. Polybrene nie jest stosowany. Kultury są utrzymywane przez 3 dni przed sprawdzeniem ekspresji białka fluorescencyjnego. Jeśli sygnał jest zbyt słaby, kulturę zwraca się do inkubatora do hodowli tkankowych i poddaje ponownemu badaniu po kilku dniach.

5. Ogólna konserwacja zamkniętego systemu podtrzymywania życia

1. Aby utrzymać odpowiednią wilgotność, należy okresowo sprawdzać płaszcz wodny inkubatora i uzupełniać go w razie potrzeby. Wewnątrz inkubatora należy umieścić stalową lub aluminiową taczkę z niewielką ilością wody (głębokość 25mm) oraz algobójczym środkiem.
2. W razie potrzeby należy udrożnić węże wlotowe i wylotowe obwodu atmosferycznego inkubatora, opróżniając wodę zgromadzoną w rurkach chwytnych. Węże należy okresowo płukać 70% etanolem.

6. Nakładanie pokrywki membranowej na GBM i umieszczenie w inkubatorze nadstołowym

1. Przed umieszczeniem GBM w inkubatorze nakładkowym, w komorze z laminarnym przepływem powietrza należy zastąpić plastikową pokrywkę pokrywką z membraną. Po wykonaniu tej czynności można przenieść osłonięty GBM do mikroskopu.
2. Ostrożnie umieść GBM z pokrywką z membraną w zagłębieniu w podstawie inkubatora nakładkowego. Aby uniknąć wstrząsów, upewnij się, że podstawa jest już zamocowana na stoliku mikroskopu; ponieważ podstawa wpina się w stolik z pewnym oporem, najlepiej umieścić GBM po ustabilizowaniu podstawy w odpowiedniej pozycji.
3. Dopasuj obudowę inkubatora do stalowych słupków na podstawie inkubatora i opuść obudowę na podstawę. Dokręć śruby motylkowe, aż zostanie osiągnięta szczelność między obudową a podstawą.

7. Akwizycja obrazów

Należy zauważyć, że większość dostępnych platform oprogramowania do obrazowania posiada porównywalną funkcjonalność w szerokim zakresie mikroskopów i powiązanego sprzętu. Dostępnych jest wiele platform oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów, w tym MetaMorph oraz programy zaprojektowane dla konkretnych marek mikroskopów, takie jak Leica Application Suite, Nikon's NIS-Elements oraz Carl Zeiss' AxioVision. W niniejszym protokole opisujemy procedury akwizycji i analizy obrazów, które przeprowadziliśmy przy użyciu Slidebook 5 (Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO). Niemniej jednak, poszczególne kroki każdej operacji opisanej w tym protokole można łatwo dostosować do użytkowania różnych innych programów.

Opis odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, konfiguracji filtrów, kamery CCD, ksenonowego źródła światła oraz oprogramowania do obrazowania:

Do dynamicznego obrazowania transportu mitochondriów w neuronach hipokampa wykorzystujemy odwrócony mikroskop fluorescencyjny Leica DMI-6000B z zmotoryzowanym stolikiem Model 11-522-068 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Niemcy), wyposażony w kamerę CCD Cooke Sensicam EQ (The Cooke Corporation, Romulus, MI), koło filtrowe i kontroler Sutter Lambda 10-2 (Sutter Instrument Company, Novato, CA) oraz ksenonowe źródło światła Sutter DG-4 300W. Aby zwizualizować mitochondria znakowane fluorescencyjnym białkiem MitoTurbo Red, stosujemy kombinację filtra 555nm przy źródle światła DG-4 do wzbudzenia oraz filtrów 600nm (piki; Sedat Quad Beamsplitter Model 86100bs zamontowany w kostce filtracyjnej serii Leica DM, Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT) i 617nm odpowiednio w mikroskopie i kole filtrowym do detekcji emisji.

Do akwizycji i analizy obrazów wykorzystujemy pakiet oprogramowania do obrazowania w mikroskopii cyfrowej Slidebook 5. Jest to kompleksowy pakiet, który umożliwia w pełni zautomatyzowane sterowanie mikroskopem, stolikiem, kołem filtrowym, kamerą i źródłem światła podczas akwizycji obrazów, a także oferuje szereg modułów do przetwarzania i analizy obrazów.

Poniżej przedstawiamy szczegółowe, krokowe instrukcje pozyskiwania obrazów time-lapse poruszających się mitochondriów w neuronach znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu oprogramowania Slidebook 5.

