Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2600

⸱

3 czerwca 2011

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Streszczenie

Badamy ekspresję i role funkcjonalne napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach piramidowych z neokory szczura. Ze względu na brak specyficznych środków farmakologicznych dla tych kanałów, zastosowaliśmy podejście genetyczne do manipulowania ich ekspresją. Wykorzystujemy preparat hodowli organotypowej (16), aby zachować morfologię komórek i warstwową strukturę kory. Zazwyczaj izolujemy świeże skrawki neokory w 8-10 dniu po urodzeniu i utrzymujemy je w hodowli przez 3-7 dni. Pozwala nam to badać neurony w wieku zbliżonym do tych stosowanych w naszych badaniach na świeżych skrawkach oraz minimalizuje rozwój nadmiernych połączeń pobudzających w skrawku. Rejestrujemy aktywność wizualnie zidentyfikowanych neuronów piramidowych w warstwach II/III lub V, wykorzystując oświetlenie w podczerwieni (IR-) oraz mikroskopię kontrastową z interferencją różnicową (DIC), stosując metodę patch clamp w konfiguracji whole-cell w trybie clamp prądowy lub napięciowy. Do manipulowania ekspresją kanałów w celu badania ich funkcji stosujemy transfekcję biolistyczną (pistolet genowy) DNA kanałów potasowych typu dzikiego lub zmutowanych. Komórki przetransfekowane są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej po kotransfekcji cDNA dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Rejestracje z przetransfekowanych komórek porównujemy z sąsiednimi, nietransfekowanymi neuronami z tej samej warstwy tego samego skrawka.

Protokół

1. Przygotowania przed dniem krojenia

Uznajemy, że bardziej efektywne jest autoklawowanie instrumentów chirurgicznych i przygotowanie roztworów przed dniem krojenia.

  1. Autoklawuj instrumenty. (Operacja i krojenie są przeprowadzane w warunkach półsterylnych). Autoklawuj następujące pakiety, oddzielnie zawinięte w papier do autoklawowania:
    • Pakiet chirurgiczny: szpatułka, uchwyt do ostrza skalpela #22, nożyczki, pęseta
    • Pakiet do krojenia: 3 pokrętła (pokrętło mocujące ostrze i 2 pokrętła zabezpieczające kąpiel) oraz osłona ostrza (trzyma ostrze żyletki z krojarki: Campden Vibroslice, #MA572), oddzielnie zawinięta (ponieważ będzie umieszczana w zamrażarce) wykonana na zamówienie metalowa komora (kąpiel dla preparatu) do krojarki (pleksiglasowa komora producenta nie wytrzyma wielokrotnego autoklawowania), kleszczyki hemostatyczne, nożyczki, pęseta.
    • Pakiet szklany: dwa zlewki 50 mL i jedna zlewka 25 mL
  2. Przygotuj alikwoty surowicy konia (Hyclone donor equine #SH 30074: Thermoscientic). Odmierz alikwoty ~11 mL surowicy konia do probówek stożkowych 15 mL. (Potrzebne jest 10 mL surowicy. Ponieważ podczas rozmrażania surowicy powstają pęcherzyki powietrza, należy przygotować 11 mL, aby móc pobrać wymagane 10 mL). Przechowuj alikwoty surowicy w zamrażarce przy -20°C.
  3. Przygotuj alikwoty pożywek. Po otwarciu butelek z pożywkami są one stabilne tylko przez ~4 tygodnie (ze względu na zmiany pH). Przekroje przeżywają lepiej w świeżych pożywkach.
    • Stosujemy trzy rodzaje dostępnych komercyjnie pożywek (zakupionych w butelkach 500 mL) oraz surowicę konia. Pożywki to: HMEM (Lonza Biowhittaker Minimal Essential Media plus HBSS i HEPES, bez glutaminy: katalog #12-137F), HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117) oraz MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038). Patrz Tabela 2.
    • Dla każdego z trzech rodzajów pożywek (HMEM, HBSS i MEM) odlej alikwoty ~50 mL z butelki 500 mL do każdej z czterech probówek stożkowych 50 mL. Wszystkie probówki po rozdzieleniu zabezpiecz Parafilmem. Przechowuj MEM w lodówce, a HMEM i HBSS w temperaturze pokojowej.
    • Pożywka hodowlana składa się z mieszaniny surowicy konia, HMEM i HBSS (patrz poniżej, Tabela 2). MEM jest stosowane jako pożywka do przemywania.
  4. Przygotuj roztwór do cięcia (Tabela 3). Roztwór do cięcia składa się z następujących składników (w mM): NaCl 125, KCl 3, NaH2PO4 1,25, NaHCO3 26, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 oraz 20 mM glukozy. Zazwyczaj przygotowujemy 250 mL (dopełnić do objętości w kolbie miarowej). Sprawdzić osmolalność (powinna wynosić ~310) i pH (7,2-7,3).

