Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.
Artykuł metodologiczny
Procedura inżynierii płuc
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tkanka płucna, w tym przypadki raka płuc i przewlekłych chorób płuc, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc, odpowiada łącznie za około 280 000 zgonów rocznie; przewlekła obturacyjna choroba płuc jest obecnie czwartą główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych1. Przyczynia się do tej śmiertelności fakt, że płuca zazwyczaj nie naprawiają się ani nie regenerują poza mikroskopowym poziomem komórkowym. W związku z tym tkanka płucna uszkodzona przez degenerację lub infekcję, bądź tkanka płucna usunięta chirurgicznie, nie zostaje zastąpiona funkcjonalnie in vivo. Aby zbadać, czy tkankę płucną można wygenerować in vitro, poddaliśmy płuca dorosłych szczurów procedurze usuwania komponentów komórkowych w celu wytworzenia acelularnego rusztowania z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. Rusztowanie to zachowuje hierarchiczne struktury rozgałęzień dróg oddechowych i naczyń krwionośnych, a także w dużej mierze nienaruszoną błonę podstawną, w skład której wchodzą kolagen IV, laminina i fibronektyna. Rusztowanie jest montowane w bioreaktorze zaprojektowanym tak, aby naśladować kluczowe aspekty fizjologii płuc, takie jak wentylacja podciśnieniowa i pulsacyjna perfuzja naczyniowa. Poprzez hodowlę nabłonka płucnego i endotelium naczyniowego w zamontowanym w bioreaktorze rusztowaniu, jesteśmy w stanie wygenerować tkankę płucną porównywalną fenotypowo z natywną tkanką płucną, która jest zdolna do uczestniczenia w wymianie gazowej przez krótkie odstępy czasu (45-120 minut). Wyniki te są obiecujące i sugerują, że repopulacja macierzy płucnej jest wykonalną strategią regeneracji płuc. Możliwość ta stwarza szansę nie tylko na zwiększenie podaży tkanki płucnej do transplantacji, ale także na badanie biologii komórkowej i molekularnej układu oddechowego in vitro przez dłuższe okresy czasu i w dokładniejszym mikrośrodowisku, niż było to możliwe wcześniej.
Protokół
1. Montaż bioreaktora
Szczegółowe schematy konstrukcji i montażu bioreaktora, zarówno do decelularyzacji, jak i hodowli, przedstawiono odpowiednio na rysunkach 1 i 2. Wszystkie komponenty muszą zostać wysterylizowane przed montażem bioreaktora. Należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:
POŁĄCZENIA:
- Kaniula tętnicza składa się z złącza Luer-lock połączonego z rozdzielaczem w kształcie litery Y krótkim odcinkiem rurki. Złącze Luer-lock jest przymocowane do rurki perfuzyjnej, a odgałęzienie rozdzielacza Y, które nie jest przyszyte do tętnicy płucnej, jest połączone z zaworem jednokierunkowym. Zawór jednokierunkowy jest zorientowany w taki sposób, aby ciecz mogła być zasysana do rurki (w kierunku przeciwnym do perfuzji), natomiast podczas perfuzji narządu całe medium przepływa do płuca.
- Kaniula tchawicza również składa się ze złącza Luer-lock połączonego rurką z rozdzielaczem w kształcie litery Y. Złącze Luer-lock łączy się z pętlą oddechową między rezerwuarem tchawiczym a komorą główną. Odgałęzienie rozdzielacza Y, które nie jest przyszyte do tchawicy, jest również połączone z zaworem jednokierunkowym. Zawór jednokierunkowy jest zorientowany w ten sam sposób, co w przypadku kaniuli tętniczej.
FUNKCJE:
- Zawory jednokierunkowe w kaniulach tętniczych i tchawiczych służą do usuwania pęcherzyków powietrza z przewodów poprzez umożliwienie odwrócenia kierunku przepływu, co pozwala na ich usunięcie.
- „Pętla oddechowa” zawiera dwa zawory jednokierunkowe, rozmieszczone w taki sposób, aby medium wpływało do płuca i wypływało z niego różnymi drogami. Bardziej szczegółowy opis tej funkcji znajduje się w poprzedniej publikacji naszego laboratorium2.
