Procedura w inżynierii płuc

Summary

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuc i nowy bioreaktor biomimetyczny, który może być wykorzystany do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do matrycy i hodowlę w bioreaktorze, wytwarzamy tkankę, która wykazuje efektywną wymianę gazową po przesadzeniu in vivo na krótkie okresy czasu.

Abstract

Tkanka płucna, w tym rak płuc i przewlekłe choroby płuc, takie jak przewlekła obturacyjna choroba płuc, łącznie odpowiadają za około 280 000 zgonów rocznie; przewlekła obturacyjna choroba płuc jest obecnie czwartą najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych¹. Do tej śmiertelności przyczynia się fakt, że płuca na ogół nie naprawiają się ani nie regenerują poza mikroskopijnym, komórkowym poziomem. W związku z tym tkanka płucna, która jest uszkodzona przez zwyrodnienie lub infekcję, lub tkanka płucna, która jest wycinana chirurgicznie, nie jest funkcjonalnie zastępowana in vivo. Aby zbadać, czy tkanka płucna może być generowana in vitro, potraktowaliśmy płuca dorosłych szczurów za pomocą procedury, która usuwa składniki komórkowe w celu wytworzenia bezkomórkowego rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. Rusztowanie to zachowuje hierarchiczne rozgałęzione struktury dróg oddechowych i naczyń krwionośnych, a także w dużej mierze nienaruszoną błonę podstawną, która składa się z kolagenu IV, lamininy i fibronektyny. Rusztowanie jest zamontowane w bioreaktorze zaprojektowanym tak, aby naśladować krytyczne aspekty fizjologii płuc, takie jak wentylacja podciśnieniowa i pulsacyjna perfuzja naczyniowa. Poprzez hodowlę nabłonka płucnego i śródbłonka naczyniowego w rusztowaniu zamontowanym w bioreaktorze, jesteśmy w stanie wytworzyć tkankę płucną, która jest fenotypowo porównywalna z natywną tkanką płucną i która jest w stanie uczestniczyć w wymianie gazowej w krótkich odstępach czasu (45-120 minut). Wyniki te są zachęcające i sugerują, że ponowne zasiedlenie macierzy płucnej jest realną strategią regeneracji płuc. Możliwość ta stwarza okazję nie tylko do pracy nad zwiększeniem podaży tkanki płucnej do przeszczepów, ale także do badania komórek oddechowych i biologii molekularnej in vitro przez dłuższy czas i w dokładniejszym mikrośrodowisku niż było to możliwe wcześniej.

Protocol

1. Zespół bioreaktora

Szczegółowe rysunki projektu i montażu bioreaktora zarówno dla decelularyzacji, jak i hodowli są przedstawione odpowiednio na rysunkach 1 i 2. Wszystkie elementy muszą zostać wysterylizowane przed montażem bioreaktora. Zwrócono uwagę na następujące punkty szczegółowe:

POŁĄCZENIA:

1. Kaniula tętnicza składa się ze złączki typu luer-lock połączonej z rozdzielaczem Y za pomocą krótkiego odcinka rurki. Łącznik luer-lock jest przymocowany do rurki perfuzyjnej, a segment Y, który nie jest przyszyty do tętnicy płucnej, jest podłączony do zaworu jednokierunkowego. Zawór jednokierunkowy jest zorientowany w taki sposób, że płyn może być wciągany do rurki (w kierunku przeciwnym do perfuzji), ale podczas perfuzji narządowej całe medium przepływa do płuc.
2. Kaniula tchawicy składa się również ze złącza luer-lock połączonego z rozdzielaczem Y za pomocą rurki. Luer-lock łączy się z pętlą oddechową między zbiornikiem tchawicy a komorą główną. Odcinek łącznika Y, który nie jest przyszyty do tchawicy, jest również podłączony do zaworu jednokierunkowego. Zastawka jednokierunkowa jest zorientowana w taki sam sposób jak kaniula tętnicza.