Kolejne kroki (#2 i #3) wykonuje się w dniu krojenia.

2. Operacja, krojenie i hodowla organotypowa

Ważne jest, aby operację przeprowadzać w miejscu oddzielonym od wszystkich pozostałych procedur. Do operacji polegającej na wyjęciu mózgu używamy dygestorium (wyciągu). Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza jest wykorzystywane do procedur wykonywanych w warunkach półsterylnych, takich jak krojenie oraz manipulacje z plastrami i roztworami.

  1. Przygotowanie roztworów. (Procedury te nie muszą być wykonywane w warunkach sterylnych, ponieważ roztwory zostaną przefiltrowane w późniejszym etapie).
    1. Przygotowanie roztworu do cięcia (Tabela 3). Napowietrzać roztwór mieszaniną 95% O2 / 5% CO2 przez co najmniej 20 minut (aby ustabilizować pH i upewnić się, że wszystkie sole są rozpuszczone). Dodać 1 mM kwasu pirogronowego (inhibitor metaboliczny) oraz 0,6 mM askorbinianu (antyoksydant).
    2. Rozmrozić 1 alikwot surowicy końskiej (11 mL).
  2. Przygotowanie komory z laminarnym przepływem powietrza (podczas wszystkich procedur używać rękawiczek, nasączyć rękawiczki EtOH). W tej sekcji przygotowujemy obszar roboczy, aby zapewnić czystą, półsterylną przestrzeń pracy. Przebierniemy również roztwory w celu ich sterylizacji.
    1. Użyć światła UV przez ok. 1 godzinę w celu sterylizacji przestrzeni roboczej w komorze z laminarnym przepływem powietrza (światło UV uszkadza elementy plastikowe, dlatego przykrywamy urządzenie Campden Vibroslice używane do cięcia, patrz poniżej). Oczyścić wszystkie powierzchnie 70% EtOH (z wyjątkiem plastikowych pokręteł przecinarki: EtOH je uszkodzi). Pod komorą z laminarnym przepływem powietrza zazwyczaj znajdują się również pipetator i pipety, butelka z EtOH, klej oraz dreny podłączone do 95% O2 / 5% CO2 oraz 100% O2.
    2. Umieścić pod komorą z laminarnym przepływem powietrza następujące elementy:
      • Autoklawowany zestaw do cięcia
      • 250 mL roztworu do cięcia
      • Filtr Millipore express plus: 250 mL [filtr 0,2 μm (#SC6PU02RE) do filtrowania roztworu do cięcia]:
      • Składniki pożywki hodowlanej:
        • 20 mL HMEM
        • 10 mL HBSS
        • 10 mL surowicy końskiej
      • Zestaw szklany: autoklawowane zlewki
      • 50 mL pożywki płukącej MEM
      • Pipetator (Drummond pipet-aid)
      • Siedem plastikowych pipet transferowych (Fisher #13-711-20). Są one używane do przenoszenia skrawków i roztworów, a także jako przewody dla gazów (O2; 95% O2 / 5% CO2) do napowietrzania roztworów i pożywek.
      • Klej cyjanoakrylowy
      • Żyletka lub nożyczki (do cięcia plastiku).
      • Sterylna głowica skalpela #22
      • Wkładki do hodowli komórkowych Millicell (0,4 μm, średnica 30 μm, #PICM 03050) – 3 wkładki na każdą płytkę 6-dołkową
      • Płytka(i) hodowlana 6-dołkowa (Corning: Costar #3516)
    3. Przefiltrować przygotowany 250 mL roztwór do cięcia za pomocą filtra Millipore 250 mL (patrz wyżej).
      Odmierzyć 40 mL roztworu do cięcia do zlewki 50 mL. Umieścić alikwot 40 mL roztworu do cięcia oraz pozostałe 210 mL roztworu do cięcia w zamrażarce (-20°C). Celem jest uzyskanie tych roztworów w postaci półpłynnej zawiesiny o temperaturze ok. 4°C do przyjęcia mózgu po usunięciu z czaszki (40 mL w zlewce) oraz do cięcia (210 mL).
    4. Umieścić metalową komorę do cięcia (przykrytą papierem do autoklawowania) w zamrażarce -20°C. Pomaga to utrzymać niską temperaturę roztworu do cięcia i mózgu podczas krojenia.
    5. Przygotować pożywki hodowlane i wlać je do dołków (nie napowietrzać pożywek hodowlanych – spienią się).
      • Przygotować 40 mL pożywki hodowlanej w plastikowej probówce wirówkowej 50 mL:
        • Wymieszać 20 mL HMEM + 10 mL HBSS + 10 mL alikwotu surowicy końskiej (Tabela 2)
        • Przefiltrować pożywkę hodowlaną (w celu sterylizacji) za pomocą filtra Millipore steriflip 0,22 μM 50 mL (#SCGP00525).
      • Wlać 1,1 mL pożywki hodowlanej do 3 diagonalnie rozmieszczonych dołków płytki 6-dołkowej (Corning: Costar #3516 6 well culture cluster). Umieścić płytkę 6-dołkową z pożywką w inkubatorze 37°C na co najmniej jedną godzinę.