- Perfuzja naczyniowa jest realizowana za pomocą pompy perystaltycznej. Medium jest wprowadzane do tętnicy płucnej poprzez dołączoną kaniulę, przepływa przez unaczynienie płuca i wypływa żyłą płucną bezpośrednio do głównego bioreaktora, z którego medium jest pobierane do ponownej perfuzji.
2. Pobranie narządu
- Uśmiercić dorosłe (3-6 miesięczne) szczury Fischer 344 poprzez przedawkowanie pentobarbitalu sodowego, zgodnie z wytycznymi American Veterinary Medical Association (60 mg/kg IP). Uwaga: roztwór pentobarbitalu zawiera heparynę w stężeniu 100 units/ml w celu przeciwprzekrzepowego działania.
- Spryskać lub przetrzeć klatkę piersiową i brzuch 70% etanolem.
- Otworzyć jamę klatki piersiowej, odsłaniając serce i płuca, uważając, aby nie uszkodzić płuc. Ostrożnie wykonać małe okno w przeponie do jamy klatki piersiowej, co spowoduje cofnięcie się płuc, a następnie poszerzyć to nacięcie poziomo, aby odsłonić podstawy płuc. Wykonać dwa nacięcia pionowo przez żebra i odsunąć klatkę piersiową, aby odsłonić serce i płuca.
- Przygotować system perfuzji grawitacyjnej, np. używając strzykawki bez tłoka, trójdrożnego kurka oraz ok. 20cm drenu z igłą 1,5 cala o rozmiarze 21G. Utrzymywać strzykawkę na wysokości ok. 20cm nad zwierzęciem za pomocą statywu z obejmą. Upewnić się, że z drenu perfuzyjnego usunięto całe powietrze.
- Przeciąć prawy przedsionek, aby odprowadzić krew i zapobiec jej powrotowi do płuc. Pomocne, choć niekoniecznie niezbędne, może być również przecięcie lewego przedsionka, aby umożliwić łatwy odpływ krwi i perfuzatu z płuc.
- Wprowadzić igłę do podstawy prawej komory i otworzyć kurek, aby przeprowadzić perfuzję płuc roztworem heparyny i nitroprusydu sodu (odpowiednio 50U/ml i 1ug/ml) w PBS. Potwierdzić, że tętnica płucna wypełnia się płynem perfuzyjnym, a krew jest wypłukiwana z płuc. W razie potrzeby doppełnić strzykawkę perfuzyjną dodatkowym płynem. Zazwyczaj wymagane jest jedynie ok. 10ml.
- Kontynuować perfuzję do momentu, aż płuca zostaną oczyszczone z krwi, a następnie przerwać proces.
- Wypreparować tchawicę, prowadząc ją w górę szyi tak daleko, jak to możliwe. Upewnić się, że tchawica jest oddzielona od przełyku. Przeciąć wszystkie pozostałe połączenia z sercem, płucami i tchawicą, a następnie usunąć je en bloc.
- Za pomocą skalpela lub ostrych nożyczek odciąć wierzchołek serca, odsłaniając prawą i lewą komorę.
- Zakanulować pień płucny poprzez prawą komorę i przymocować szwem. Usunąć nadmiar tkanki lewej komory.
- Zakanulować tchawicę i przymocować szwem. Upewnić się, że zarówno kanula tchawicy, jak i kanula tętnicy płucnej są rozmieszczone w taki sposób, aby nie występowały naprężenia skrętne tchawicy, płuc lub dużych naczyń (Rysunek 1).
- Upewnić się, że w kanuli tętniczej nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ uwięzione w systemie powietrze może uniemożliwić stały przepływ przez narząd. W niektórych przypadkach pęcherzyk powietrza może całkowicie zatrzymać przepływ płynu. Aby to osiągnąć, umieścić blok serce/płuca w słoiku z PBS. Użyć strzykawki z igłą, aby wstrzyknąć niewielką ilość PBS do kanuli serca w celu wypchnięcia pęcherzyków powietrza.
- Przepłukać drogi oddechowe PBS 4-5 razy, aby usunąć z płuc jak najwięcej powietrza.
- Po zakończeniu etapów płukania, wypełnić płuca PBS zawierającym nitroprusyd sodu (SNP) w stężeniu 1ug/ml. Zamknąć kanulę tchawicy korkiem, aby roztwór pozostał w płucach. Pozostawić płuca do inkubacji do 30 minut, podczas gdy ten sam roztwór przepływa przez naczynia krwionośne przez tętnicę płucną, aby umożliwić wazodylatację.
