Inżynieria biologicznych przeszczepów naczyniowych przy użyciu bioreaktora pulsacyjnego

Summary

Nasza grupa opracowała system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne pulsacyjne obciążenia układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy.

Abstract

Wiele wysiłku włożono w rozwój i postęp metodologii regeneracji funkcjonalnych pomostów tętniczych o małej średnicy. W środowisku fizjologicznym zarówno stymulacja mechaniczna, jak i chemiczna jest niezbędna do utrzymania prawidłowego rozwoju i funkcjonalności naczyń tętniczych^1,2.

Systemy hodowli bioreaktorów opracowane przez naszą grupę są zaprojektowane do wspomagania regeneracji naczyń w precyzyjnie kontrolowanym środowisku chemo-mechanicznym, naśladującym środowisko naczyń macierzystych. Nasze procedury montażu i konserwacji bioreaktorów są dość proste i wysoce powtarzalne^3,4. Komórki mięśni gładkich (SMC) są wysiewane na rurkową siatkę kwasu poliglikolowego (PGA), która jest nawleczona na podatne rurki silikonowe i hodowana w bioreaktorze ze stymulacją pulsacyjną lub bez niej przez okres do 12 tygodni. Istnieją cztery główne atrybuty, które odróżniają nasz bioreaktor od niektórych poprzedników. 1) W przeciwieństwie do innych systemów hodowlanych, które symulują tylko biochemiczne otoczenie rodzimych naczyń krwionośnych, nasz bioreaktor tworzy również fizjologiczne środowisko pulsacyjne, stosując cykliczne naprężenie promieniowe do naczyń w hodowli. 2) Wiele zaprojektowanych naczyń może być hodowanych jednocześnie w różnych warunkach mechanicznych w kontrolowanym środowisku chemicznym. 3) Bioreaktor umożliwia łatwe powlekanie monowarstwy komórek śródbłonka (EC) po stronie światła zaprojektowanych naczyń do implantacji zwierząt. 4) Nasz bioreaktor może również hodować naczynia inżynieryjne o różnych średnicach w zakresie od 1 mm do 3 mm, oszczędzając wysiłek związany z dostosowaniem każdego bioreaktora do określonego rozmiaru średnicy.

Zmodyfikowane naczynia hodowane w naszym bioreaktorze przypominają histologicznie do pewnego stopnia rodzime naczynia krwionośne. Komórki w ścianach naczyń wyrażają dojrzałe markery kurczliwości SMC, takie jak łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich (SMMHC)³. Znaczna ilość kolagenu odkłada się w macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest odpowiedzialna za ostateczną wytrzymałość mechaniczną zaprojektowanych naczyń⁵. Analiza biochemiczna wskazuje również, że zawartość kolagenu w zmodyfikowanych naczyniach jest porównywalna z zawartością kolagenu w tętnicach natywnych⁶. Co ważne, pulsacyjny bioreaktor ma konsekwentnie regenerowane naczynia, które wykazują właściwości mechaniczne umożliwiające udane eksperymenty implantacji na modelach zwierzęcych^3,7. Ponadto bioreaktor ten może być dalej modyfikowany, aby umożliwić ocenę i śledzenie przebudowy kolagenu w czasie w czasie w sposób nieinwazyjny przy użyciu nieliniowej mikroskopii optycznej (NLOM)⁸. Podsumowując, bioreaktor ten powinien służyć jako doskonała platforma do badania podstawowych mechanizmów regulujących regenerację funkcjonalnych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy.

Protocol

Autoklaw

Złóż i zautoklawuj rurki do systemu przepływu i komponentów bioreaktora (sam bioreaktor i silikonowa pokrywka korka) zgodnie z instrukcjami na Rysunku 1 i Rysunku 2. Rurka zasilająca ma męskie złącze na jednym końcu i otwarte zakończenie po drugiej stronie. Trzy krótkie segmenty rurki są wprowadzane przez silikonową nasadkę do wymiany gazu.

