Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podjęto wiele wysiłków w celu opracowania i udoskonalenia metodologii regeneracji funkcjonalnych bypassów tętniczych o małej średnicy. W środowisku fizjologicznym zarówno stymulacja mechaniczna, jak i chemiczna są niezbędne do utrzymania prawidłowego rozwoju i funkcjonalności naczyń tętniczych1,2.
Systemy hodowli w bioreaktorach opracowane przez naszą grupę zostały zaprojektowane w celu wspierania regeneracji naczyń w precyzyjnie kontrolowanym środowisku chemechanicznym, naśladującym warunki panujące w naczyniach natywnych. Procedury montażu i konserwacji naszego bioreaktora są dość proste i wysoce powtarzalne3,4. Komórki mięśni gładkich (SMCs) wysiewa się na rurkowatą siatkę z kwasu poliglikolowego (PGA), która jest nasunięta na elastyczną rurkę silikonową, a następnie hoduje w bioreaktorze z pulsacyjną stymulacją lub bez niej przez okres do 12 tygodni. Istnieją cztery główne cechy, które odróżniają nasz bioreaktor od niektórych jego poprzedników. 1) W przeciwieństwie do innych systemów hodowli, które symulują jedynie biochemiczne otoczenie natywnych naczyń krwionośnych, nasz bioreaktor tworzy również fizjologiczne środowisko pulsacyjne poprzez przykładanie cyklicznego odkształcenia radialnego do hodowanych naczyń. 2) Wiele zaprojektowanych naczyń można hodować jednocześnie w różnych warunkach mechanicznych w ramach kontrolowanego środowiska chemicznego. 3) Bioreaktor umożliwia łatwe pokrycie strony luminalnej zaprojektowanych naczyń monowarstwą komórek śródbłonka (EC) na potrzeby modeli implantacji zwierzęcych. 4) Nasz bioreaktor umożliwia również hodowlę zaprojektowanych naczyń o różnych średnicach w zakresie od 1 mm do 3 mm, co eliminuje konieczność dostosowywania każdego pojedynczego bioreaktora do konkretnego rozmiaru średnicy.
Hodowane w naszym bioreaktorze naczynia inżynieryjne w pewnym stopniu przypominają pod względem histologicznym natywne naczynia krwionośne. Komórki w ścianach naczyń wykazują ekspresję dojrzałych markerów kurczliwych SMC, takich jak ciężki łańcuch miozyny mięśni gładkich (SMMHC)3. W macierzy zewnątrzkomórkowej odkładana jest znaczna ilość kolagenu, który odpowiada za ostateczną wytrzymałość mechaniczną naczyń inżynieryjnych5. Analiza biochemiczna wskazuje również, że zawartość kolagenu w naczyniach inżynieryjnych jest porównywalna do zawartości w natywnych tętnicach6. Co istotne, pulsacyjny bioreaktor w sposób spójny regenerował naczynia wykazujące właściwości mechaniczne pozwalające na przeprowadzenie udanych eksperymentów z implantacją w modelach zwierzęcych3,7. Dodatkowo bioreaktor ten może zostać zmodyfikowany w celu umożliwienia nieinwazyjnej oceny i śledzenia przebudowy kolagenu w czasie rzeczywistym przy użyciu nieliniowej mikroskopii optycznej (NLOM)8. Podsumowując, bioreaktor ten powinien stanowić doskonałą platformę do badania podstawowych mechanizmów regulujących regenerację funkcjonalnych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy.
Protokół
Autoklawowanie
Zmontować i wysterylizować w autoklawie przewody systemu przepływowego oraz elementy bioreaktora (sam bioreaktor i silikonowy korek) zgodnie z instrukcjami przedstawionymi na Ryc. 1 i Ryc. 2. Przewód doprowadzający posiada złączkę męską na jednym końcu i otwarty koniec po drugiej stronie. Trzy krótkie segmenty przewodów są wprowadzone przez silikonową nasadkę w celu wymiany gazowej.
1. Szycie siatki PGA
- Wytnij arkusz siatki PGA o wymiarach 1,1 cm x ~8 cm (zależnie od wielkości bioreaktora).