    6. Za pomocą sterylnych nożyczek lub żyletki skrócić 4 pipety transferowe (używane do przenoszenia skrawków). Odcięte końce rurek są używane bez dalszych modyfikacji do rozprowadzania gazów w celu napowietrzania roztworów. Rurki te łączą linie z butlami 95% O2/5% CO2 lub 100% O2 z roztworami.
    7. Przefiltrować pożywkę płukącą (50 mL) za pomocą filtra Millipore steriflip 0,22 μM 50 mL (#SCGP00525). Umieścić pożywkę płukącą w lodówce.
  3. Przygotowanie do operacji. Roztwory muszą być gotowe do przyjęcia mózgu po operacji (dygestorium próżniowe) oraz do szybkiego cięcia i przygotowania do hodowli (komora z laminarnym przepływem powietrza). Operację wykonujemy pod dygestorium próżniowym. Ważne jest, aby operacja była przeprowadzona w oddzielnej strefie, aby włosy i płyny ustrojowe nie dostały się do półsterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.
    1. Przygotowanie pożywek i roztworów.
      • Wyjąć z zamrażarki zlewkę 50 mL z 40 mL roztworu do cięcia i umieścić pod dygestorium próżniowym, aby przyjąć mózg po usunięciu z czaszki. Nalać ok. 10 mL tego zimnego roztworu do cięcia do zlewki 25 mL. Będzie on służył do transportu mózgu do komory z laminarnym przepływem powietrza.
      • Wyjąć 210 mL roztworu do cięcia z zamrażarki i umieścić w komorze z laminarnym przepływem powietrza (do cięcia i zbierania skrawków).
      • Wyjąć metalową komorę do cięcia z zamrażarki i umieścić pod komorą z laminarnym przepływem powietrza.
      • Napowietrzyć oba roztwory do cięcia 95% O2 / 5% CO2 (użyć odciętych plastikowych pipet transferowych do połączenia drenów z roztworem).
    2. Umieścić pod dygestorium próżniowym następujące elementy (30 mL roztworu do cięcia jest już obecne i napowietrzane 95% O2 / 5% CO2):
      • autoklawowana zlewka 25 mL
      • autoklawowane narzędzia chirurgiczne, rękawiczki, pęsety
    3. Wyjąć pożywkę płukącą z lodówki i napowietrzyć 100% O2 (użyć końcówki odciętej plastikowej pipety transferowej do połączenia drenu z roztworem).
  4. Operacja (wykonywana pod dygestorium próżniowym). Ten krok jest niezbędny do usunięcia mózgu w celu jego późniejszego pocięcia. Ważne jest, aby zminimalizować czas między uśmierceniem zwierzęcia a umieszczeniem mózgu w zimnym, natlenionym roztworze do cięcia. Równie ważne jest zminimalizowanie urazów mózgu. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt (Animal Care and Use Committee), University of Tennessee, Health Science Center.
    1. Używamy szczurów Sprague-Dawley z grupy P6-P17 (preferowane P8-P10). Umieścić szczura w przykrytym plastikowym pojemniku o pojemności 2-4 L. W celu znieczulenia, ok. 1 mL izofluranu nanosi się na kawałek gazy znajdujący się pod plastikową siatką (tak aby anestetyk nie miał kontaktu ze zwierzęciem). Znieczulić szczura izofluranem aż do stanu arefleksji. Nasączyć rękawiczki EtOH.
    2. Po znieczuleniu szczura, dokonać dekapitacji dużym skalpelem i usunąć mózg. Umieścić mózg w zlewce zawierającej 30 mL zimnego (ok. 4°C) roztworu do cięcia na ok. 30 s. Ostrożnie przenieść mózg do zlewki 25 mL, aby zminimalizować przeniesienie włosów lub krwi do komory z laminarnym przepływem powietrza.
    3. Zmienić rękawiczki (nasączyć EtOH).
    4. Przenieść mózg w zimnym roztworze do cięcia (zlewka 25 mL) do komory z laminarnym przepływem powietrza.
  5. Cięcie mózgu i przygotowanie do hodowli. W tym kroku orientujemy mózg, usuwamy zbędną tkankę mózgową, a następnie wycinamy i zbieramy skrawki mózgu. Następnie płuczemy skrawki, kładziemy każdy z nich na wkładce z siatki, umieszczamy wkładki w płytkach hodowlanych 6-dołkowych i przenosimy płytki (ze skrawkami) do inkubatora w celu hodowli.
    1. Zorientować i zablokować mózg (usunąć móżdżek i biegun czołowy, wykonać częściowe cięcie pośrodkowe wzdłużnie do połowy od końca kory czołowej. Pozwala to na jednoczesne wycięcie dwóch skrawków – jednego z każdej półkuli – przy jednoczesnym zachowaniu obu półkul razem w części ogonowej, co stanowi stabilną podstawę do przyklejenia do stolika). Przykleić zablokowany mózg do stolika za pomocą cyjanoakrylanu. Umieścić mózg korą czołową do góry i wyciąć koronalne skrawki kory czołowo-ciemieniowej. W razie potrzeby wykonać dodatkowe cięcia skalpelem, aby ograniczyć rozmiar skrawka.