1. Szycie siatki PGA

1. Przytnij siatkę PGA do arkusza o wymiarach 1,1 cm x ~ 8 cm (w zależności od wielkości bioreaktora).
2. Wyczyść silikonowe rurki (średnica wewnętrzna 3 mm) wodą destylowaną (dH20) i wysusz na powietrzu przed użyciem.
3. Użyj szwu Dexon 6.0, aby uszyć siatkę PGA wokół czystej silikonowej rurki, zaczynając od trzech węzłów chirurgicznych, a następnie pojedynczych szwów.

2. Obróbka powierzchniowa rusztowań PGA

1. Zanurz rusztowania PGA w 1M NaOH na 1-2 minuty i zapisz czas leczenia i użyj tego samego czasu dla wszystkich rusztowań PGA.
2. Opłucz rusztowania PGA w kąpielach dH2O przez 2 minuty 3 razy.
3. Rusztowania Pat PGA suszyć chusteczkami Kimwipes między każdym zanurzeniem w kąpielach dH₂O.
4. Wysuszyć rusztowania PGA pod kapturem do hodowli tkankowej do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut z włączoną dmuchawą.

3. Szycie ramion z dakronu

1. Użyj szwu Prolene 4.0, aby przyszyć małe kawałki mankietów Dacron (1 cm) na każdym końcu siatki PGA z zakładką 2-3 mm. Uwaga: uważaj, aby nie przebić rurki silikonowej (Rysunek 3).
2. Użyj tego samego szwu, aby uszyć trzy szwy wokół wolnego końca mankietów dakronowych. Upewnij się, że pozostawiłeś wystarczającą ilość szwów na wolnych końcach szwu Prolene dla kroku 5.1 (Rysunek 3).

4. Montaż bioreaktora (dzień przed rozpoczęciem hodowli w bioreaktorze)

1. Namocz szytą siatkę i silikonowe rurki, narzędzia chirurgiczne i cienki drut w kąpieli z 70% etanolem przez 20-30 minut.
2. Otwórz woreczki autoklawu zawierające bioreaktor i zanurz go w kąpieli etanolowej 70% na co najmniej 30 minut przed montażem. Upewnij się, że bioreaktor został dokładnie przepłukany etanolem. Wystawienie wszystkich elementów bioreaktora na działanie 70% etanolu jest etapem sterylizacji dodatkowej. Ten krok usuwa również endotoksynę, która nie jest usuwana przez autoklawowanie i jest szkodliwa dla komórek naczyniowych.
3. Przeciągnij silikonową rurkę przez boczne ramiona za pomocą cienkiego drutu, aby ją przeciągnąć.
4. Wyjmij bioreaktor z kąpieli etanolowej (utrzymuj siatkę zanurzoną w etanolu). Zamocuj rusztowanie PGA wewnątrz bioreaktora, mocując mankiety dakronowe na rozszerzających się szklanych wargach, zaciskając i wiążąc szwy Prolene (Rysunek 3).
5. Podłącz jedną stronę ramion bocznych bioreaktora do złączy za pomocą silikonowej rurki.
6. Pociągnij drugą stronę silikonowej rurki z wystarczającym napięciem i włóż pozostałe dwa łączniki do silikonowej rurki. Trzymaj się mocno silikonowej rurki podczas wkładania złączy!
7. Włóż ponownie bioreaktor do kąpieli etanolowej i przepłucz etanolem, delikatnie wyciągając złączki z ramion bocznych.
8. Odwróć bioreaktor i pozostaw do namoczenia na 10 minut.
9. Odwróć bioreaktor prawą stroną do góry i zanurz się przez dodatkowe 10 minut.
10. Spuść cały etanol.
11. Ustaw trzy duże szalki Petriego (10 cm) szeregowo i umieść bioreaktor w środkowej czaszy, aby zatrzymać nadmiar etanolu kapiący z końców rurek.
12. Przepłukać bioreaktor i siatkę PGA wodą z hodowli tkankowych za pomocą pipety o pojemności 5 ml lub 10 ml. Przepłucz również wodę z kultur tkankowych do silikonowych rurek.
13. Dokładnie spuść nadmiar wody na szalki Petriego po obu stronach bioreaktora.
14. Suchy bioreaktor przez noc w okapie z włączoną dmuchawą i wyłączonym promieniowaniem UV.
15. Dodatkowe uwagi: upewnij się, że sterylne mieszadło znajduje się w bioreaktorze. Upewnij się, że od tego momentu nie "unosisz się" nad bioreaktorem, aby uniknąć zanieczyszczenia. Pokrój dużo pasków parafilmu i zanurz je w małej kąpieli z 70% etanolem (dobrze sprawdza się duża szalka Petriego).