1. Przed uruchomieniem programu Slidebook 5 należy upewnić się, że mikroskop, kontroler koła filtrów, źródło światła oraz kamera CCD zostały włączone.
2. W przypadku obrazowania żywych mitochondriów należy przełączyć na obiektyw imersyjny 63X, odpowiednio opuścić rewolwer obiektywów, aby zapewnić dostęp do obiektywu pod stolikiem mikroskopu (i inkubatorem nadstolikowym), a następnie ostrożnie nanieść olej bezpośrednio na powierzchnię obiektywu. Otwórz okno ustawiania ostrości, klikając ikonę „Focus Window” na pasku narzędzi Slidebook. W oknie ostrości włącz lampę pola jasnego, przesuwając suwak opisany jako „lamp”, aby dostosować intensywność pola jasnego do odpowiedniego poziomu. Ustaw ostrość na polu komórek i znajdź interesującą komórkę.
3. W karcie „Scope” wybierz fluor „CY3”. Korzystając z okularów, przy oświetleniu fluorescencyjnym znajdź płaszczyznę ostrości dla mitochondriów w komórkach znakowanych białkiem Mito TurbRed. Po ustawieniu ostrości przez okulary przełącz na kamerę CCD i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość.
4. Otwórz okno przechwytywania obrazu, klikając ikonę „Image Capture” na pasku narzędzi Slidebook. Zaczynając od wstępnego czasu ekspozycji 100ms, znajdź optymalny czas ekspozycji za pomocą przycisków „Test” i „Find Best”; alternatywnie można użyć przycisku „Once”. Należy pamiętać, że czas ekspozycji powinien zapewnić odpowiedni rozkład intensywności w całym polu obrazu (np. 0-2500; wskazany przez histogram na dole okna przechwytywania obrazu) przy minimalnym czasie trwania (np. 200-800ms).
5. Przed rozpoczęciem akwizycji obrazów time-lapse otwórz okno „Advanced”, klikając kartę „Advanced” w oknie przechwytywania obrazu. Znajdź kartę „Focus”, zaznacz opcję „Autofocus during time-lapse/multipoint captures” i dostosuj ustawienia autofokusa dla akwizycji obrazów time-lapse. Zazwyczaj stosujemy następujące parametry autofokusa: aktualizacja ostrości co 2-3 klatki; jako kanał autofokusa wybieramy fluor używany do obrazowania znakowanych mitochondriów, tj. CY3; całkowity zakres wyszukiwania 2 um dla powiększenia 63x.
6. W oknie „Capture”, w polu „Capture Type”, zaznacz opcję „Timelapse” i wybierz żądany odstęp między obrazami oraz czas trwania sesji obrazowania w opcjach „Timelapse Capture”. W naszych badaniach nad wpływem neuromodulatorów na transport mitochondriów obrazowanie time-lapse przeprowadzano w sesjach godzinnych, podczas których pozyskiwano łącznie 360 obrazów w odstępach 10 sekund między obrazami.
7. Rozpocznij akwizycję obrazów time-lapse, klikając przycisk „Start” w prawym dolnym rogu okna „Capture”.
8. Po wstępnej sesji obrazowania (kontrolnej) podaj neurotransmitery i inne odczynniki przez górne porty inkubatora nadstolikowego i rozpocznij nową sesję obrazowania.