- Wyczyść rurkę silikonową (średnica wewnętrzna 3 mm) wodą destylowaną (dH20) i wysusz na powietrzu przed użyciem.
- Używając nici chirurgicznej Dexon 6.0, przyszyj siatkę PGA wokół czystej rurki silikonowej, zaczynając od trzech węzłów chirurgicznych, a następnie wykonując pojedyncze szwy.
2. Obróbka powierzchniowa rusztowań z PGA
- Zanurz rusztowania PGA w 1M NaOH na 1-2 min, zanotuj czas obróbki i stosuj ten sam czas dla wszystkich rusztowań PGA.
- Płucz rusztowania PGA w kąpielach z dH2O przez 2 minuty, powtarzając czynność 3 razy.
- Osusz rusztowania PGA za pomocą chusteczek Kimwipes po każdym zanurzeniu w kąpielach z dH2O.
- Susz rusztowania PGA w dygestorium do hodowli tkankowej przez 15 minut przy włączonym nadmuchu, aż całkowicie wyschną.
3. Szycie ramion z Dacronu
- Za pomocą nici Prolene 4.0 przyszyć niewielkie fragmenty mankietów z Dacronu (1cm) do każdego końca siatki PGA, zachowując zakładkę o szerokości 2-3mm. Uwaga: należy uważać, aby nie przebić rurki silikonowej (Rysunek 3).
- Tą samą nicią wykonać trzy szwy wokół wolnego końca mankietów z Dacronu. Należy pozostawić wystarczająco długie końce nici Prolene do etapu 5.1 (Rysunek 3).
4. Montaż bioreaktora (Dzień przed rozpoczęciem hodowli w bioreaktorze)
- Namocz zszytą siatkę i rurki silikonowe, narzędzia chirurgiczne oraz cienki drut w 70% kąpieli etanolowej przez 20-30 minut.
- Otwórz worki do autoklawowania zawierające bioreaktor i zanurz go w 70% kąpieli etanolowej na co najmniej 30 minut przed montażem. Pamiętaj, aby dokładnie przepłukać bioreaktor etanolem. Narażenie wszystkich komponentów bioreaktora na 70% etanol stanowi dodatkowy etap sterylizacji. Krok ten usuwa również endotoksyny, których autoklawowanie nie eliminuje, a które są szkodliwe dla komórek naczyniowych.
- Przeciągnij rurki silikonowe przez boczne ramiona, używając cienkiego drutu do ich wciągnięcia.
- Wyjmij bioreaktor z kąpieli etanolowej (siatkę pozostaw zanurzoną w etanolu). Zamocuj rusztowanie PGA wewnątrz bioreaktora, mocując mankiety z Dacronu na rozszerzonych krawędziach szklanych poprzez zaciśnięcie i zawiązanie szwów z Prolene (Rycina 3).
- Połącz jedną stronę bocznych ramion bioreaktora z konektorami za pomocą rurek silikonowych.
- Naciągnij drugą stronę rurek silikonowych z odpowiednią siłą i włóż pozostałe dwa konektory do rurek silikonowych. Mocno trzymaj rurki silikonowe podczas wkładania konektorów!
- Ponownie włóż bioreaktor do kąpieli etanolowej i przepłucz etanolem, delikatnie wyciągając konektory z bocznych ramion.
- Odwróć bioreaktor do góry dnem i pozostaw do namoczenia na 10 minut.
- Odwróć bioreaktor z powrotem i mocz przez kolejne 10 minut.
- Odlej cały etanol.
- Przygotuj trzy duże szalki Petriego (10 cm) w szeregu i umieść bioreaktor w środkowej szalce, aby zebrać nadmiar etanolu skapującego z końców rurek.
- Przepłucz bioreaktor i siatkę PGA wodą do hodowli tkankowej, używając pipety 5 ml lub 10 ml. Przepłucz również rurki silikonowe wodą do hodowli tkankowej.
- Dokładnie odlej całą nadmiarową wodę do szalek Petriego znajdujących się po obu stronach bioreaktora.