    2. Umieścić stolik z mózgiem w sterylizowanej metalowej komorze do cięcia (połączonej z wibrującą przecinarką do tkanek) i napełnić kąpiel lodowatym, napowietrzanym roztworem do cięcia. Nalać ok. 30 mL pozostałego roztworu do cięcia do zlewki 50 mL (do zbierania skrawków) i napowietrzyć 95% O2 / 5% CO2.
    3. Wyciąć skrawki o grubości 250-300 μm za pomocą wibrującej przecinarki do tkanek (Campden Vibroslice #MA572: World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Umieścić skrawki w zlewce zawierającej 30 mL roztworu do cięcia. Zebrać taką liczbę skrawków, jaką zamierza się hodować (zazwyczaj 3-6), oraz kilka dodatkowych.
    4. Płukanie skrawków: Wlać ok. 2 mL pożywki płukącej do plastikowej szalki Petriego 35 mm. Przenieść wszystkie skrawki z roztworu do cięcia do plastikowej szalki Petriego z pożywką płukącą. Płukać skrawki 3 razy, za każdym razem używając świeżej pożywki płukącej. Używać oddzielnych pipet transferowych do przenoszenia skrawków, dodawania pożywki i odsysania zużytych roztworów.
    5. Przenieść skrawki do pożywki hodowlanej (do innej plastikowej szalki Petriego 35 mm; nową pipetą transferową). Zdjąć pokrywki z opakowań wkładek z siatki, ale pozostawić wkładki w opakowaniach.
    6. Przenieść skrawki z pożywki hodowlanej na wkładki z siatki (używając odciętej pipety transferowej): Ustawić skrawki na środku wkładki (Rysunek 1A). Mała ilość pożywki hodowlanej zostanie przeniesiona wraz ze skrawkiem. Używając nienaruszonej pipety transferowej, natychmiast usunąć nadmiar pożywki hodowlanej po położeniu skrawka na wkładce. Próbować ustawić skrawek w centrum wkładki (ułatwia to transfekcję biolistyczną i późniejsze usunięcie skrawka do rejestracji).
    7. Umieścić wkładkę z siatką i skrawkiem w pożywce hodowlanej w płytce 6-dołkowej (Rysunek 1B). Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza pod siatką. Gdy w płytce 6-dołkowej znajdą się 3 wkładki/skrawki, umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Inkubować skrawki w inkubatorze 37°C przez ok. 1 godzinę.
  6. Transfekcja skrawków za pomocą pistoletu genowego (Bio-Rad Helios). Można to zrobić natychmiast po cięciu i umieszczeniu skrawków na siatce w płytce 6-dołkowej, jednak zazwyczaj inkubujemy je przez 1 godzinę w 37°C, aby ustabilizować skrawki, a dopiero potem przeprowadzamy transfekcję komórek. Szczegółowe protokoły przygotowania „pocisków” cDNA i obsługi pistoletu genowego znajdują się w ref. 17-22.
    1. Załadować plastikowe „kartridże” zawierające „pociski”. (Przez „pociski” rozumiemy cząsteczki złota pokryte cDNA. Zatem wiele pocisków znajduje się w jednym plastikowym „kartridżu”). Pozostawić pierwszą pozycję pustą (bez „kartridża”). W co drugiej pozycji umieścić kartridż zawierający pociski pokryte cDNA. Umieścić uchwyt kartridży w pistolecie genowym.
    2. Oczyścić pistolet, oddając strzał z lufy bez kartridża.
    3. Przesunąć lufę na pozycję z kartridżem. Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora i umieścić pod komorą z laminarnym przepływem powietrza. Trzymać pistolet tuż nad górną powierzchnią płytki 6-dołkowej. Trzymać pionowo. Strzelać przy ciśnieniu ok. 100 psi.
    4. Przesunąć lufę, oczyścić, powtórzyć. Jeden strzał na skrawek.
    5. Po strzelaniu zwrócić płytki 6-dołkowe ze skrawkami/wkładkami do inkubatora.
  7. Hodowla skrawków (w warunkach półsterylnych). Wszystkie manipulacje ze skrawkami i płytkami 6-dołkowymi należy wykonywać w rękawiczkach nasączonych EtOH i pod komorą z laminarnym przepływem powietrza, po uprzednim oczyszczeniu obszaru EtOH. Hodujemy skrawki przez różne okresy czasu (zazwyczaj 2-7 dni), aby umożliwić regenerację po ostrej procedurze cięcia oraz dać czas na ekspresję nowych białek w wyniku transfekcji.
    1. Hodować przez 2-7 dni (37°C, 5% CO2) w inkubatorze (Forma Scientific model # 3110).
    2. Wymieniać pożywkę co drugi dzień: dodać nową pożywkę do trzech nieobsadzonych dołków, umieścić w inkubatorze na co najmniej 1 godzinę. Przenieść skrawek/membranę do nowego dołka za pomocą oczyszczonej EtOH zakrzywionej pęsety. Odssać starą pożywkę. Zwrócić płytkę do inkubatora.

