Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Streszczenie

Heterogeniczność typów komórek w jądrach oraz brak modeli kultur komórek meiotycznych stanowiły istotne przeszkody w badaniu unikalnych programów różnicowania, które przejawiają się podczas mejozy. Opracowano dwie główne metody oczyszczania, w różnym stopniu, poszczególnych frakcji meiotycznych zarówno u zwierząt dorosłych, jak i niedojrzałych: elutriację lub Staput (sedymentację) z wykorzystaniem gradientów BSA i/lub percollu. Obie te metody opierają się na wielkości i gęstości komórek w celu oddzielenia komórek meiotycznych^1-5. Ogólnie rzecz biorąc, z wyjątkiem kilku populacji komórkowych⁶, protokoły te nie pozwalają na uzyskanie wystarczającej czystości licznych populacji komórek meiotycznych niezbędnych do szczegółowych analiz molekularnych. Co więcej, przy zastosowaniu takich metod zazwyczaj w danym czasie można oczyścić tylko jeden typ komórek meiotycznych, co zwiększa poziom złożoności w zakresie powtarzalności i homogeniczności podczas porównywania próbek komórek meiotycznych.

W niniejszej pracy opisujemy udoskonaloną metodę, która pozwala na łatwą wizualizację, identyfikację i oczyszczanie komórek meiotycznych – od komórek linii zarodkowej po okrągłe spermatydy – z wykorzystaniem FACS w połączeniu z barwieniem Hoechst 33342^7,8. Metoda ta umożliwia uzyskanie ogólnego obrazu całego procesu mejozy oraz pozwala na wysoką puryfikację żywych komórek z większości etapów mejozy. Oczyszczone w ten sposób komórki mogą być następnie szczegółowo analizowane pod kątem zmian molekularnych towarzyszących przebiegowi mejozy, na przykład zmian w ekspresji genów^9,10 oraz dynamiki zajmowania nukleosomów w punktach gorących (hotspots) rekombinacji meiotycznej¹¹.

Protokół

Niniejszy protokół można podzielić na dwa główne etapy: (1) dysocjację i barwienie komórek jądra myszy barwnikiem Hoechst 342, a następnie, w razie potrzeby, (2) sortowanie metodą FACS odpowiednich frakcji meiotycznych, obejmujących wszystkie stadia mejozy, od komórek zarodkowych po okrągłe spermatydy. Po zebraniu te wysoce wzbogacone populacje meiotyczne mogą być wykorzystane do szerokiego zakresu analiz. Protokół ten opisuje dysocjację jednego jądra dorosłego osobnika; objętości można odpowiednio dostosować dla osobników młodych lub dla dodatkowych jąder.

1. Dysocjacja jąder

1. Umieść jeden odkapsułowany jądro w probówce 15-ml.
2. Dodaj 3-ml soli Gey's Balance Salt Solution (GBSS) zawierającej 120 U/ml kolagenazy typu I.
3. Dodaj 10 μl DNAzy I (roztwór stok 1mg/ml w 50% glicerolu) i energicznie potrząśnij ręcznie, aż zauważysz dysocjację kanalików jawych.
4. Mieszaj poziomo przy maksymalnej prędkości 120 rpm przez 15 min w temperaturze 33°C.
5. Wirować przez 1 min pionowo w temperaturze pokojowej i odlać nadosad.
6. Powtórz kroki od 1.2 do 1.5.
7. Dodaj 2,5 ml GBSS zawierającego kolagenazę typu I, 50 μl roztworu stoku trypsyny 50mg/ml resuspendowanej w 1mM HCl oraz 10 μl DNAzy I (1mg/ml), a następnie kilkakrotnie odwróć probówkę.
8. Mieszaj poziomo przy maksymalnej prędkości 120 rpm przez 15 min w temperaturze 3°C.
9. Używając jednorazowej plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem, delikatnie pipetuj w górę i w dół przez 3 min. Na tym etapie nie powinny być widoczne żadne grudki.
10. Dodaj 30 μl trypsyny, 10 μl DNAzy I, 40 μl Hoechst 342 resuspendowanego w DMSO (10 mg/ml) i kilkakrotnie odwróć probówkę.
11. Mieszaj poziomo przy maksymalnej prędkości 120 rpm przez 15 min w temperaturze 33°C.
12. Dodaj 40-μl płodowej surowicy cielęcej (FCS) i wymieszaj poprzez odwracanie w celu inaktywacji trypsyny.
13. Ostateczne barwienie przeprowadza się poprzez dodanie 50 μl Hoechst 342 resuspendowanego w DMSO (10 mg/ml) oraz 10 μl DNAzy I (1 mg/ml).
14. Mieszaj poziomo przy maksymalnej prędkości 120 rpm przez 15 min w temperaturze 33°C.
15. Dysocjowaną próbkę jądra przepuszcza się przez dwa jednorazowe filtry 40-μm zwilżone GBSS do probówki stożkowej 50-ml, następnie dodaje 5 μl roztworu jodku propidyny (PI) i delikatnie miesza próbkę, pipetując kilkakrotnie jednorazową pipetą Pasteura.
16. Próbkę przenosi się do plastikowej strzykawki 5-ml przez igłę 18G. Tę ostatnią zastępuje się igłą 2G w celu podania próbki. Strzykawkę przechowuje się na lodzie i chroni przed światłem do momentu analizy FACS.