5. Dzień 1: Konfiguracja bioreaktora

1. Umieść sterylną szalkę Petriego nad otworem każdego bioreaktora, aby chronić rusztowanie PGA wewnątrz przed zanieczyszczeniami.
2. Zamontuj system przepływu do bioreaktora, jak pokazano na rysunku 4, i zamontuj wszystkie złącza połączeniowe.
   1. Najpierw przetrzyj złącza chusteczkami nasączonymi alkoholem.
   2. Podłącz port iniekcyjny do trzeciego, nieużywanego ramienia bioreaktora.
   3. Usuń rurkę morsa i przywiąż niebieski koniec zestawu do rozcieńczania soli fizjologicznej jak najbliżej złącza Y. Pociągnij rurkę clamp na miejscu, aby upewnić się, że nie ma przenoszenia płynu do tej części rurki
   4. Wyjmij worek dożylny i przymocuj rurkę morsa (czerwoną) do drugiego końca worka dożylnego. Pamiętaj, aby najpierw wytrzeć port wkładania chusteczką nasączoną alkoholem.
   5. Przymocuj morsa do jednej strony systemu przepływu (za pomocą białej rurki końcowej).
   6. Włóż 3-drogowy kran do układu przepływowego.
   7. Zdemontować przetwornik ciśnienia i podłączyć do trójdrogowego kranu.
   8. Przymocuj drugi koniec przetwornika ciśnienia do środkowego otworu w torbie.
3. Podłączyć bioreaktor do systemu przepływowego za pomocą złącza Y. Za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml dodaj 350 ml 1% fungizonu (zmieszaj 5 ml fungizonu z 495 ml PBS) do worka dożylnego.
4. Ściśnij worek dożylny, aby przepłukać przepływający system, regulując kurki odcinające, aby umożliwić przepływ PBS. Uwaga: sprawdź wnętrze bioreaktora, aby upewnić się, że nie ma wycieków.
5. Ponownie zawiesić 8 x10⁶ SMC (około jednego zlewającego się T75) w 1,25 ml pożywki i wysiewać nasiona na każdym rusztowaniu PGA. Upewnij się, że zawiesina komórek została równomiernie naniesiona na połączenie siatki PGA z Dakronem, a także na dolną stronę siatki PGA.
6. Przetrzyj krawędź bioreaktora chusteczką nasączoną alkoholem, obracając bioreaktor na boki, unikając zawisu.
7. Zespół pokrywki z silikonowym korkiem (rysunek 2)
   1. Ostrożnie oderwij worek autoklawu z powrotem, uważając, aby nie odsłonić dolnej części pokrywy.
   2. Podłącz port wtryskowy do rurki zasilającej na złączu męskim.
   3. Podłącz filtry PTFE 0,20 μm do każdego z trzech portów powietrznych.
   4. Uważaj, aby nie odsłaniać/nie dotykać dolnej części pokrywy podczas tego procesu.
   5. Parafilm port iniekcyjny.
8. Włóż silikonową pokrywkę korka do szklanego bioreaktora i upewnij się, że rurka zasilająca wewnątrz bioreaktora nie dotyka rusztowań PGA z nasionami. Parafilm wokół pokrywy.
9. Umieść bioreaktor z układem przepływowym wewnątrz inkubatora (na jego boku) i obracaj bioreaktor co 5 minut przez 25-30 minut.
10. Napełnij komorę bioreaktora 400 ml naszych 4-10 pożywek hodowlanych, jak opisano w (Tabela 1). Ta pożywka hodowlana jest "zoptymalizowana" pod kątem tętnic modyfikowanych przez świnie.