3. Rejestracja z komórek piramidowych w skrawkach

Szczegółowe instrukcje dotyczące technik rejestracji z całych komórek wykraczają poza zakres niniejszego protokołu. Przedstawiamy informacje na temat przenoszenia skrawków do komory rejestracyjnej oraz szczegóły dotyczące naszej konfiguracji pomiarowej, w szczególności w zakresie identyfikacji komórek transfekowanych do rejestracji.

  1. Elektrody wyciągamy ze szkła Harvard GC150TF-10 za pomocą poziomego wyciągacza Sutter P-87. Elektrody mają rezystancję 2-6 MΩ w roztworze zewnątrzkomórkowym. Elektrody są wypełnione wewnętrznym roztworem KMeSO4 (patrz Tabela 3).
  2. Należy założyć rękawiczki. Wyjmij płytkę 6-dołkową z inkubatora. Pod laminarnym dygestorium, ostrożnie wyjmij jeden plaster / wkład z siatką za pomocą wyczyszczonych EtOH zakrzywionych pęset. Umieść płytkę 6-dołkową z powrotem w inkubatorze i przenieś plaster przeznaczony do rejestracji do obszaru pomiarowego. W naszym przypadku znajduje się on w innym laboratorium. Wkład / plaster przenosimy w przykrytej, plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm. Po tym kroku nie ma konieczności noszenia rękawiczek (brak możliwości zanieczyszczenia kultur lub inkubatora).
  3. Wytnij membranę skalpelem nr 11. Tnij przeciwko napięciu wytwarzanemu przez pęsetę lub giętki pręt metalowy. (Może być konieczne wykonanie końcowych cięć nożyczkami). Za pomocą pęsety przenieś plaster z przymocowaną siatką do komory rejestracyjnej na stoliku mikroskopu pionowego Olympus BX50 WI.
  4. Używamy wzmacniacza Axon Instruments Multiclamp 700B oraz protokołów akwizycji danych w programie PClamp 10. Pozycją elektrody steruje się za pomocą manipulatorów Sutter ROE-200 i kontrolera PC-200. Używamy mikroskopu pionowego Olympus BX-50WI z optyką IR-DIC do wizualizacji neuronów piramidowych w warstwach II/III lub V. Do wizualizacji komórek w plastrze używamy pojedynczej kamery czułej na podczerwień (Olympus OLY-150 lub DAGE-MTI) oraz monitora ProVideo 1201B. Plastry są kąpane w nasyconym karbogenem sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF: Tabela 3), podawanym z przepływem 2-3 mL/min w temperaturze 33±1°C.
    Zazwyczaj znajdujemy 10-50 przetransfekowanych komórek na plaster. Komórki lokalizuje się, patrząc przez okular mikroskopu i korzystając z epifluorescencji z filtrem FITC (zamontowanym na kole filtrowym w uchwycie wieżyczkowym znajdującym się nad obiektywami i poniżej okularu mikroskopu). Pozwala nam to na łatwe przełączanie między IR-DIC a epifluorescencją w celu określenia typu komórki, potwierdzenia jej transfekcji (komórka wydaje się zielona w epifluorescencji i zawiera „bullet”) oraz oceny, czy komórka jest zdrowa (komórka jest trójwymiarowa i ma gładką powierzchnię, jądro nie jest obrzęknięte, a sama komórka nie jest obrzęknięta ani skurczona).
