Inżynieria biologicznych przeszczepów naczyniowych przy użyciu bioreaktora pulsacyjnego

Summary

Nasza grupa opracowała system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne pulsacyjne obciążenia układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy.

Abstract

Wiele wysiłku włożono w rozwój i postęp metodologii regeneracji funkcjonalnych pomostów tętniczych o małej średnicy. W środowisku fizjologicznym zarówno stymulacja mechaniczna, jak i chemiczna jest niezbędna do utrzymania prawidłowego rozwoju i funkcjonalności naczyń tętniczych^1,2.

Systemy hodowli bioreaktorów opracowane przez naszą grupę są zaprojektowane do wspomagania regeneracji naczyń w precyzyjnie kontrolowanym środowisku chemo-mechanicznym, naśladującym środowisko naczyń macierzystych. Nasze procedury montażu i konserwacji bioreaktorów są dość proste i wysoce powtarzalne^3,4. Komórki mięśni gładkich (SMC) są wysiewane na rurkową siatkę kwasu poliglikolowego (PGA), która jest nawleczona na podatne rurki silikonowe i hodowana w bioreaktorze ze stymulacją pulsacyjną lub bez niej przez okres do 12 tygodni. Istnieją cztery główne atrybuty, które odróżniają nasz bioreaktor od niektórych poprzedników. 1) W przeciwieństwie do innych systemów hodowlanych, które symulują tylko biochemiczne otoczenie rodzimych naczyń krwionośnych, nasz bioreaktor tworzy również fizjologiczne środowisko pulsacyjne, stosując cykliczne naprężenie promieniowe do naczyń w hodowli. 2) Wiele zaprojektowanych naczyń może być hodowanych jednocześnie w różnych warunkach mechanicznych w kontrolowanym środowisku chemicznym. 3) Bioreaktor umożliwia łatwe powlekanie monowarstwy komórek śródbłonka (EC) po stronie światła zaprojektowanych naczyń do implantacji zwierząt. 4) Nasz bioreaktor może również hodować naczynia inżynieryjne o różnych średnicach w zakresie od 1 mm do 3 mm, oszczędzając wysiłek związany z dostosowaniem każdego bioreaktora do określonego rozmiaru średnicy.

Zmodyfikowane naczynia hodowane w naszym bioreaktorze przypominają histologicznie do pewnego stopnia rodzime naczynia krwionośne. Komórki w ścianach naczyń wyrażają dojrzałe markery kurczliwości SMC, takie jak łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich (SMMHC)³. Znaczna ilość kolagenu odkłada się w macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest odpowiedzialna za ostateczną wytrzymałość mechaniczną zaprojektowanych naczyń⁵. Analiza biochemiczna wskazuje również, że zawartość kolagenu w zmodyfikowanych naczyniach jest porównywalna z zawartością kolagenu w tętnicach natywnych⁶. Co ważne, pulsacyjny bioreaktor ma konsekwentnie regenerowane naczynia, które wykazują właściwości mechaniczne umożliwiające udane eksperymenty implantacji na modelach zwierzęcych^3,7. Ponadto bioreaktor ten może być dalej modyfikowany, aby umożliwić ocenę i śledzenie przebudowy kolagenu w czasie w czasie w sposób nieinwazyjny przy użyciu nieliniowej mikroskopii optycznej (NLOM)⁸. Podsumowując, bioreaktor ten powinien służyć jako doskonała platforma do badania podstawowych mechanizmów regulujących regenerację funkcjonalnych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy.

Protocol

Autoklaw

Złóż i zautoklawuj rurki do systemu przepływu i komponentów bioreaktora (sam bioreaktor i silikonowa pokrywka korka) zgodnie z instrukcjami na Rysunku 1 i Rysunku 2. Rurka zasilająca ma męskie złącze na jednym końcu i otwarte zakończenie po drugiej stronie. Trzy krótkie segmenty rurki są wprowadzane przez silikonową nasadkę do wymiany gazu.

1. Szycie siatki PGA

1. Przytnij siatkę PGA do arkusza o wymiarach 1,1 cm x ~ 8 cm (w zależności od wielkości bioreaktora).
2. Wyczyść silikonowe rurki (średnica wewnętrzna 3 mm) wodą destylowaną (dH20) i wysusz na powietrzu przed użyciem.
3. Użyj ....

Discussion

Jakość zmodyfikowanych naczyń jest w dużej mierze podyktowana jakością SMC stosowanych w hodowlach tkankowych. Krytyczne aspekty fenotypu SMC obejmują morfologię kurczliwości, niską liczbę pasaży i zdolność do proliferacji wewnątrz bioreaktora. Zalecamy, aby liczba pasaży nie była większa niż P3 w momencie wysiewu komórek na rusztowanie polimerowe. Ponadto ważne jest, aby przed użyciem potwierdzić, że źródła SMC są wolne od mykoplazmy. Zaobserwowaliśmy, że komórki zanieczyszczone mykoplazmą prowadzą do znacznego zmniejsz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS (Płodowa surowica bydlęca) Inaktywowany termicznie		SH30071
DMEM	GIBCO, firmy Life Technologies	11885
rhFGF-basic	R& D Systems	234-FSE
rrPDGF-BB	R& D Systems	520-BB
Penicilin G	Sigma-Aldrich	PENNA
Siarczan miedzi(II)	Sigma-Aldrich	C8027
Gylcine	Sigma-Aldrich	C8790
L-Alanina	Sigma-Aldrich	A7469-25G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P5607-25G
Kwas	askorbinowySigma-Aldrich	A4544-25G
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G
Korek silikonowy	Cole-Parmer	06298-24
Rurki Masterflex L/S	Cole-Parmer	06508-16, 06508-18
Pompka Masterflex	Cole-Parmer	7553-80
Mankiet dakronowy	Maquet	174406
PGA filc	Concordia	MO000877-01
4-0 1,5 metryczny Szew Surgipro II	Synetura	VP-557-X
6-0 0,7 metryczny Szew Dexon	Syneture	7538-11
0,22μ m Filtry PTFE	Whatman, GE Healthcare	6780-2502
Trójdrożny kurek	Przetwornik ciśnienia Edwards Lifesciences	593WSC
	Edwards Lifesciences	PX212
IV	Baxter Internationl Inc.
Zestaw do rozcieńczania soli fizjologicznej	Arrow International	W20030
Rurka silikonowa	Saint-Gobain	F05027