- Susz bioreaktor przez noc w komorze z włączonym nawiewem i wyłączonym promieniowaniem UV.
- Uwagi dodatkowe: upewnij się, że w bioreaktorze znajduje się sterylny mieszadło magnetyczne. Od tego momentu unikaj pochylania się bezpośrednio nad bioreaktorem, aby uniknąć kontaminacji. Potnij wiele pasków parafilmu i namocz je w małej kąpieli z 70% etanolu (dobrze sprawdzi się duża szalka Petriego).
5. Dzień 1: Konfiguracja bioreaktora
- Na otwarcie każdego bioreaktora należy nałożyć sterylną szalkę Petriego, aby chronić znajdujące się wewnątrz rusztowanie z PGA przed zanieczyszczeniami.
- Zmontować układ przepływowy z bioreaktorem zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 4 i zabezpieczyć wszystkie połączenia folią Parafilm.
- Najpierw przemyć złącza chusteczkami nasączonymi alkoholem.
- Podłącz port wtryskowy do trzeciego, niewykorzystanego ramienia bioreaktora.
- Zdejmij dreny typu walrus i zawiąż niebieski koniec zestawu do rozcieńczania soli fizjologicznej jak najbliżej złącza Y. Przesuń zacisk rurki na odpowiednie miejsce, aby zapobiec przedostawaniu się cieczy do tej części rurki.
- Zdejmij worek do infuzji dożylnej, & podłączyć rurkę walrus (czerwoną) do przeciwległego końca worka z płynem infuzyjnym. Przed podłączeniem należy przetrzeć port wkłucia chusteczką nasączoną alkoholem.
- Podłącz walrus do jednej strony układu przepływowego (za pomocą białej rurki końcowej).
- Wprowadź trójdrożny kurek do układu przepływowego.
- Zdejmij przetwornik ciśnienia & podłączyć do kurka trójdrożnego.
- Drugi koniec przetwornika ciśnienia przymocuj do środniowego otworu w worku.
- Podłącz bioreaktor do układu przepływowego za pomocą złącza w kształcie litery Y. Za pomocą strzykawki 60 ml dodaj 350 ml 1% fungizonu (wymieszaj 5 ml fungizonu z 495 ml PBS) do worka do infuzji.
- Ściśnij worek z kroplówką IV, aby przepłukać układ, regulując kurki odcinające w celu umożliwienia przepływu PBS. Uwaga: sprawdź wnętrze bioreaktora, aby upewnić się, że nie ma wycieków.
- Resuspendować 8 x 106 SMC (około jednej konfluentnej kultury w kolbie T75) w 1,25 ml pożywki i zasiać na każdy rusztowanie z PGA. Należy upewnić się, że zawiesina komórkowa została równomiernie naniesiona kroplowo na złącze siatki z PGA i Dacronu, a także na dolną stronę siatki z PGA.
- Przetrzeć krawędź bioreaktora chusteczką nasączoną alkoholem, obracając bioreaktor w bok, unikając trzymania go w powietrzu.
- Zespół pokrywy z silikonowym korkiem (Rysunek 2)
- Ostrożnie odklej torbę do autoklawowania, dbając o to, aby nie odsłonić spodu pokrywki.
- Podłączyć port do wstrzykiwania do zgłębnika do żywienia w miejscu złącza męskiego.
- Przymocuj PTFE 0.20 μm filtry do każdego z trzech portów powietrznych.
- Należy uważać, aby podczas tego procesu nie odsłonić i nie dotknąć spodu pokrywki.
- Uszczelnij port wtryskowy folią Parafilm.
- Wstaw silikonową zatyczkę do szklanego bioreaktora i upewnij się, że rurka doprowadzająca wewnątrz bioreaktora nie dotyka zasianych rusztowań PGA. Uszczelnij krawędź zatyczki folią Parafilm.
- Umieść bioreaktor z systemem przepływowym w inkubatorze (na boku) i obracaj bioreaktorem co 5 minut przez okres od 25 do 30 minut.