    Celujemy w neurony piramidowe w warstwach II/III lub V (patrz Rysunek 1). Komórki piramidowe są identyfikowane po obecności dendrytu apikalnego wznoszącego się w kierunku warstwy I, licznych kolców dendrytycznych i gruszkowatego somy. Warstwę określa się na podstawie gęstości komórek i położenia względem opony miękkiej. Zazwyczaj komórki przetransfekowane na powierzchni plastra nie będą zdrowe. Choć wizualizacja komórek głęboko w plastrze organotypowym jest trudniejsza niż w plastrach ostrych, zazwyczaj jesteśmy w stanie zwizualizować zdrowe, przetransfekowane komórki z głębokości 20-50 μm poniżej powierzchni plastra. Stosujemy standardowe metody rejestracji whole-cell. Podchodzimy do komórki pod kontrolą wizualną i z dodatnim ciśnieniem w trybie voltage-clamp. Uszczelnienia (seals) uzyskuje się poprzez delikatne ssanie (za pomocą strzykawki 1 mL) w trybie voltage-clamp. Po uzyskaniu uszczelnienia rzędu GΩ, stosuje się dodatkowe ssanie, aby przebić membranę komórki. Następnie wykonujemy rejestracje w trybie current-clamp lub voltage-clamp.
    Na koniec rejestracji weryfikujemy, czy rejestrowana komórka jest zielona, zawiera „bullet” i widocznie reaguje na ciśnienie ujemne lub dodatnie. Aby kontrolować zmienność między plastrami, warstwami komórek, wiekiem w momencie operacji oraz czasem hodowli, zawsze parujemy nasze rejestracje komórek przetransfekowanych z rejestracjami z nieprzetransfekowanych komórek kontrolnych z tej samej warstwy i zlokalizowanych w odległości do 50 μm od komórki przetransfekowanej.

4. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1A przedstawia świeżo przygotowany skrawek położony na membranie przed umieszczeniem w płytce 6-dołkowej do hodowli. Skrawek ten obejmuje korę ruchową i somatosensoryczną szczenięcia szczura P10. Opona miękka znajduje się po prawej stronie rysunku, natomiast istota biała i prążkowie po lewej. Rysunek 1B przedstawia skrawek/membranę w dołku, zanurzoną w ~1,1 mL pożywki hodowlanej. Celem hodowli organotypowej jest zachowanie prawidłowej struktury warstwowej kory, zapobieganie wysychaniu powierzchni podczas hodowli oraz w końcowej fazie uzyskanie wysokiego odsetka żywych komórek w skrawku po kilku dniach hodowli, które nadają się do rejestracji (komórki niekurczące się i niespuchnięte, minimalna liczba spuchniętych jąder komórkowych, błyszczący i trójwymiarowy wygląd komórek w optyce IR-DIC). Rysunek 1C przedstawia obrazy IR-DIC i epifluorescencyjne neuronu piramidalnego z warstwy III w organotypowym skrawku kory somatosensorycznej po 3 dniach hodowli (od zwierzęcia P10). Rysunek 1D to obraz epifluorescencyjny innego skrawka, pokazujący kilka komórek warstwy V przetransfekowanych cDNA dla GFP (komórki zielone).

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne ślady z rejestracji metodą clampingu prądowego i napięciowego z komórki piramidalnej warstwy V po 3 dniach organotypowej hodowli skrawków (zwierzę P10). Rysunek 2A pokazuje potencjał czynnościowy (AP) z overshootem. Rysunek 2B przedstawia powtarzające się wyładowania w odpowiedzi na 2 s stałego wtryskiwania prądu o natężeniu 400 pA. Ślady te wskazują na prawidłowe właściwości elektrofizjologiczne regularnie wyładowującego neuronu warstwy V (patrz również Tabela 1). Rysunek 1C to rejestracja metodą clampingu napięciowego z neuronu piramidalnego warstwy V w obecności 1 μM tetrodotoksyny (TTX) w celu zablokowania napięciowo-zależnych prądów Na+. Ślady przedstawiają rodzinę prądów w odpowiedzi na 500 ms skoków napięcia z potencjału spoczynkowego -70 mV do różnych potencjałów w zakresie od -90 mV do +70 mV (w odstępach 10 mV między skokami).