FUNKCJE:

3. Zastawki jednokierunkowe w kaniulach tętniczych i tchawicy są wykorzystywane do usuwania pęcherzyków powietrza w przewodach, umożliwiając odwrócenie przepływu w przewodach, a tym samym umożliwiając usunięcie pęcherzyków powietrza.
4. "Pętla oddechowa" składa się z dwóch zaworów jednokierunkowych, umieszczonych w taki sposób, że medium podąża inną ścieżką do i z płuc. Bardziej szczegółowy opis tej cechy znajduje się we wcześniejszej publikacji z naszego laboratorium².
5. Perfuzja naczyniowa odbywa się za pomocą pompy rolkowej. Pożywka jest perfundowana do tętnicy płucnej przez dołączoną kaniulę, przepływa przez naczynia krwionośne płuc i wydostaje się żyłą płucną bezpośrednio do głównego bioreaktora, gdzie pożywka jest pobierana do perfuzji.

2. Pobieranie organów

1. Poddać eutanazji dorosłe (3-6 miesięcy) szczury Fischer 344 przez przedawkowanie pentobarbitalu sodu, zgodnie z wytycznymi określonymi przez Amerykańskie Stowarzyszenie Lekarzy Weterynarii (60 mg/kg IP). Uwaga: roztwór pentobarbitalu zawiera heparynę w stężeniu 100 jednostek/ml do leczenia przeciwzakrzepowego.
2. Spryskaj lub przetrzyj klatkę piersiową i brzuch 70% etanolem.
3. Otwórz klatkę piersiową, odsłaniając serce i płuca, uważając, aby nie uszkodzić płuc. Ostrożnie wykonaj małe okno przez przeponę do jamy klatki piersiowej, powodując cofnięcie się płuc, a następnie rozszerz to nacięcie w poziomie, aby odsłonić podstawy płuc. Wykonaj dwa nacięcia pionowo przez żebra i cofnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce i płuca.
4. Przygotuj system perfuzji grawitacyjnej, tj. za pomocą strzykawki z usuniętym tłokiem, 3-drogowego kranu i ~20 cm rurki z igłą o średnicy 1,5 cala i rozmiarze 21. Utrzymuj strzykawkę na wysokości ~20 cm nad zwierzęciem za pomocą stojaka na pierścienie. Upewnij się, że całe powietrze zostało usunięte z rurki perfuzyjnej.
5. Przetnij prawy przedsionek, aby odprowadzić krew, zapobiegając jej powrotowi do płuc. Przecięcie lewego przedsionka, aby umożliwić łatwy odpływ krwi i perfuzat z płuc, może być również pomocne, ale nie jest konieczne.
6. Wbić igłę w podstawę prawej komory i otworzyć kran odcinający, aby przepłukać płuca roztworem heparyny i nitroprusydku sodu (odpowiednio 50 j./ml i 1 ug/ml) w PBS. Upewnij się, że tętnica płucna wypełnia się płynem perfuzyjnym i że krew oczyszcza się z płuc. W razie potrzeby napełnić strzykawkę perfuzyjną dodatkowym płynem. Zazwyczaj wymagane jest tylko ~10 ml.
7. Kontynuuj perfuzję, aż płuca będą wolne od krwi, a następnie zatrzymaj perfuzję.
8. Wypreparuj tchawicę swobodnie, aż do szyi tak daleko, jak to możliwe. Upewnij się, że tchawica jest oddzielona od przełyku. Rozetnij wszystkie pozostałe połączenia z sercem, płucami i tchawicą i usuń en bloc.
9. Za pomocą skalpela lub ostrych nożyczek odetnij wierzchołek serca, odsłaniając prawą i lewą komorę.
10. Kanelować pień płucny przez prawą komorę i zszyć na miejscu. Usuń nadmiar tkanki lewej komory.
11. Kanulować tchawicę i zszyć na miejscu. Upewnij się, że zarówno tchawica, jak i kaniule tętnicze płuc są ustawione w taki sposób, aby nie było naprężeń skrętnych na tchawicy, płucach lub dużych naczyniach (ryc. 1).
12. Upewnij się, że w kaniuli tętniczej nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ pęcherzyki powietrza uwięzione w systemie mogą uniemożliwić stały przepływ przez narząd. W niektórych przypadkach pęcherzyk powietrza może całkowicie zatrzymać przepływ płynu. Aby to osiągnąć, umieść blok serca/płuc w słoiku zawierającym PBS. Użyj strzykawki z igłą, aby wstrzyknąć niewielką ilość PBS do kaniuli serca, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
13. Przepłukać drogi oddechowe PBS 4-5 razy, aby usunąć jak najwięcej powietrza z płuc.
14. Po zakończeniu etapów płukania napełnić płuco PBS zawierającym nitroprusydek sodu (SNP) w stężeniu 1 ug/ml. Umieść korek na kaniuli tchawicy, aby roztwór pozostał w płucach. Pozwól płucom inkubować przez maksymalnie 30 minut, ponieważ ten sam roztwór przepływa przez naczynia krwionośne przez tętnicę płucną, aby umożliwić rozszerzenie naczyń krwionośnych.
15. Podłącz serce/płuca do nasadki bioreaktora za pomocą połączeń typu luer-lock połączonych z kaniulami w kształcie litery Y, opisanych w "Zespole bioreaktora" powyżej. (Rysunek 1).