2. Konfiguracja FACS i oczyszczanie

1. Sortowanie przeprowadzono na sorterze komórek Becton-Dickinson Aria IIu. Opisane warunki powinny zatem służyć jako punkt wyjścia, szczególnie w przypadku korzystania z innego sprzętu. Zastosowano warunki opisane wcześniej^7,8.
2. Ponieważ Aria IIu nie posiada lasera UV, dostosowano protokół detekcji barwienia Hoescht, wykorzystując fioletowy laser 405nm; dodatkowo zastosowano niebieski laser 48nm do detekcji rozpraszania przedniego i bocznego. Ponadto zmodyfikowano niektóre filtry w celu ograniczenia prześwitu lasera czerwonego, co pozwoliło na uzyskanie większej ostrości wykresów rozproszenia.
3. Laser fioletowy skonfigurowano z filtrem przepustowym 450/40nm do detekcji emisji Hoescht Blue oraz filtrem przepustowym 585/42nm dla emisji Hoescht Red. Do oddzielenia fluorescencji niebieskiej od czerwonej użyto filtra długoprzepustowego 502nm.
4. Użyto dyszy 100 μm przy częstotliwości generowania kropli 28 0 kropli/sekundę. Szybkość progu próbek wynosiła około 40 zdarzeń/sekundę. Opcję kontroli temperatury wykorzystano do utrzymania próbek i probówek odbiorczych w 4°C przez cały czas trwania sortowania. Dodatkowo zastosowano funkcję mieszania próbek przy 20 rpm, aby zapobiec sedymentacji próbki podczas sortowania.
5. Zazwyczaj w ciągu 6-godzinnego sortowania przetwarzano od dwóch do trzech jąder, co pozwalało na zebranie 0,5- 2,0x10⁶ komórek dla każdej populacji (patrz sekcja reprezentatywna).
6. Próbkę sortowano w aliquotach około 750μl dozowanych ze strzykawki. W czasie tych przerw probówki odbiorcze były przechowywane w 4°C, chronione przed światłem i delikatnie mieszane przed wznowieniem sortowania.
7. Posortowane próbki zbierano do borokrzemianowych szklanych probówek odbiorczych 12x75mm zawierających 250μl DMEM uzupełnionego o 10% FCS.

3. Reprezentatywne wyniki:

Typowy profil FACS przedstawiono na Rysunku 1. Wszystkie główne etapy mejozy zostały zidentyfikowane i wskazane w legendzie. Jeśli barwienie Hoechst 342 nie jest optymalne, profil ogólny będzie wydawał się znacznie bardziej zwarty i mniej wyraźny. Częstym problemem jest niedostateczna ilość dodanego DNAse, co prowadzi do szybkiego zlepiania się komórek. Dodanie dodatkowej ilości DNAse na wszystkich wskazanych etapach zazwyczaj rozwiązuje ten problem. Należy minimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania zapasu DNAse (przechowywanego w -20°C), ponieważ prowadzi to do szybkiej utraty aktywności enzymatycznej.