8. Analiza obrazu

1. Otwórz plik obrazu zapisany po ostatniej sesji obrazowania.
2. Poszczególne mitochondria w serii obrazów time-lapse można znakować automatycznie lub ręcznie, korzystając z funkcji maskowania dostępnych w programie Slidebook 5.
3. W menu „Mask” wybierz opcję „Segment” z paska menu. Przesuwając linie dolnego i górnego progu w narzędziu „histogram”, zamaskuj wszystkie cząstki na niebiesko w całym obrazie, obejmując wszystkie mitochondria znajdujące się w wypustce, starając się jednocześnie zachować jak największą dyskretność cząstek. Zastosuj maskę do całej serii obrazów.
4. Utwórz drugą maskę (w menu „Mask” wybierz „Create”), która obejmie cały obraz z wyjątkiem analizowanej wypustki, w której cząstki zostały wyróżnione poprzednią maską. Osiąga się to najpierw za pomocą najgrubszego narzędzia „pencil” do obrysowania granic obszarów poza wypustką, a następnie za pomocą narzędzia „paint bucket” do wypełnienia ograniczonych obszarów. Zastosuj tę maskę do całej serii obrazów.
5. W menu „Mask” wybierz „Mask Operations” i wykonaj operację „Minus”, czyli odjęcie drugiej maski od pierwszej (cały obraz z wyjątkiem wypustki). Zostanie wygenerowana trzecia maska, w której wyróżniona będzie tylko analizowana wypustka. Należy pamiętać, że ta nowa maska zostanie zastosowana do całej serii obrazów.
6. W menu „Annotations” wybierz „Object IDs”.
7. Zweryfikuj ciągłość i przypisania numeryczne poszczególnych zamaskowanych mitochondriów poprzez ręczny przegląd serii obrazów (w programie Slidebook 5 w tym celu można użyć przycisków „play”, „forward frame” oraz „reverse frame” znajdujących się poniżej okna obrazu).
8. Wybierz zakładkę „Mask” na pasku menu. W menu „Mask” wybierz „Particle Tracking” i uruchom „Basic Particle Tracking”, aby wygenerować „Path Statistics”, w tym współrzędne centroidu dla każdego zamaskowanego mitochondrium.
9. Odległość przebyta przez każde mitochondrium pomiędzy dwiema sąsiednimi klatkami obrazu jest obliczana na podstawie współrzędnych każdej cząstki w każdej klatce.
10. W naszych poprzednich badaniach nad wpływem neuromodulatorów na ruch mitochondriów zidentyfikowaliśmy trzy odrębne populacje mitochondriów: „stacjonarne”, „oscylacyjne” i „ruchome kierunkowo”. Jeśli mitochondrium przemieści się na odległość mniejszą niż 0.2 µm (lub 2 piksele przy powiększeniu 63X; 1 piksel=0.10235 µm) w ciągu jednej godziny, jest ono określane jako „stacjonarne”. Jeśli mitochondrium przemieści się co najmniej 0.2 µm, ale mniej niż 2.5 µm w cyklu anterogradno-retrogradnym, definiuje się je jako „oscylacyjne”. Wreszcie, jeśli mitochondrium przebywa dystans netto większy niż 2.5 µm w jednym kierunku, jest ono klasyfikowane jako ruchome kierunkowo. Na Rysunku 2 przedstawiono histogram obrazujący ruch wszystkich oznakowanych mitochondriów w reprezentatywnym eksperymencie, a także wykres kołowy przedstawiający procentowy rozkład trzech odrębnych populacji mitochondriów.
11. Średnia prędkość każdego mitochondrium jest obliczana na podstawie całkowitego dystansu przebytego podczas danej sesji obrazowania. Średnia prędkość populacji mitochondriów jest obliczana poprzez zsumowanie prędkości poszczególnych organelli i podzielenie wyniku przez całkowitą liczbę śledzonych mitochondriów.
12. Kymografy można generować przy użyciu modułu dostępnego w programie Slidebook 5. Korzystając z funkcji „Mask”, narysuj cienką linię przez całą długość danej wypustki (np. aksonu); upewnij się, że linia przechodzi przez jak największą liczbę centroidów mitochondriów. Przejdź do zakładki „Mask” na pasku menu, wybierz „Advanced Operations”, a następnie „Smooth Curve Analysis”. Użyj domyślnych ustawień analizy krzywej wygładzonej lub dostosuj je według uznania. Uruchom moduł analizy krzywej wygładzonej. Po zakończeniu analizy wyświetlony zostanie kymograf sesji obrazowania.
13. Przejdź do paska menu, wybierz „View”, a następnie „Export TIFF”.
14. Otwórz zapisany plik .tif zawierający kymograf w programie Photoshop lub porównywalnym programie do przetwarzania obrazów i przekonwertuj obraz na odwróconą skalę szarości.

9. Reprezentatywne wyniki

Poprzez śledzenie i analizę ruchu mitochondriów w hodowlanych neuronach hipokampa wykazaliśmy związek między neuromodulacją a transportem mitochondriów. W szczególności stwierdziliśmy, że serotonina (5-HT) lub agonista receptora 5-HT1A, 8-OH-DPAT, stymuluje ruch mitochondriów (Rysunek 2A-C)⁸, natomiast dopamina (DA) lub agonista receptora D2, bromokryptyna, hamuje ruch mitochondriów (Rysunek 2D-G)⁹.

Rycina 1. Projekt inkubatora nadstolikowego w obiegu zamkniętym. Przedstawiono następujące elementy systemu inkubacji: odporną na ciepło obudowę z tworzywa Delrin (A); prostokątny otwór na okno z poliwęglanu (B); aluminiową podstawę inkubatora (C); otwory na stalowe wsporniki podstawy (D); otwór o średnicy 35,1mm z cienką zagłębioną krawędzią w centrum podstawy inkubatora, przeznaczony do naczyń GBM 35mm (E); węże Nalgene (połączenia między inkubatorem do hodowli tkankowych a inkubatorem nadstolikowym; pułapki wilgoci) (F,G,N); inkubator do hodowli tkankowych (H); pompa akwariowa (I); szczelna skrzynka z tworzywa ABS (obudowa pompy akwariowej) (J); kolba Erlenmeyera 2000ml (tłumik w celu redukcji wibracji w wężu przed inkubatorem nadstolikowym) (K); plastikowa obudowa wentylatora chłodzącego (L); plastikowa ramka do pokrywki GBM 35mm (M); położenie plastikowych kraników (O). Położenie portów do podawania odczynników zaznaczono żółtymi strzałkami na (II).