- Napełnić komorę bioreaktora 400 ml pożywki hodowlanej 4-10 zgodnie z opisem w (Tabeli 1). Pożywka ta jest „zoptymalizowana” dla inżynierowanych tętnic świńskich.
6. Dzień 6-7: Uruchomienie pompy i pierwsze karmienie
- Hoduj zasiane rusztowania statycznie, bez pulsacyjnego pompowania przez silikonowe rurki, przez 6-7 dni. W tym czasie nie ma potrzeby wymiany medium ani suplementacji witaminą C.
- Przed włączeniem pompy upewnij się, że w systemie przepływowym nie występują wycieki PBS ani zagięcia rurek.
- Włącz pompę systemu przepływowego i dostosuj ustawienia pompy tak, aby odczyt ciśnienia wynosił około 270/-30mmHg.
- Codziennie w trakcie hodowli zapisuj wartości ciśnienia i utrzymuj je na poziomie 270/-30mmHg. Przetwornik ciśnienia można podłączyć do komputera w celu odczytu i monitorowania ciśnienia.
Pierwsze karmienie
- Zamontuj port wtryskowy i filtr PTFE na pokrywach zasilających, przeznaczonych zarówno do wymiany medium, jak i do usuwania zużytego medium.
- Mocno zamocuj rurkę zasilającą na pompie, a następnie wprowadź jeden jej koniec do portu zasilającego bioreaktora, a drugi do pokrywy zasilającej. Należy pamiętać o przetarciu portów wtryskowych chusteczkami nasączonymi etanolem.
- Użyj dwukierunkowej pompy Masterflex, aby odessać 200ml medium. Następnie użyj nowej rurki zasilającej, aby wpompować 200ml świeżego medium z powrotem do bioreaktora. Zawsze rozpoczynaj od bardzo małej prędkości, szczególnie podczas pompowania medium z powrotem do bioreaktora.
- Wymieniaj medium i uzupełniaj kwas askorbinowy 2 razy w tygodniu. Aby dodać kwas askorbinowy, użyj strzykawki 30ml, aby odessać 25ml medium i odstawić je na bok w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Rozpuść 25mg kwasu askorbinowego w 5ml PBS i przefiltruj go przez filtr 0,22 μm. Najpierw wstrzyknij sterylny kwas askorbinowy do rurki zasilającej, a następnie dodaj wcześniej odessane 25ml medium. Skład medium podano w Tabeli 1.
7. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Powyżej przedstawiono przewody i złączki do montażu systemu przepływowego.
Rycina 2. Powyżej przedstawiono zestaw pokrywy z silikonowym korkiem.
Rysunek 3. Powyżej przedstawiono schematy montażu bioreaktora. Wewnątrz bioreaktora mankiety z dakronu są przymocowane do szklanych ramion za pomocą niebieskich węzłów szewskich.
Na powyższej ilustracji przedstawiono układ przepływowy połączony z przewodami i bioreaktorem (Rysunek 4). Płyn w przewodach L/S18 będzie tłoczony przez pompę Masterflex, co wymusi przepływ. Przetwornik ciśnienia będzie mierzył ciśnienie w górnym strumieniu, przed wprowadzeniem do bioreaktora.
Rycina 5. Obraz zebranego zmodyfikowanego naczynia. Zmodyfikowane naczynia będą nieprzezroczyste i osiągną grubość ścianki około 250μm po 8-tygodniowej hodowli w warunkach pulsacyjnych.
Rycina 6. Przekroje poprzeczne inżynieryjnych naczyń barwione hematoksyliną i eozyną. A i B przedstawiają odpowiednio naczynia niepoddane i poddane pulsacji po 8 tygodniach. C i D przedstawiają odpowiednio naczynia niepoddane i poddane pulsacji po 4 tygodniach. L oznacza stronę światła naczyń. Pasek skali wynosi 100μm.