Spo1 to meiotyczna endonukleaza odpowiedzialna za wprowadzanie pęknięć dwuniciowych w miejscach tzw. hotspotów rekombinacji meiotycznej¹².Rysunek 2 przedstawia typowe profile jądra z brakiem genu Spo1, w którym nie powstają pęknięcia dwuniciowe, co prowadzi do przerwania procesu mejozy¹², a także profil przedpokwitowy 13-dniowej myszy, wykazujący asynchroniczny charakter tej pierwszej fali mejozy. Standardowe analizy cytogenetyczne z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białku kompleksu synaptonemalnego 3 (SCP3) oraz fosforylowanej histonie H2AX jako markerów specyficznych dla poszczególnych etapów mejozy powinny zostać początkowo zastosowane w celu potwierdzenia czystości i charakteru posortowanych komórek meiotycznych, zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu¹.

Rycina 1. Profile FACS mejozy typu dzikiego. A) Przedstawiono reprezentatywny wykres rozrzutu. Pokazano wyselekcjonowane bramką komórki. Należy zwrócić uwagę na dużą ilość obecnych w jądrach dorosłych samców zanieczyszczeń, składających się głównie z pustych błon i ogonków spermatyd. B) Reprezentatywny wykres PI pokazuje bardzo ograniczoną liczbę komórek PI-dodatnich obecnych w próbce. Przedstawiono typową bramkę. C) Przedstawiono reprezentatywny profil FACS dla Hoechst 3342 typu dzikiego. Wskazano poszczególne populacje komórek meiotycznych, które można oczyścić za pomocą tej metody do dalszych badań: spermatogonia (Sp), preleptoten (pL), leptoten-zygoten (L/Z), wczesny pachiten (eP), środkowy pachiten (mP), późny pachiten (lP), diploten (D) oraz okrągłe spermatydy (RS).

Rycina 2. Spo1-null i profil FACS mejozy w 13. dniu dla typu dzikiego. A) Typowy Spo1-profil wykazuje wyraźną niewydolność mejozy, w której nie można wykryć żadnego etapu poza leptotenem/zygotenem i wczesnym pachytenem. B) Profil 13-dniowego samca myszy typu dzikiego wykazuje wysoką koncentrację komórek w stadium leptotenu/zygotenu. Ta pierwsza fala mejozy jest raczej asynchroniczna, co zostało wyraźnie zobrazowane przy użyciu tej metodologii.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na jednoczesne oczyszczanie z dorosłych samców myszy pełnego zakresu komórek w różnych stadiach mejozy z bardzo wysoką czystością, co umożliwia badaczom analizę dynamiki tego podstawowego procesu. Oczyszczone komórki mogą być wykorzystywane w licznych zastosowaniach, od ekstrakcji RNA^9,10, mapowania nukleosomów¹¹, detekcji cząsteczek rekombinowanych, analiz białek i wielu innych. Metody detekcji muszą być jednak dostosowane do ilości oczyszczonych komórek mejozy....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kollagenaza typu 1	Worthington Biochemical	CLSS1	Rozpuścić do stężenia 12 000 U/ml w GBSS, przechowywać w temperaturze 4°C°C
Trypsyna	Worthington Biochemical	TRL3	Rozpuścić w 1 mM HCl do stężenia 50 mg/ml, przechowywać w temperaturze 4°C°C
H–chst 33342	Acros Organics	230001000	Roztwór nasycony (10 mg/ml w DMSO, przechowywać w 4°C)°C
DNaza I	Sigma-Aldrich	DNEP	Rozpuścić w wodzie/50% glicerolu do stężenia 1 mg/ml, przechowywać w temperaturze -20°C°C
Gey’zrównoważony roztwór soli	Sigma-Aldrich	G9779
6" Pipeta transferowa	Fisher Scientific	137119D