- Połączyć serce/płuca z nakrętką bioreaktora za pomocą złączy luer-lock połączonych z kanulami w kształcie litery Y, opisanych powyżej w sekcji „Montaż bioreaktora” (Rysunek 1).
3. Decelularyzacja organu
- Podłącz nakrętkę (z przymocowanymi płucami) do aparatury do decelularyzacji (Rysunek 1). Kanula tętnicy płucnej powinna być podłączona do linii perfuzyjnej, a kanula tchawicy powinna pozostawać wolna. Upewnij się, że we wszystkich liniach nie ma powietrza. Jak opisano powyżej, powietrze w liniach może być przyczyną nieprawidłowej decelularyzacji poprzez blokowanie przepływu płynu do decelularyzacji. Powietrze uwięzione w układzie może również utrzymywać się podczas hodowli, co może negatywnie wpłynąć na przeżywalność komórek3.
- Napompuj płuco PBS/SNP, aż będą one pełne, ale nie nadmiernie rozprężone. Natychmiast zamknij kanulę tchawicy, aby płuco pozostało napompowane.
- Perfunduj płuco PBS/SNP przez co najmniej 15 min przy ciśnieniu ~15 mmHg (ciśnienie 20cm H2O). Po 15 min lub dłużej usuń korek z kanuli tchawicy, aby umożliwić zapadnięcie się płuca.
- Kontynuuj perfuzję PBS/SNP przez 30 min. W razie potrzeby uzupełnij PBS/SNP, aby zapewnić utrzymanie ciśnienia perfuzji na poziomie 10-15 mmHg.
- Rozpocznij perfuzję roztworem do decelularyzacji (8mM CHAPS, 1M NaCl, 25mM EDTA w 1X PBS). Zadbaj o to, aby we wszystkich liniach nie było powietrza. System próżniowy może być pomocny w celu zapewnienia ssania.
Przeprowadź perfuzję roztworem do decelularyzacji, aż przez płuco przepłynie 500ml roztworu. Optymalne ciśnienie wynosi <15 mmHg (~20 cm H2O). Proces ten zazwyczaj trwa 2,5 godziny. Szybkość przepływu jest początkowo bardzo niska (0,2-0,5ml/minutę), a w drugiej godzinie gwałtownie wzrasta do około 1ml/minutę lub więcej. Okresowo usuwaj zużyty płyn do decelularyzacji z bioreaktora, dbając o to, aby pozostało wystarczająco dużo płynu do utrzymania płuca i kaniuli tchawiczej.
4. Płukanie i sterylizacja organu
- Przenieś płuca i bioreaktor do komory z laminarnym przepływem powietrza. Rozpocznij płukanie sterylnym PBS, usuwając słoik 500 ml zawierający płyn do decelularyzacji i zastępując go sterylnym słoikiem zawierającym do 1 L sterylnego PBS. Użyj ssania próżniowego, aby upewnić się, że przewody są wolne od powietrza.
- Przeprowadź perfuzję PBS przez układ naczyniowy przy ciśnieniu 10-15 mmHg, w ten sam sposób, co w przypadku decelularyzacji. Okresowo usuwaj zużyty PBS z bioreaktora i wymieniaj i/lub uzupełniaj słoik PBS świeżym, sterylnym roztworem PBS. Zaleca się stosowanie technik sterylnych.
- Kontynuuj płukanie, aż przez płuca zostanie przepuszczone co najmniej 2,5 L sterylnego PBS.
- Przenieś płuca do nowego, sterylnego systemu bioreaktora zawierającego świeży PBS. Upewnij się, że zarówno cały obieg perfuzyjny, jak i wszystkie linie dróg oddechowych są wypełnione płynem. We wszystkich kolejnych krokach należy użyć pompy pulsacyjnej do perfuzji płuc z prędkością 5 ml/min.
- Sterylizuj rusztowanie (scaffold) albo poprzez nocną perfuzję roztworem PBS + 10% FBS + 10% pen-strep, albo przez 3 godziny kwasem nadoctowym 0,1% w PBS. Ta druga metoda będzie wymagać płukania płuc przy trzech wymianach 250 ml PBS w ciągu kilku godzin w celu usunięcia pozostałości kwasu. Podczas każdego płukania płuca powinny być zarówno wentylowane, jak i perfundowane, aby zapewnić dokładne wypłukanie wszystkich części tkanki.