3. Decelularyzacja narządów

1. Podłączyć nasadkę (z dołączonymi płucami) do aparatu do decelularyzacji (ryc. 1). Kaniula tętnicy płucnej powinna łączyć się z linią perfuzyjną, a kaniula tchawicy powinna swobodnie unosić się na wodzie. Upewnij się, że wszystkie przewody są wolne od powietrza. Jak opisano powyżej, powietrze w przewodach może być źródłem słabej decelularyzacji, uniemożliwiając przepływ płynu deklarularyzacyjnego. Powietrze uwięzione w systemie może również utrzymywać się w czasie hodowli, kiedy może mieć negatywny wpływ na przeżywalność komórek³.
2. Napompuj płuco za pomocą PBS/SNP, aż płuca będą pełne, ale nie nadmiernie napompowane. Natychmiast zakryj kaniulę tchawicy, aby płuco pozostało napompowane.
3. Perfuzja płuc z PBS/SNP przez co najmniej 15 minut przy ciśnieniu ~15 mmHg (ciśnienie 20 cm H₂O). Po 15 minutach lub dłużej wyjmij korek z kaniuli tchawicy, aby umożliwić opróżnienie płuc
.
4. Kontynuuj perfuzję z PBS/SNP przez 30 minut. W razie potrzeby uzupełnij PBS/SNP, aby zapewnić utrzymanie ciśnienia perfuzji na poziomie 10-15 mmHg.
5. Rozpocznij perfuzję roztworem decelularyzacyjnym (8mM CHAPS, 1M NaCl, 25mM EDTA w 1X PBS). Uważaj, aby wszystkie przewody były wolne od powietrza. System próżniowy może być pomocny w zapewnieniu ssania.

Uzgadniaj z roztworem decelularycznym, aż 500ml roztworu przeniknie przez płuca. Optymalne ciśnienie wynosi <15 mmHg (~20 cm H₂O). Zazwyczaj zajmuje to 2,5 godziny. Natężenia przepływu są zazwyczaj bardzo wolne (0,2-0,5 ml / minutę) początkowo i szybko rosną w ciągu drugiej godziny do około 1 ml / minutę lub więcej. Okresowo usuwaj zużyty płyn decelularyzacyjny z bioreaktora, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość płynu, aby podeprzeć płuca i kaniulę tchawicy.

