Opisany w niniejszym protokole model wstrzykiwania autologicznej krwi w celu wywołania krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy wykorzystuje technikę podwójnego wstrzyknięcia, aby zminimalizować ryzyko refluksu krwi wzdłuż kanału igły, nie stosuje przeciwkrzepliwych w systemie pompowania oraz eliminuje całą przestrzeń martwą i rozszerzalne przewody w układzie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wtryskiwanie autologicznej krwi w celu modelowania spontanicznego krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie patofizjologii uszkodzeń po krwotoku wewnątrzczaszkowym (ICH) wymaga powtarzalnego modelu zwierzęcego. Chociaż ICH odpowiada za 10-15% wszystkich udarów, wciąż brakuje specyficznej i skutecznej terapii. Model wstrzyknięcia autologicznej krwi u myszy polega na stereotaktycznym wstrzyknięciu krwi tętniczej do jąder podstawy, co naśladuje spontaniczny krwotok nadciśnieniowy u człowieka. Odpowiedź na krwotok może być następnie badana in vivo, a deficyty neurobehawioralne ilościowo określone, co pozwala na opis powstałej patologii oraz testowanie potencjalnych środków terapeutycznych. Procedura opisana w niniejszym protokole wykorzystuje technikę podwójnego wstrzyknięcia w celu zminimalizowania ryzyka cofania się krwi wzdłuż igły, nie stosuje przeciwzakrzepów w systemie pompowym oraz eliminuje całą przestrzeń martwą i rozszerzalne przewody w układzie.
Protokół
1. Przygotowanie sprzętu
- Przetrzyj ramę stereotaksyczną oraz pompę 75% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne.
- Sterylizuj strzykawkę Hamiltona oraz igłę z topionej krzemionki.
Uwaga: W przypadku zastosowania sterylizacji chemicznej należy kilkukrotnie wypłukać sprzęt w sterylnej wodzie przed użyciem. - Przetrzyj powierzchnię papieru woskowego z parafiny 75% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
2. Przygotowanie myszy do iniekcji
Uwaga: Myszy należy dostarczyć do zwierzęca co najmniej 7 dni przed operacją, aby umożliwić im aklimatyzację w nowym środowisku i zredukować stres.
- Zważ mysz w celu ustalenia wartości bazowej przed operacją.
- Wprowadź znieczulenie, stosując 30% tlenu, 70% podtlenku azotu oraz 4% izofluranu, aż do utraty reakcji na uciśnięcie ogona.
- Wstrzyknij myszy buprenorfinę w dawce 0,1 mg/kg drogą doniesieniową w celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego.
- Wygol skórę głowy.
- Pokryj oczy sterylną wazeliną.
- Zdezynfekuj skórę głowy, przecierając ją trzykrotnie betadyną, a następnie pozostaw do wyschnięcia.
- Wykonaj 1 cm nacięcie pośrodkowe w linii pośrodkowej skóry głowy za pomocą sterylnego skalpela chirurgicznego.
Uwaga: Szerokie nacięcie pozwoli na pełną ekspozycję punktów orientacyjnych czaszki. - Wygol 1 cm brzusznej powierzchni ogona, zaczynając 1 cm od jego nasady, i zdezynfekuj obszar, przecierając go trzykrotnie betadyną.
- Umieść mysz w aparacie stereotaksycznym.
Uwaga: Ważne jest, aby upewnić się, że mysz jest stabilnie zamocowana w ramie, a powierzchnia czaszki znajduje się równolegle do podstawy aparatu, z doskonałą ekspozycją punktu bregma i wolną przestrzenią co najmniej 3 mm na prawo od punktu bregma.
3. Operacja krwawienia wewnątrzczaszkowego
Uwagi: Przez cały czas trwania operacji mysz znajduje się w znieczuleniu przy użyciu 30% tlenu, 70% tlenku azotu i 1-3% izofluranu, z temperaturą ciała utrzymywaną stale na poziomie 37 ± 0.5°C za pomocą podgrzewanego podkładu sterowanego termistorem i monitorowaną za pomocą termometru rektalnego.