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki: regulacja transportu mitochondriów. A. Akson typowego neuronu hipokampa szczura w hodowli. Mitochondria znakowane białkiem fluorescencyjnym kodowanym przez lentiwirusa są pokazane na zielono; aksony immunoznakowane przeciwciałem przeciwko fosfo-neurofilamentom są pokazane na czerwono. Zasięg aksonu zaznaczono żółtymi grotami strzałek. Obraz składa się z czterech nakładających się mikrografii. B. Przykład serii obrazów time-lapse pokazujący zmiany w ruchu mitochondriów po podaniu 5-HT. Obrazy zostały pozyskane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i zapisane jako sekwencje, które następnie przekształcono w filmy Quicktime. Reprezentatywna sekwencja obrazów pokazuje poszczególne mitochondria w różnych punktach czasowych przed (panel lewy) i po (panel prawy) podaniu 8-OH-DPAT, agonisty receptora 5-HT1A. Pionowy czerwony prostokąt wyróżnia mitochondrium stacjonarne (lewo) oraz mitochondrium oscylujące (prawo) w wielu punktach czasowych. Wskazane mitochondrium oscylujące (panel lewy) porusza się w kierunku zakończenia aksonu po traktowaniu 8-OH-DPAT (panel prawy; białe groty strzałek z czerwoną obwódką). Pionowa żółta linia (panel prawy) wskazuje pozycję początkową poruszającego się mitochondrium. Przedziały czasowe są pokazane w prawym dolnym rogu każdej klatki. Powiększenie (63×) jest wskazane w prawym dolnym rogu prawego panelu. C, D. Wykresy pokazujące zmiany w ruchu mitochondriów po podaniu 5-HT. Zmiany w ruchu mitochondriów przed (C) i po (D) podaniu 5-HT są przedstawione jako wykresy prędkości (oś X) względem pozycji początkowej poszczególnych mitochondriów wzdłuż aksonu (oś Y). Prędkość oraz proporcja mitochondriów stacjonarnych (czerwone), oscylujących (niebieskie) i poruszających się kierunkowo (zielone) są przedstawione odpowiednio na wykresach i wykresach kołowych (wstawki nad wykresami). Czerwone linie przerywane biegnące z zaznaczonych obszarów schematycznego aksonu do osi Y każdego wykresu wskazują przybliżoną lokalizację i zasięg obrazowanego segmentu aksonu. E, F. Wykresy pokazujące zmiany w ruchu mitochondriów po podaniu DA. Zmiany w ruchu mitochondriów przed (E) i po (F) podaniu DA są przedstawione jako wykresy prędkości (oś X) względem pozycji początkowej poszczególnych mitochondriów wzdłuż aksonu (oś Y). Prędkość oraz proporcja mitochondriów stacjonarnych (czerwone), oscylujących (niebieskie) i poruszających się kierunkowo (zielone) są przedstawione odpowiednio na wykresach i wykresach kołowych (wstawki nad wykresami). Czerwone linie przerywane biegnące z zaznaczonych obszarów schematycznego aksonu do osi Y każdego wykresu wskazują przybliżoną lokalizację i zasięg obrazowanego segmentu aksonu. G, H. Reprezentatywne kymografy pokazujące ruch mitochondriów w hodowanym neuronie przed (G) i po (H) podaniu bromokryptyny, agonisty receptora D1R. Neuron był obrazowany przez jedną godzinę przed (G) i jedną godzinę po (H) podaniu bromokryptyny.