4. Płukanie i sterylizacja organów

1. Przenieść płuca i bioreaktor do okapu do hodowli tkankowej. Rozpocznij płukanie sterylnym PBS, wyjmując słoik o pojemności 500 ml, który zawierał płyn decelularyczny i zastępując go sterylnym słoikiem zawierającym do 1 litra sterylnego PBS. Użyj ssania próżniowego, aby upewnić się, że przewody są wolne od powietrza.
2. Perfuzję PBS przez układ krwionośny przy 10-15 mmHg, w taki sam sposób, jak w przypadku decelularyzacji. Okresowo usuwaj odpady PBS z bioreaktora i zastąp i/lub ponownie napełnij słoik PBS świeżym, sterylnym PBS. Wskazane jest stosowanie techniki sterylnej.
3. Kontynuuj płukanie, aż co najmniej 2,5 l sterylnego PBS przeniknie do płuc.
4. Przenieść płuco do nowego, sterylnego systemu bioreaktora zawierającego świeży PBS. Upewnij się, że zarówno cała pętla perfuzyjna, jak i całe przewody dróg oddechowych są wypełnione płynem. Wszystkie kolejne kroki będą wykorzystywać pompę pulsacyjną do perfuzji płuc z prędkością 5 ml / min.
5. Sterylizuj rusztowanie przez nocną perfuzję z PBS + 10% FBS + 10% roztworem pióra-paciorkowca lub przez 3 godziny 0,1% kwasem nadoctowym w PBS. To ostatnie będzie wymagało przepłukania płuc 3 zmianami po 250 ml PBS przez kilka godzin w celu usunięcia pozostałości kwasu. Przy każdym płukaniu płuco powinno być wentylowane, a także perfundowane, aby zapewnić dokładne wypłukanie wszystkich części tkanki.
6. Przenieś płuca do inkubatora o temperaturze 37°C i utrzyj perfuzję z PBS, który zawiera 10% FBS i 10% penicyliny/streptomycyny przez ~1 godzinę lub do momentu wyrównania temperatury, w ramach przygotowań do leczenia benzonazą.
7. Leczenie płuc benzonazą w celu usunięcia resztek DNA:
   1. Ogrzać bufor benzonazy (patrz tabela odczynników) do temperatury 37°C.
   2. Dla każdego płuca napełnić jedną strzykawkę o pojemności 10 ml samym buforem benzonazy i jedną strzykawkę o pojemności 10 ml z 90 j./ml benzonazy w buforze.
   3. Zatrzymać perfuzję płucną.
   4. Napompuj drogi oddechowe buforem benzonazowym.
   5. Pozwól płucom opróżnić się (przez ~1 minutę). Następnie napompuj płuca roztworem benzonazy. Podczas napełniania buforem benzonazy i benzonazą staraj się unikać wstrzykiwania powietrza do płuc.
   6. Pozostawić płuca bez perfuzji lub wentylacji w temperaturze 37°C przez 1 godzinę po napompowaniu benzonazą.
8. Wznów perfuzję za pomocą PBS + 10% FBS, 10% penicyliny/streptomycyny, która jest już w bioreaktorze i kontynuuj przez noc. Następnego dnia płuco może być przechowywane w temperaturze 4°C (do 3 miesięcy) lub przygotowane do wysiewu komórek.
9. Aby przygotować rusztowanie do ponownego zasiedlenia komórek, zastąp roztwór PBS/FBS/benzonazy ~250ml pożywki hodowlanej. Perfuzję należy wykonać przez co najmniej godzinę przed wprowadzeniem komórek i zastąpić świeżą pożywką hodowlaną bezpośrednio przed wysiewem komórek.