- Przymocuj sterylną igłę 27 g do strzykawki 1 cc na ramieniu aparatu stereotaktycznego.
- Reguluj ramię stereotaktyczne, aż igła znajdzie się dokładnie nad bregmą.
- Ustaw ramię tak, aby igła znajdowała się +2.5 mm bocznie względem bregmy, a następnie opuść ją do powierzchni czaszki.
- Ręcznie obracaj strzykawką, aby wykonać otwór trepanacyjny na powierzchni czaszki, jednocześnie delikatnie dociskając ramię aparatu w dół – uważając, aby nie przebić czaszki całkowicie.
- Wyjmij igłę i dokończ wykonywanie otworu trepanacyjnego ręcznie za pomocą strzykawki z igłą.
Uwaga: Dokończenie otworu trepanacyjnego ręcznie pozwala na natychmiastowe rozpoznanie momentu przebicia wewnętrznej blaszki czaszki i minimalizuje ryzyko przypadkowego wprowadzenia igły do miąższu mózgu. - Wykonaj nacięcie poprzeczne na brzusznej stronie ogona za pomocą sterylnego skalpela i pozwól, aby 2-3 duże krople krwi tętniczej spadły na papier woskowy. Następnie szybko zatamuj krwawienie, uciskając miejsce nacięcia sterylną gazą.
- Pobierz 17 μL krwi do strzykawki Hamiltona i umieść strzykawkę w pompie.
- Ustaw ramię stereotaktyczne pod kątem 5° przyśrodkowo względem osi pionowej.
- Ostrożnie wyreguluj ramię stereotaktyczne tak, aby końcówka igły znajdowała się nad otworem trepanacyjnym w czaszce, a następnie opuść igłę o 3.5 mm.
- Odczekaj 2 minuty, a następnie wycofaj igłę o 0.5 mm (tak, aby końcówka znajdowała się na głębokości 3 mm).
- Odczekaj 5 minut, aby umożliwić ponowne rozprężenie się mózgu wokół igły i zminimalizować ryzyko cofania się krwi wzdłuż toru wprowadzenia igły podczas iniekcji.
- Wstrzyknij krew z prędkością 1 μL/minute, aż do podania 7.5 μL.
- Odczekaj 5 minut, aby umożliwić wstępne krzepnięcie krwi oraz przesunięcia tkanek, co zminimalizuje wzrost ciśnienia wewnątrzczaszkowego.
- Wstrzyknij pozostałe 7.5 μL z prędkością 1 μL/minute.
- Pozostaw igłę w miejscu przez 25 minut, aby umożliwić krzepnięcie krwi.
Uwaga: Brak odczekania do momentu krzepnięcia krwi spowoduje cofanie się krwi w miejscu wprowadzenia igły podczas jej wycofywania. - Powoli wycofaj igłę i natychmiast wypłucz ją gorącą wodą, aby zapobiec krzepnięciu resztek krwi wewnątrz igły i zapewnić możliwość jej ponownego użycia.
- Wyjmij mysz z aparatu i zamknij nacięcia na ogonie oraz skórze głowy za pomocą weterynaryjnego kleju chirurgicznego.
- Wyłącz znieczulenie.
- Pozostaw mysz do wybudzenia, zapewniając jej ciągłe ogrzewanie oraz swobodny dostęp do zwilżonego pokarmu.
- Po pełnym wybudzeniu przenieś mysz do klatki z pozostałymi osobnikami z miotu. Umieść mokrą granulkę pokarmową na dnie klatki, aby ułatwić zwierzętom dostęp do jedzenia.
4. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Przekrój wieńcowy mózgu myszy 15 minut po zabiegu ICH. Bezpośrednio po uśmierceniu zwierzęcia sprawdzono powodzenie modelu ICH na podstawie makroskopowej oceny przekroju wieńcowego w miejscu wprowadzenia igły. Krwotoki, które rozprzestrzeniały się do podstawy mózgu, w górę toru igły poza ciało modzelowate lub do komór mózgu, uznawano za niepowodzenie, a taką mysz wykluczano ze wszystkich analiz. Ogólny wskaźnik powodzenia ICH wyniósł 75-85% u 50 myszy przy 0% śmiertelności.