- Przenieś płuca do inkubatora w temperaturze 37°C i perfunduj PBS z dodatkiem 10% FBS i 10% penicyliny/streptomycyny przez ok. 1 h lub do wyrównania temperatury, w przygotowaniu do traktowania benzonukleazą.
- Potraktuj płuca benzonukleazą w celu usunięcia pozostałości DNA:
- Podgrzej bufor do benzonukleazy (patrz Tabela Odczynników) do 37°C.
- Dla każdych płuc napełnij jedną strzykawkę 10 ml samym buforem do benzonukleazy i jedną strzykawkę 10 ml roztworem benzonukleazy w buforze o stężeniu 90 U/ml.
- Zatrzymaj perfuzję płuc.
- Wypełnij drogi oddechowe buforem do benzonukleazy.
- Pozwól płucom się opróżnić (przez ok. 1 minutę). Następnie wypełnij płuca roztworem benzonukleazy. Podczas wprowadzania buforu do benzonukleazy i samej benzonukleazy staraj się nie wprowadzać powietrza do płuc.
- Pozostaw płuca bez perfuzji i wentylacji w temperaturze 37°C przez 1 godzinę po wprowadzeniu benzonukleazy.
- Wznów perfuzję roztworem PBS + 10% FBS, 10% penicyliny/streptomycyny, który znajduje się już w bioreaktorze, i kontynuuj przez noc. Następnego dnia płuca mogą być przechowywane w temperaturze 4°C (do 3 miesięcy) lub przygotowane do zasiewu komórek.
- Aby przygotować rusztowanie do ponownego zasiedlenia komórkami, zastąp roztwór PBS/FBS/benzonukleaza ok. 250 ml pożywki hodowlanej. Przeprowadź perfuzję przez co najmniej jedną godzinę przed wprowadzeniem komórek, a bezpośrednio przed ich zasiewem wymień pożywkę na świeżą.
5. Recelularyzacja
Wybór źródła komórek do ponownego zasiedlania organu pozostaje w gestii poszczególnych badaczy. Można wykorzystać wiele źródeł komórek, w tym populacje dostępne komercyjnie, świeżo izolowane komórki płucne noworodkowe lub płodowe, embrionalne komórki macierzyste lub inne komercyjne źródła komórek. Specyficzne protokoły izolacji dla tych populacji komórek można znaleźć w innych opracowaniach4,5,6. W niniejszej pracy przedstawiamy instrukcje dotyczące wysiewu populacji komórek śródbłonka oraz nabłonka.
Obsiewanie komórkami śródbłonka:
- Przygotuj zawiesinę wybranej populacji komórek śródbłonka w odpowiednim medium hodowlanym. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sito komórkowe o oczkach 40um, aby usunąć skupiska komórek. Typowe zasiewanie komórek śródbłonka w naszym laboratorium wykorzystuje około 30 milionów komórek śródbłonka mikrokrążenia płuc szczura w 60ml medium hodowlanego.
- Przenieś zawiesinę komórkową do niewielkiego zbiornika tymczasowo włączonego do pętli perfuzyjnej bioreaktora (Rysunek 2). Upewnij się, że w przewodach wychodzących z tego zbiornika oraz w całej pętli perfuzyjnej nie ma pęcherzyków powietrza.
- Wprowadź komórki do tętnicy płucnej z przepływem 3ml/min, używając pompy perystaltycznej.
- Po infuzji komórek kontynuuj perfuzję medium recyrkulowanym z głównego bioreaktora z żądaną prędkością.
- Codziennie sprawdzaj, czy w przewodach perfuzyjnych nie ma pęcherzyków powietrza.
- Medium należy regularnie wymieniać na świeże; zazwyczaj odbywa się to co 3-4 dni.
Wysiew komórek nabłonka:
- Przygotować zawiesinę komórkową pożądanej populacji komórek nabłonkowych. W naszym laboratorium zazwyczaj składa się ona z około 50-100 milionów neonatalnych komórek płuc szczura. Przefiltrować populację przez sito komórkowe 40um i zawiesić w 15ml pożywki hodowlanej w strzykawce. Napełnić zbiornik dróg oddechowych 80ml pożywki hodowlanej.