5. Recelularyzacja

Wybór źródła komórek do ponownego zasiewu organów pozostawia się indywidualnym badaczom. Można wykorzystać wiele źródeł komórek, w tym komercyjnie dostępne populacje, świeżo wyizolowane komórki płuc noworodków lub płodów, embrionalne komórki macierzyste lub dostępne na rynku źródła komórek. Specyficzne protokoły izolacji dla tych populacji komórek można znaleźć gdzie indziej^4,5,6. W tym miejscu podajemy instrukcje, jak wysiewać zarówno populacje komórek śródbłonka, jak i nabłonka.

Siew śródbłonka:

1. Przygotować zawiesinę pożądanej populacji komórek śródbłonka w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe 40um, aby usunąć grudki komórek. Typowe wysiewanie śródbłonka w naszym laboratorium wykorzystuje około 30 milionów komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc szczura w 60 ml pożywki hodowlanej.
2. Dozuj zawiesinę komórkową do małego zbiornika tymczasowo włączonego do pętli perfuzyjnej bioreaktora (rysunek 2). Upewnij się, że rurka z tego zbiornika i cała pętla perfuzyjna są wolne od pęcherzyków powietrza.
3. Wlew komórki do tętnicy płucnej w tempie 3 ml/min za pomocą pompy rolkowej.
4. Po infuzji komórek kontynuuj perfuzję z pożywką recyrkulowaną z głównego bioreaktora z żądaną szybkością.
5. Na co dzień upewnij się, że rurka perfuzyjna jest wolna od pęcherzyków powietrza.
6. Pożywkę należy regularnie wymieniać na świeżą, często robi się to co 3-4 dni.

Sadzenie nabłonka:

1. Przygotować zawiesinę komórkową pożądanej populacji komórek nabłonkowych. W naszym laboratorium składa się on zazwyczaj z około 50-100 milionów komórek płucnych noworodków szczurów. Przefiltrować populację przez sitko komórkowe 40um i zawiesić w 15 ml pożywki hodowlanej w strzykawce. Napełnij zbiornik dróg oddechowych 80 ml pożywki hodowlanej.
2. Umieścić bioreaktor w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C i podłączyć pompę strzykawkową do wentylacji. Upewnij się, że wszystkie przewody wentylacyjne są wolne od powietrza.
   1. Zasiaj komórki do płuc, wstrzykując 15 ml zawiesiny komórkowej w postaci pojedynczego bolusa do kaniuli tchawicy.
   2. Natychmiast rozpocznij pojedynczy, powolny oddech za pomocą pompki strzykawkowej. Wdychanie to odbywa się poprzez pobranie 60 ml powietrza z głównego bioreaktora z prędkością 3 ml na minutę, co trwa około 20 minut. Upewnij się, że filtry powietrza w głównym bioreaktorze są zaślepione natychmiast po wstrzyknięciu zawiesiny komórek i przed rozpoczęciem powolnego oddychania.
3. Pozwól płucom siedzieć statycznie przez około 18 godzin, a następnie rozpocznij powolną perfuzję naczyniową (około 0,5 ml/min).

6. Hodowla organów

Chociaż szczegóły dotyczące perfuzji i wentylacji będą się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego, zauważono następujące punkty:

1. Podczas posiewu śródbłonka perfuzja jest zwykle wykonywana z prędkością 1-3 ml/min za pomocą pompy rolkowej. Podczas hodowli nabłonka wentylacja jest zwykle zapewniana w sposób ciągły 1 oddech na minutę za pomocą pompy strzykawkowej. Pobranie 5-10 ml powietrza z głównego bioreaktora jest zwykle wymagane do wentylacji płuc przy normalnej objętości oddechowej. Ze względu na konieczność utrzymania szczelności bioreaktora podczas wentylacji, wentylacja powinna być codziennie przerywana, a powietrze w komorze głównej powinno być wymieniane. Całe powietrze w systemie to powietrze w pomieszczeniu, które składa się w około 21% z tlenu przy ciśnieniu cząstkowym. Pobranie 5-10 ml powietrza z bioreaktora (co indukuje wdech 5-10 ml płynu przez płuca) zależy od wielkości płuca i liczby płatów hodowanych (płaty można związać do analizy, podczas gdy pozostałe płaty są kontynuowane w hodowli). Ilość powietrza pobieranego przez pompę strzykawkową jest dobierana tak, aby w przybliżeniu odpowiadała "objętości oddechowej" wyhodowanego płuca.
2. Pożywkę należy zmieniać mniej więcej co 3-4 dni podczas hodowli.
3. Podczas jednoczesnej hodowli zarówno nabłonka, jak i śródbłonka, eksperymenty w naszym laboratorium zazwyczaj najpierw wysiewają nabłonek przez 4-8 dni, w tym czasie zmodyfikowana tkanka jest wentylowana. Śródbłonek jest następnie wysiewany przez perfuzję, po czym tkanka jest zarówno perfundowana, jak i wentylowana.