Rycina 2. Test cylindra wykazuje lewostronną hemiparezę po krwotoku wewnątrzczaszkowym (ICH) w prawych jądrach podstawy. (A) Przykładowe wspięcie się myszy na tylne łapy po zabiegu ICH. Zwróć uwagę na oparcie tylko prawej przedniej kończyny o ściankę cylindra po ICH w lewych jądrach podstawy. (B) Wykres wyników testu cylindra 1 z kohorty myszy po zabiegu ICH (n=5) w porównaniu z grupą sham (n=4). Myszy z grupy sham przeszły wszystkie procedury z wyjątkiem wstrzyknięcia krwi (igła została wprowadzona do mózgu). Każdą mysz umieszczono w przezroczystym szklanym cylindrze o średnicy 12 cm i obserwowano podczas 20 wspięć. Początkowe ustawienie przednich kończyn na ściance cylindra było oceniane przy każdym wspięciu. Kolejne ruchy (takie jak eksploracja boczna) nie były oceniane, dopóki mysz nie wróciła na ziemię i nie nastąpiło kolejne wspięcie. Indeks lateralizacji obliczono jako (# opierań prawej przedniej kończyny o ściankę cylindra - # opierań lewej przedniej kończyny)/(# prawej + # lewej + # obu), gdzie 0 oznacza brak preferencji kończyny przedniej, a 1 oznacza, że używana była tylko prawa przednia kończyna.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten chirurgiczny model krwawienia wewnątrzczaszkowego u myszy, wykorzystujący autologiczną krew z tętnicy ogonowej, pozwala na uzyskanie powtarzalnego modelu spontanicznego krwawienia do jąder podstawy. Model ICH u myszy daje korzyść w postaci dostępności zwierząt transgenicznych do badania patofizjologii; jednak ich niewielki rozmiar sprawia, że zabiegi neurochirurgiczne są trudniejsze technicznie niż w przypadku większych zwierząt.
Model z użyciem kolagenazy oraz model wstrzykiwania autologi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca została sfinansowana ze stypendium Institute for Translational Medicine and Therapeutics oraz grantu szkoleniowego Institute for Medicine and Engineering (T32HL007954) na University of Pennsylvania, a także z grantu Marlene L. Cohen and Jerome H. Fleisch Scholar Grant w University of Connecticut Health Center (LHS) oraz NIH NS-029331(FAW).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereotaktyczna rama do neurochirurgii myszy (St–lting, 51925) | |||
| Pompa mikroinfuzyjna i procesor (UMP-3 oraz Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Ogrzewacz dla myszy (St–lting, 50300) | |||
| Inhalacyjna narkoza dla myszy (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| Szczelna borokrzemianowa strzykawka Hamiltona o pojemności 25 μL z powlekanym tłokiem, bez igły | |||
| (firma Hamilton, Reno, NV, strzykawka 1702RN: 765401, tulejka: 30949, przekładka: 30946) | |||
| igła z topionego kwarcu przycięta do długości 2 cm (Hamilton, 17739) | uwaga: strzykawkę Hamiltona i igłę z topionego kwarcu można wykorzystać w wielu operacjach, jeśli zostaną wysterylizowane przed każdym zabiegiem. Materiały te są kluczowe dla uniknięcia krzepnięcia krwi. | ||
| Sterylne rękawiczki chirurgiczne | |||
| Fartuch chirurgiczny, czepka i maseczka | |||
| Betadyna | |||
| 75% etanol | |||
| sterylna igła 27 g (jednorazowa) | |||
| sterylna strzykawka 1 cc (jednorazowa) | |||
| sterylne ostrze chirurgiczne | |||
| Cidex | |||
| woda sterylna | |||
| buprenorfina i izofluran | |||
| sterylna gaza | |||
| kwadraty z papieru woskowego (parafiny) | |||
| Weterynaryjny klej chirurgiczny (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
Bibliografia
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