Hodowla komórkowa w szalce Petriego, płytce 96-dołkowej, obrazy mikroskopowe neuronów, fluorescencja, wyniki mikroskopowe.
Rycina 1. Organotypowa hodowla skrawków. A. Skrawki kory sensoromotorycznej szczura P10 na wkładce z siatki filtrującej Millicell. Opona miękka znajduje się po prawej stronie, głęboka istota biała i prążkowie po lewej. Linia środkowa znajduje się na górnej krawędzi. B. Trzy wkładki ze skrawkami i siatką zanurzone w ~1 mL Pożywki Hodowlanej i umieszczone w nie sąsiednich dołkach płytki 6-dołkowej (ten sam osobnik co w A). C. Obrazy IR-DIC (górny) i epifluorescencyjne (dolny) piramidowej komórki nowokory ściągniętej z warstwy III w hodowli organotypowej (zwierzę P10, 3 dni w hodowli). Zwróć uwagę na widoczną w obrazie DIC „kulkę” (czarna sfera). D. Obraz fluorescencyjny kilku neuronów warstwy V po transfekcji biolistycznej cDNA dla GFP.

Wyniki elektrofizjologiczne; wykres clampowania napięcia; aktywność neuronów; pomiar potencjału czynnościowego.
Rysunek 2. Rejestracje z komórek piramidowych nowokory np. w organotypowej hodowli plastrów. A. Potencjał czynnościowy w komórce piramidalnej warstwy III (z organizmu w 10. dniu postnatalnym, po 3 dniach hodowli) w odpowiedzi na ponadprogowe wstrzyknięcie prądu przez 10 ms. B. Powtarzalne wyładowania z innego neuronu piramidalnego warstwy V (szczur P10, 3 dni w hodowli) w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu o natężeniu 400 pA przez 2 s. Był to neuron o regularnym wzorcu wyładowań (regular spiking neuron). C. Rejestracja metodą clampowania napięcia (voltage-clamp) z innego neuronu piramidalnego warstwy V (szczur P10, 3 dni w hodowli). 1 μM Zastosowano TTX w celu zablokowania napięciowo zależnych kanałów Na++ prąd zewnętrzny, K++ prądy w odpowiedzi na serię 500-msowych skoków napięcia z potencjału spoczynkowego -70 mV (protokół po prawej). Napięcia zostały skorygowane o potencjał złącza cieczowego wynoszący +10 mV. Rezystancja dostępu wynosiła ok. 9 MΩ. Nie zastosowano kompensacji rezystancji szeregowej ani pojemności błony.

Tabela 1. Podobne właściwości elektryczne komórek piramidalnych kontrolnych w porównaniu do komórek przetransfekowanych GFP (przekroje od szczura p10; przekrój organotypowy: 3-4 dni in vitro). Średnia + błąd standardowy średniej (liczba komórek). RMP = potencjał spoczynkowy błony, Rn = rezystancja wejściowa, AP = potencjał czynnościowy; Vth = napięcie progowe dla AP; HW = szerokość AP przy połowie amplitudy.

LeczenieRMP (mV)Rn (MΩ)amplituda potencjału czynnościowegoVth (mV)HW (ms)
Kontrola-72 ± 1 (21)119 ± 17 (11)84 ± 2 (24)-45 ± 1 (21)1.7 ± 0.1 (19)
wyłącznie GFP-77 ± 1 (9)123 ± 7 (5)87 ± 2 (24)-45 ± 2 (9)2.1 ± 0.2 (7)

Tabela 2. Pożywki komercyjne. Pożywki te są nabywane i stosowane bez modyfikacji (ich składy są dostępne online u producenta).

1Bufor do płukania: MEM (GIBCO#12360)
Pożywki kulturalne: 20 ml HMEM1 (Lonza Biowhittaker), + 10 ml HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 ml surowicy konia1 (Hyclone #SH 30074.03)

Tabela 3. Roztwory (stężenia w mM).