6. Dzień 6-7: Włączenie pompy i pierwsze karmienie

1. Rusztowania z nasionami rosną statycznie, bez pulsacyjnego pompowania przez silikonowe rurki przez 6-7 dni. W tym czasie nie ma potrzeby stosowania pożywki ani suplementacji witaminą C.
2. Upewnij się, że nie ma wycieków PBS ani załamań rurek układu przepływu przed włączeniem pompy.
3. Włącz pompę układu przepływowego i upewnij się, że wyregulowałeś ustawienie pompy tak, aby ciśnienie wskazywało około 270/-30 mmHg.
4. Rejestruj ciśnienie codziennie w całej hodowli i utrzymuj ciśnienie na poziomie 270/-30 mmHg. Przetwornik ciśnienia można podłączyć do komputera w celu odczytu i monitorowania ciśnienia.

Pierwsze karmienie

5. Zamontuj port wtryskowy i filtr PTFE na pokrywach zasilających zarówno w celu wymiany medium, jak i usuwania średnich odpadów.
6. Umieść rurkę zasilającą mocno na pompie i włóż jeden koniec do portu zasilającego bioreaktora, a drugi koniec do pokrywy zasilającej. Należy pamiętać, aby przetrzeć porty iniekcyjne chusteczkami na bazie etanolu.
7. Użyj dwukierunkowej pompy Masterflex, aby wypompować 200 ml pożywki. Następnie użyj nowej rurki zasilającej, aby przepompować 200 ml świeżej pożywki z powrotem do bioreaktora. Zawsze zaczynaj od bardzo niskiej prędkości, zwłaszcza podczas pompowania medium z powrotem do bioreaktora.
8. Zmień podłoże i uzupełnij kwas askorbinowy 2x/tydzień. Aby dodać kwas askorbinowy, użyj strzykawki o pojemności 30 ml, aby wyjąć 25 ml pożywki i odłóż ją na bok w kapturze na chusteczkę. Rozpuść 25 mg kwasu askorbinowego w 5 ml PBS i przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Najpierw wstrzyknąć sterylny kwas askorbinowy do rurki do karmienia i dodać z powrotem 25 ml wyjętej wcześniej pożywki. Receptura pożywki jest podana w tabeli 1.

7. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Przewody i złącza do montażu systemu przepływu pokazano powyżej.

Rysunek 2. Zespół silikonowej pokrywki korka pokazano powyżej.

Rysunek 3. Schematy montażu bioreaktora przedstawiono powyżej. Wewnątrz bioreaktora mankiety dakronowe są mocowane na szklanych ramionach za pomocą niebieskich węzłów szwów.

Rysunek 4. System przepływu podłączony do rurki i bioreaktora pokazano powyżej. Rurki L/S18 będą pompowane przez pompę Masterflex, napędzając w ten sposób przepływ. Przetwornik ciśnienia będzie mierzył ciśnienie przed wejściem do bioreaktora w górnym strumieniu.

Rysunek 5. Obraz zebranego statku inżynieryjnego. Zmodyfikowane naczynia będą wydawać się nieprzezroczyste i osiągną grubość ścianki około 250 μm po 8-tygodniowej hodowli w warunkach pulsacyjnych.

Rysunek 6. Hematoksylina i eozyna zabarwiły przekroje poprzeczne naczyń inżynieryjnych. A i B to odpowiednio 8-tygodniowe naczynia bez pulsacji i pulsacyjne. C i D to odpowiednio 4-tygodniowe naczynia niepulsacyjne i pulsacyjne. L oznacza stronę luminalną zbiorników. Pasek skali wynosi 100 μm.