Rysunek 7. Barwienie trichromem Massona na kolagen (niebieski) w przekrojach poprzecznych zaprojektowanych naczyń. A i B przedstawiają odpowiednio naczynia niepulsacyjne i pulsacyjne po 8 tygodniach. C i D przedstawiają odpowiednio naczynia niepulsacyjne i pulsacyjne po 4 tygodniach. Należy zauważyć, że naczynie pulsacyjne po 4 tygodniach wykazuje więcej kolagenu niż jego niepulsacyjny odpowiednik. Białe strzałki wskazują pozostałe fragmenty PGA w naczyniach. Pasek skali wynosi 100μm.
Rycina 8. Barwienie immunochemiczne markerów SMC w bydlęcych naczyniach inżynieryjnych. $\alpha$-aktyna mięśni gładkich, kalponina-1 oraz ciężki łańcuch miozyny mięśni gładkich (SMMHC) to odpowiednio wczesne, pośrednie i późne markery kurczliwości SMC. Pod koniec 12-tygodniowej hodowli komórki w ścianie naczynia wykazują ekspresję SM $\alpha$-aktyny oraz umiarkowane ilości kalponiny-1 i SMMHC. Pasek skali wynosi 20μm.
| Komponent | Ilość |
| DMEM (DME/low modified) | 500 ml |
| FBS (płodowa surowica bydlęca) inaktywowana termicznie | 100 ml |
| HEPES 1,0 M | 5 ml |
| Witamina C (rozpuszczona w PBS lub DMEM) | 25 mg |
| Prolina/Glicyna/Alanina 25 mg/25 mg/10 mg (rozpuszczone w 5 ml PBS) | 5 ml |
| CuSO44 1.5 μg (rozpuszczone w 1 ml PBS) | 1 ml |
| Penicylina G w stężeniu 10 000 j./ml | 5 ml |
| PDGF-BB (czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego-BB) w stężeniu 10 ng/ml | 5μg |
| bFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów) w stężeniu 10 ng/ml | 5μg |
Tabela 1. Składniki pożywki „4-10” przedstawiono w powyższej tabeli. Z wyjątkiem PDGF-BB i bFGF, wszystkie pozostałe składniki należy przefiltrować przez filtr 0.2μm przed użyciem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jakość konstruowanych naczyń zależy w dużej mierze od jakości SMC stosowanych w hodowli tkankowej. Krytyczne aspekty fenotypu SMC obejmują morfologię kurczliwą, niską liczbę pasaży oraz zdolność do proliferacji wewnątrz bioreaktora. Zalecamy, aby liczba pasaży nie przekraczała P3 w momencie zasiewania komórek na rusztowanie polimerowe. Ponadto kluczowe jest potwierdzenie, że źródła SMC są wolne od mykoplazm przed ich użyciem. Zaobserwowaliśmy, że komórki zanieczyszczone mykoplazmami prowadzą do znacznego spadku prolifera...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak declared konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantów National Institutes of Health R01 EB-008836 oraz R01 HL083895 (oba przyznane L.E.N.). Chcielibyśmy podziękować Darylowi Smithowi, szklarzowi uniwersyteckiemu, za wykonanie bioreaktorów na potrzeby naszych badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| FBS (płodowa surowica bydlęca) inaktywowana ciepłem | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&R&D Systems | 520-BB | |
| Penicylina G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Siarczan(VI) miedzi(II) | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Glicyna | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-alanina | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-prolina | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Kwas askorbinowy | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Korek silikonowy | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Przewody Masterflex L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Pompa Masterflex | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| mankiet z Dacronu | Maquet | 174406 | |
| filc z PGA | Concordia | MO000877-01 | |
| szew Surgipro II 4-0 1,5 metric | Syneture | VP-557-X | |
| szew Dexon 6-0 0,7 metric | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μfiltry PTFE z membraną | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Kurk trójdrożny | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Przetwornik ciśnienia | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| worki do wlewów dożylnych | Baxter International Inc. | R4R2110 | |
| Zestaw do rozcieńczania w soli fizjologicznej | Arrow International | W20030 | |
| Przewody silikonowe | Saint-Gobain | F05027 |
Bibliografia
- Risau, W., Flamme, I. Vasculogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , American Heart Association. (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