Dyskusja

Wykorzystując ekspresję białka fluorescencyjnego ukierunkowanego na mitochondria za pośrednictwem lentiwirusów w zakażonych hodowlach neuronów oraz tani, zbudowany laboratoryjnie inkubator nakładkowy na stolik mikroskopu, który umożliwia obrazowanie żywych komórek przez dłuższy czas, byliśmy w stanie zbadać związek między ruchem mitochondriów a sygnałami neuromodulacyjnymi, takimi jak serotonina (5-HT), dopamina (DA) i acetylocholina (ACh). Nasze badania pomogły wyjaśnić szlak sygnalizacyjny, który po raz pierwszy łączy transport mitochondriów ze zmianami w aktywności neuronów – modulowanymi przez neuroprzekaźniki takie jak 5-HT i DA – które stanowią podstawę funkcji neuronalnych. Stwierdziliśmy, że zastosowanie ukierunkowanych białek fluorescencyjnych pozwala na obserwację znakowanych mitochondriów w żywych hodowlach neuronów przez dłuższe okresy, które mogą być bardziej istotne fizjologicznie niż znacznie krótsze czasy możliwe do osiągnięcia przy użyciu barwników witalnych. Ponadto intensywność sygnału białka fluorescencyjnego pozwala na zachowanie krótkich czasów ekspozycji podczas akwizycji obrazów, co minimalizuje ryzyko fotoblaknięcia lub fototoksyczności. Wreszcie, prosty i tani inkubator nakładkowy, który utrzymuje temperaturę otoczenia, wilgotność i poziom CO₂, minimalizując jednocześnie odparowywanie pożywki, pozwala nam śledzić ruch mitochondriów w żywych neuronach przez wiele godzin, a nawet dni. Badacze chcący zbudować inkubator nakładkowy do długoterminowych obserwacji mitochondriów w żywych neuronach nie muszą ściśle trzymać się szczegółów naszej konstrukcji, pod warunkiem że właściwości użytych materiałów (np. membrana przepuszczalna dla gazów w celu uniknięcia odparowania pożywki) oraz zastosowane zasady (np. kontrola temperatury i wilgotności, buforowanie pH, utrzymanie osmolarności) będą ogólnie zgodne z opisem zawartym w niniejszym protokole.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(1) Inkubator do hodowli tkankowej (H)
(1) Żaroodporna obudowa plastikowa (A)			(delrin lub materiał porównywalny)
(1) Plastikowa ramka do pokrywek GBM 35 mm (M)			(do mocowania membrany do szalki Petriego)
(1-2) stóp przezroczystego PFTE (Teflonu)			materiał membranowy
(4) Mosiężne śruby motylkowe
(2) Małe rezystory radiatorowe 10 kOhm			używane jako elementy grzejne wewnątrz obudowy inkubatora nadstolikowego
(1) Transformator			zasilanie rezystorów prądem 9 V
(1) Kontroler temperatury do terrariów z sondą			termostatyczna regulacja mocy rezystorów radiatorowych poprzez transformator
(1) Kolba Erlenmeyera 2000 ml (K)			tłumik do redukcji wibracji w wężu przed inkubatorem nadstolikowym
(1) Arkusz sorbotanu 1/8"			materiał uszczelki do podstawy inkubatora nadstolikowego
(1) Szczelne plastikowe pudełko ABS (lub porównywalne) (J)			obudowa pompy akwariowej
(1) Pompa akwariowa (I)
(1) Mały komputerowy wentylator chłodzący
(1) Plastikowa obudowa wentylatora chłodzącego (L)
(1) Transformator 9 V do komputerowego wentylatora chłodzącego
(20-30 stóp) Wąż Nalgene lub silikonowy (F, G, N)			połączenia między inkubatorem do hodowli tkankowej a inkubatorem nadstolikowym; pułapki wilgoci
(2) Plastikowe kurki (O)			do otwierania i zamykania przepływu powietrza przed i za inkubatorem nadstolikowym
(4) Mosiężne złączki węża z karbem			do połączeń węży z/do inkubatora nadstolikowego i obudowy pompy akwariowej
(2) Mosiężne szybkozłączki			do połączeń węży z/do inkubatora nadstolikowego
(2) Mosiężne szybkozłączki			do połączeń węży z/do inkubatora nadstolikowego
Tabela 1. Części inkubatora nadstolikowego:
Poly-D-lizyna	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
laminina	Roche Group	11243217001
szalki z dnem szklanym 35 mm	MatTek Corp.	P35GC-0-14-C
DMEM	Life Technologies	10567
B27	Life Technologies	17504-044
Glutamax	Life Technologies	35050
BSA bogate w lipidy	Life Technologies	11020-021
L-Asparagina	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Prolina	Sigma-Aldrich	A8381-100G
Witamina B-12	Sigma-Aldrich	V2876-100MG
5-HT	Sigma-Aldrich	H9523-25MG
8-OH-DPAT	Sigma-Aldrich	H8520-25MG
Dopamina	Sigma-Aldrich	H8502-5G
Bromokryptyna	Sigma-Aldrich	B2134-25MG
SKF38393	Sigma-Aldrich	D047-100MG