- Umieścić bioreaktor w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i podłączyć pompę strzykawkową do wentylacji. Upewnić się, że we wszystkich liniach wentylacyjnych nie ma pęcherzyków powietrza.
- Zasiać komórki do płuc, wstrzykując 15ml zawiesiny komórkowej w formie pojedynczego bolusa do kaniuli tchawiczej.
- Natychmiast rozpocząć jeden powolny wdech za pomocą pompy strzykawkowej. Wdech ten jest realizowany poprzez odessanie 60ml powietrza z głównego bioreaktora z prędkością 3ml/minutę, co trwa około 20 minut. Należy upewnić się, że filtry powietrza w głównym bioreaktorze zostały zamknięte bezpośrednio po wstrzyknięciu zawiesiny komórkowej i przed rozpoczęciem powolnego wdechu.
- Pozostawić płuca w spoczynku przez około 18h, a następnie rozpocząć powolną perfuzję naczyniową (około 0,5 ml/min).
6. Hodowla organów
Chociaż szczegóły perfuzji i wentylacji będą się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego, należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:
- Podczas hodowli śródbłonka perfuzję wykonuje się zazwyczaj z prędkością 1-3 ml/min przy użyciu pompy perystaltycznej. W przypadku hodowli nabłonka wentylację zapewnia się zazwyczaj w stałym tempie 1 oddechu na minutę przy użyciu pompy strzykawkowej. Aby uzyskać wentylację płuc z normalną objętością pływową, zazwyczaj wymagane jest odessanie 5-10 ml powietrza z głównego bioreaktora. Ze względu na konieczność utrzymania szczelności bioreaktora podczas wentylacji, należy codziennie przerywać wentylację i wymieniać powietrze w głównej komorze. Całe powietrze w systemie to powietrze pokojowe, które zawiera około 21% tlenu w ciśnieniu parcjalnym. Odessanie 5-10 ml powietrza z bioreaktora (co indukuje wdech 5-10 ml płynu przez płuco) zależy od wielkości płuca oraz liczby hodowanych płatów (płaty mogą być wiązane w celu analizy, podczas gdy pozostałe płaty pozostają w hodowli). Ilość powietrza odsysanego przez pompę strzykawkową dobiera się tak, aby odpowiadała „objętości pływowej” hodowanego płuca.
- Pożywkę należy wymieniać mniej więcej co 3-4 dni w trakcie hodowli.
- Podczas kokultury nabłonka i śródbłonka, w eksperymentach prowadzonych w naszym laboratorium w pierwszej kolejności wysiewa się nabłonek na 4-8 dni, podczas których tkanka inżynieryjna jest wentylowana. Następnie śródbłonek jest wysiewany poprzez perfuzję, po czym tkanka jest poddawana zarówno perfuzji, jak i wentylacji.
7. Reprezentatywne wyniki:
Decelularyzacja
Przy prawidłowym wykonaniu protokołu, świeżo wyekstrahowane płuca powinny utrzymywać powietrze bez przecieków. Można to sprawdzić, napowietrzając je podczas zanurzenia w cieczy – nie powinny pojawić się pęcherzyki wskazujące na wycieki powietrza. Następująca po tym decelularyzacja powinna umożliwić przepływ ~500ml płynu do decelularyzacji przez płuca w czasie od 2,5 do 3 godzin w temperaturze 37°C, a pod koniec płukania PBS powinien być w stanie przepływać przez płuca z prędkością około 10 ml/min (pod ciśnieniem hydrostatycznym ~15 mm Hg). Po traktowaniu 0,1% kwasem nadoctowym oraz benzonukleazą, płuca mogą być przechowywane w temperaturze 4°C do 3 miesięcy i nadal pozostawać odpowiednie do recelularyzacji.
Końcowa odkomórkowiona macierz zewnątrzkomórkowa powinna być całkowicie pozbawiona materiału komórkowego i zachowywać cechy makroskopowe, mikroskopowe oraz ultrastrukturalne natywnego płuca. Niewystarczająca odkomórkowanie lub płukanie może spowodować „przywieranie” pozostałości DNA do rusztowania, co można zwizualizować za pomocą standardowego barwienia hematoksyliną i eozyną (por. Rycina 3).