Roztwór do wycinania: 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 glucose (pH 7.4, 310 MOsm/L).
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy aCSF (rejestracja zewnętrzna): 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 glucose (pH 7.4, 310 MOsm/L).
Wewnętrzny roztwór rejestracyjny (clamp prądowy): 130.5 KMeSO4, 10 KCl, 7.5 NaCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 ATP, 0.2 GTP, 0.1 EGTA (pH 7.2, 285-295 mOsm/L).
Wewnętrzny roztwór rejestracyjny (clamp napięciowy): 55 KMeSO4, 55 KOH, 2 MgCl2, 20 HEPES, 6 creatine phosphate, 4 ATP, 0.5 GTP, 10 BAPTA, 0.1 leupeptin (pH 7.2, 285-295 mOsm/L).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badaliśmy ekspresję i role funkcjonalne napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach piramidalnych nowokory ratów (4, 9-11). Ze względu na brak specyficznych czynników farmakologicznych dla tych kanałów, stosujemy podejście genetyczne do manipulowania ich ekspresją (1,14,15,17-19). Wykorzystujemy preparat hodowli organotypowej (2,3;5-8;12,13,15-22), zmodyfikowany na podstawie metody Stoppini et al. (16), w celu zachowania morfologii komórek i warstwowej struktury kory. Izolujemy świeże skrawki nowokory w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Mayumi Sakurabie i Rebeccie Foehring za wyjątkową pomoc techniczną. Ponadto chcielibyśmy podziękować dr. Rodrigo Andrade za pomoc w implementacji protokołów organotypowej hodowli plastrów oraz transfekcji biolistycznej, a także dr Jeanne Nerbonne za udostępnienie konstruktów cDNA do transfekcji. Praca ta była finansowana z grantu NIH: NS044163 z NINDS (dla RCF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Chirurgia / transfekcja / hodowla:

  • Slicer do mózgu: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  • System do biolistyki (Gene Gun): Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Zawartość: pistolet genowy, zestaw węża helowego z regulatorem, stacja do przygotowania rurek (#165-2418), zestaw strzykawek, rurki Tefzel, przecinak do rurek, zestaw optymalizacyjny (#165-2424), przecinak do rurek
    • Regulator helu Bio-Rad (#165-2413)
    • materiały jednorazowe do systemu Helios firmy Bio-Rad:
      • 1.6 μZłote mikronośniki: #165-2264
      • Przewód Tefzel: #165-2441
  • Inkubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766).

    • Pożywki:

  • Surowica końska: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  • HMEM (minimalne podłoże niezbędne z HBSS i HEPES, bez glutaminy: Lonza BioWhittaker nr katalogowy 12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955-6288, opcja 1.
  • HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, opcja 1.
  • MEM (podłoże minimalne niezbędne GIBCO, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Opcja 1.
  • 250 ml Millipore 0,2 μfiltr m: #SC6PU02RE
  • Plastikowe pipety transferowe: Fisher #13-711-20.
  • 50 ml Millipore steriflip 0,22 μfiltr m (#SCGP00525)

    • Pozycje 6-8 otrzymano z: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

    Nagranie:

    1. Pipeta szklana: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
    2. Pozioma wyciągarka elektrod Sutter P-87: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
    3. Wzmacniacz Axon Instruments Multiclamp 700B: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
    4. Oprogramowanie do akwizycji danych PClamp 10: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
    5. Położenie elektrody jest kontrolowane za pomocą Sutter R–manipulatory -200 i sterownik PC-200: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
    6. Mikroskop: pionowy mikroskop Olympus BX-50WI z optyką IR-DIC
    7. Kamera czuła na podczerwień OLY-150 (Olympus) lub DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).

    Bibliografia

    1. Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
    2. Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
    3. Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).
    4. Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons. Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).
    5. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
    6. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).
    7. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
    8. Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue. Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).
    9. Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones. J Physiol. 571, 371-389 (2006).
    10. Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).
    11. Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons. J Physiol. 581, 941-960 (2007).
    12. Johnson, H. A., Buonomano, D. V. A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes. Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).
    13. Johnson, H. A., Buonomano, D. V. Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices. J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).
    14. Malin, S. A., Nerbonne, J. M. Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).
    15. O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
    16. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
    17. Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons. J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).
    18. Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons. J Neurochem. 75, 882-885 (2000).
    19. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
    20. O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun. Nat Proc. 1, 977-981 (2006).
    21. Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
    22. Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).

    Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

    Przedruki i uprawnienia

    Tagi

    Przekroje neocortexutransfekcja biolistycznaekspresja GFPpatch clampmikroskopia podczerwonakontrast interferencyjny r nicowyrejestracja pr dowarejestracja napi ciowa
    Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory
    Skontaktuj się z nami
    Poleć bibliotece

    Prywatność

    Warunki Korzystania

    Zasady

    Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.