Rysunek 7. Barwienie trichromowe Massona dla kolagenu (niebieskie) dla przekrojów naczyń inżynieryjnych. A i B to odpowiednio 8-tygodniowe naczynia bez pulsacji i pulsacyjne. C i D to odpowiednio 4-tygodniowe naczynia niepulsacyjne i pulsacyjne. Zwróć uwagę, że 4-tygodniowe pulsacyjne naczynie wykazuje więcej kolagenu niż jego niepulsacyjny odpowiednik. Białe strzałki wskazują na pozostałe fragmenty PGA w naczyniach. Pasek skali wynosi 100 μm.

Rysunek 8. Barwienie immunochemiczne markerów SMC w tętnicach bydlęcych. α-aktyna mięśni gładkich, kalponina-1 i łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich (SMMHC) są odpowiednio wczesnymi, pośrednimi i późnymi markerami skurczu SMC. Pod koniec 12-tygodniowej hodowli komórki w ścianie naczynia wyrażają SM α-aktynę i umiarkowane ilości kalponiny-1 i SMMHC. Pasek skali wynosi 20 μm.

składnik kwota DMEM (DME/nisko zmodyfikowany) Pojemność 500 ml FBS (płodowa surowica bydlęca) inaktywowana termicznie Pojemność 100 ml HEPES: 1,0 m 5ml Witamina C (rozpuszczona w PBS lub DMEM) 25 mg tabletki powlekania Prolina/Glicyna/Alanina 25 mg/25 mg/10 mg (rozpuszczone w 5 ml PBS) 5ml CuSO₄ 1,5 μg (rozpuszczony w 1 ml PBS) 1ml Penicylina G w stężeniu 10 000 jednostek/ml 5ml PDGF-BB (płytkowy czynnik wzrostu-BB) w dawce 10 ng / ml 5μg bFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów) w stężeniu 10 ng / ml 5μg

Tabela 1. Składowe pożywki "4-10" przedstawiono w powyższej tabeli. Z wyjątkiem PDGF-BB i bFGF, wszystkie inne składniki należy przed użyciem przefiltrować przez filtr 0,2 μm.

Discussion

Jakość zmodyfikowanych naczyń jest w dużej mierze podyktowana jakością SMC stosowanych w hodowlach tkankowych. Krytyczne aspekty fenotypu SMC obejmują morfologię kurczliwości, niską liczbę pasaży i zdolność do proliferacji wewnątrz bioreaktora. Zalecamy, aby liczba pasaży nie była większa niż P3 w momencie wysiewu komórek na rusztowanie polimerowe. Ponadto ważne jest, aby przed użyciem potwierdzić, że źródła SMC są wolne od mykoplazmy. Zaobserwowaliśmy, że komórki zanieczyszczone mykoplazmą prowadzą do znacznego zmniejsz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS (Płodowa surowica bydlęca) Inaktywowany termicznie		SH30071
DMEM	GIBCO, firmy Life Technologies	11885
rhFGF-basic	R& D Systems	234-FSE
rrPDGF-BB	R& D Systems	520-BB
Penicilin G	Sigma-Aldrich	PENNA
Siarczan miedzi(II)	Sigma-Aldrich	C8027
Gylcine	Sigma-Aldrich	C8790
L-Alanina	Sigma-Aldrich	A7469-25G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P5607-25G
Kwas	askorbinowySigma-Aldrich	A4544-25G
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G
Korek silikonowy	Cole-Parmer	06298-24
Rurki Masterflex L/S	Cole-Parmer	06508-16, 06508-18
Pompka Masterflex	Cole-Parmer	7553-80
Mankiet dakronowy	Maquet	174406
PGA filc	Concordia	MO000877-01
4-0 1,5 metryczny Szew Surgipro II	Synetura	VP-557-X
6-0 0,7 metryczny Szew Dexon	Syneture	7538-11
0,22μ m Filtry PTFE	Whatman, GE Healthcare	6780-2502
Trójdrożny kurek	Przetwornik ciśnienia Edwards Lifesciences	593WSC
	Edwards Lifesciences	PX212
IV	Baxter Internationl Inc.
Zestaw do rozcieńczania soli fizjologicznej	Arrow International	W20030
Rurka silikonowa	Saint-Gobain	F05027