Repopulacja macierzy acelularnej i hodowla tkanki płucnej
Jeśli komórki zostały niedawno wyizolowane z 7-dniowych noworodków szczurów, zgodnie z opisem w uzupełnieniu online towarzyszącym pracy Petersena i współpracowników4, można spodziewać się uzyskania 120-150 milionów komórek z miotu 10 szczurząt (nieco ponad 10 milionów komórek z jednego noworodka).
Optymalne warunki wysiewania komórek i ich późniejszej hodowli płuc w bioreaktorze powinny zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek we wszystkich 5 płatach płuc oraz pokrycie około 70% rusztowania z macierzy pozakomórkowej (Rycina 3). Hodowana populacja komórek powinna wykazywać pozytywną ekspresję kluczowych markerów komórek układu oddechowego, takich jak prosekretoryjne białko C (SPC), białko sekrecyjne komórek Clary (CCSP) oraz akwaporyna-5 (AQP), w kolejności malejącej liczebności (Rycina 4).
Rycina 1. Położenie kaniul i bioreaktor do decelularyzacji
Rycina 2. Bioreaktor wykorzystywany do zasiewu i hodowli inżynieryjnej tkanki płucnej
Rysunek 3. Histologia płuc natywnych, decelularyzowanych i repopulowanych
Rycina 4. Barwienie immunofluorescencyjne dla kluczowych markerów płuc
Dyskusja
Najbardziej krytyczne aspekty przedstawionego tutaj systemu obejmują utrzymanie sterylności oraz ścisłe monitorowanie ciśnienia przyłożonego do łoża naczyniowego podczas procesu przygotowania i zasiewania rusztowania oraz hodowli repopulowanego płuca. Sterylność najlepiej utrzymać poprzez autoklawowanie wszystkich materiałów przed użyciem, a następnie zamontowanie płuca w zamkniętym systemie krótko po eksplantacji i unikanie późniejszego naruszania tej bariery. Po dokładnym wypłukaniu macierzy odkomórkowionej i przeniesieniu jej do sterylnego bioreaktora w celu hodowli, silikonowej nasadki oraz pozostałych uszczelnień i połączeń nie należy naruszać ani usuwać. Aby utrzymać ciśnienie w ryzach, tam gdzie to możliwe, preferowany jest przepływ grawitacyjny. W przypadku konieczności zastosowania pompy do recyrkulacji płynu (rozpoczynając po płukaniu PBS i kontynuując podczas hodowli), zaleca się bezpośredni pomiar ciśnienia tuż przed wpłynięciem płynu do tętnicy płucnej za pomocą przetwornika ciśnienia. Wartość przyłożonego ciśnienia nie powinna przekraczać 15 mm Hg.
Rekomórkowane płuca mogą być hodowane przez różne okresy czasu, zazwyczaj od 4 dni do maksymalnie 3 tygodni. Perfuzję naczyniową przeprowadza się zazwyczaj z przepływem 1-3 ml/min podczas hodowli śródbłonka, natomiast wentylację stosuje się zazwyczaj z częstotliwością 1 oddechu/min podczas hodowli nabłonka. W okresach hodowli łączonej właściwe jest jednoczesne stosowanie wentylacji i perfuzji. Wentylację można przeprowadzać przy użyciu pożywki ciekłej lub powietrza.
W ciągu ostatnich kilku dziesięcioleci kilka grup badawczych przeprowadziło istotne prace z zakresu inżynierii tkankowej, wykazując możliwość różnicowania nabłonka płuc in vitro oraz odtwarzania wielu aspektów mikroanatomii płuc7,8,9,10. Jednakże aż do niedawna4,5 żadna z tych prób inżynierii tkanki płucnej nie doprowadziła do stworzenia implantowalnego organu, który byłby w stanie zachować separację między przedziałami krwionośnymi a drogami oddechowymi i mógłby uczestniczyć w wymianie gazowej. Dlatego też, choć opisane metody stanowią jedynie wstępny krok w kierunku długofalowego celu, jakim jest wygenerowanie funkcjonalnej tkanki płucnej, praca ta jest obiecującym krokiem ku możliwości zwiększenia ilości tkanki płucnej dostępnej do transplantacji. Co więcej, niniejsza praca rozwija badania przeprowadzone przez Ott et al. oraz Uyguna i współpracowników11,12, demonstrując skuteczność zdecelularyzowanej macierzy zewnątrzkomórkowej jako rusztowania do inżynierii tkankowej złożonych struktur trójwymiarowych oraz wspierania wzrostu i przeżywalności różnych typów komórek. Praca ta ma również istotne znaczenie ze względu na wkład w instrumentarium biologów komórkowych i molekularnych zajmujących się układem oddechowym. Dzięki zapewnieniu unikalnego środowiska trójwymiarowego, które może dostarczać odpowiednie bodźce mechaniczne i nie wiąże się z ryzykiem szybkiej dedyferencjacji, z którą można się spotkać podczas hodowli nabłonka gryzoni w laboratorium metodami tradycyjnymi13, naukowcy mogliby wykorzystać nasz system do uzyskania nowej wiedzy na temat oddziaływań komórka-komórka i komórka-macierz, które odgrywają rolę w różnicowaniu i funkcji komórek. Wiedza ta może okazać się szczególnie cenna, jeśli zostanie wykorzystana do sterowania losem różnych populacji komórek macierzystych, co grupa Cortielli wykazała w badaniach wstępnych14.
Oświadczenia
L.E.N. posiada udziały w Humacyte, firmie zajmującej się medycyną regeneracyjną. Firma Humacyte nie finansowała tych badań i nie miała wpływu na projekt, interpretację ani raportowanie żadnego z opisanych eksperymentów lub metod. Autorzy (L.E.N., T.H.P., E.A.C.) oraz Uniwersytet Yale złożyli wniosek patentowy dotyczący inżynierii tkankowej płuc.
Podziękowania
Dziękujemy Maegan B. Colehour za pomoc w opracowaniu bioreaktora. Badania te były finansowane przez Wydział Anestezjologii Uniwersytetu Yale oraz z grantu NIH HL 098220 (dla L.E.N.). T.H.P. otrzymał wsparcie z grantu NIH T32 GM007171.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Eutanazja | |||
| Heparyna | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Nitroprusyd sodu | Fluka | 71778 | |
| Roztwór do eutanazji Euthasol | Virbac Animal Health | 710101 | Roztwór stokowy pentobarbatalu sodu 390 mg/ml należy odpowiednio rozcieńczyć przed podaniem dostojnym (IP) |
| Roztwór do decelularyzacji | |||
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | |
| NaCl | American Bioanalytical | AB01915 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-01 | |
| 1X PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Komponenty bioreaktora | |||
| Słoik 480 ml | Cole-Parmer | EW-3460560 | |
| Korek silikonowy, rozmiar 14 | Cole-Parmer | EW-06298-26 | |
| Konektory Y | Cole-Parmer | ED-30614-08 | Używane do kaniul tętniczych i tchawkowych |
| Przewody silikonowe | Masterflex (Cole Palmer) | 96420-14; 16 | L/S 14; 16 |
| Przetworniki ciśnienia | Edwards Lifesciences | PX-212 | |
| Zawór zwrotny | Cole-Parmer | EW-98553-20 | Zawór jednokierunkowy |
| Kurki czterodrożne | Edwards Lifesciences | 594WSC | |
| Filtr strzykawkowy | Cole-Parmer | 2915-08 | PTFE, 0.2μm |
| Aparatura do decelularyzacji i płukania (dodatki do bioreaktora) | |||
| Butelki szklane 500 i 1000 ml | Corning | 1395-500; -1L | Używane do decelularyzacji i płukania grawitacyjnego |
| Obróbka Benzonazą | |||
| Penicylina/streptomycyna | GIBCO, by Life Technologies | 15140122 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043 | 1M, pH 8.0 |
| MgCl2 | JT Baker | 2444-01 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Nukleaza Benzonaza | Sigma-Aldrich | E1014 | Endonukleaza używana do usuwania resztek DNA z macierzy |
Bibliografia
- American Lung Association. Lung Disease Data. , (2008).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. , (2010).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
- Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
- Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).
- Cortiella, J. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).
- Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).
- Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).
- Cortiella, J. Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth. Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).
- Price, A. P. Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded. Tissue Eng Part A. , (2010).
- Ott, H. C. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).
- Cortiella, J. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. , (2010).
Przedruki i uprawnienia