7. Reprezentatywne wyniki:

Decellularyzacja

Gdy protokół zostanie wykonany poprawnie, świeżo pobrane płuca powinny zatrzymać powietrze bez wycieków. Napompowanie ich powietrzem zanurzonym w cieczy może to sprawdzić - nie powinno być żadnych pęcherzyków wskazujących na wycieki powietrza. Późniejsza decelularyzacja powinna pozwolić na przepływ ~500 ml płynu decelularyzacyjnego przez płuca w ciągu 2,5 - 3 godzin w temperaturze 37°C, a PBS powinien ostatecznie być w stanie przepływać przez płuca z prędkością około 10 ml / min (poniżej ~15 mm Hg ciśnienia hydrostatycznego) pod koniec płukania. Po leczeniu 0,1% kwasem nadoctowym i benzonazą, płuca mogą być przechowywane w temperaturze 4°C przez okres do 3 miesięcy i nadal nadają się do recelularyzacji.

Ostateczna zdecelulizowana matryca zewnątrzkomórkowa powinna być całkowicie pozbawiona materiałów komórkowych i zachowywać grube, mikroskopijne i ultrastrukturalne cechy rodzimych płuc. Niewystarczająca decelularyzacja lub płukanie może spowodować "przyklejenie" się resztkowego DNA do rusztowania, co można uwidocznić za pomocą standardowego barwienia hematoksyliną i eozyną (patrz rysunek 3 dla porównania).

Ponowne zasiedlenie macierzy bezkomórkowej i hodowla tkanki płucnej

Jeśli komórki są świeżo wyizolowane od 7-dniowych nowonarodzonych szczurzych szczeniąt, jak opisano w internetowym suplemencie dołączonym do pracy Petersena i współpracowników⁴, można oczekiwać wydajności komórek 120-150 milionów komórek na miot 10 młodych (nieco ponad 10 milionów komórek na noworodka).

Optymalnymi warunkami do wysiewu komórek i późniejszej hodowli płuc w bioreaktorze powinny dać dobrze rozmieszczone komórki we wszystkich 5 płatach płuca i powinny zapewnić pokrycie około 70% rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (Rysunek 3). Wyhodowana populacja komórek będzie dodatnia dla kluczowych markerów komórek oddechowych, takich jak białko prowydzielnicze-C (SPC), białko wydzielnicze komórek Clara (CCSP) i akwaporyna-5 (AQP), w kolejności względnej liczebności (Figura 4).

Rysunek 1. Pozycje kaniul i bioreaktor decelularyzacyjny

Rysunek 2. Bioreaktor służący do wysiewu i hodowli zmodyfikowanej tkanki płucnej

Rysunek 3. Histologia natywnych, pozbawionych komórek i ponownie zasiedlonych płuc

Rysunek 4. Barwienie immunofluorescencyjne dla kluczowych markerów płucnych

Discussion

Do najbardziej krytycznych aspektów przedstawionego tutaj systemu należy utrzymanie sterylności i ścisłe monitorowanie nacisków wywieranych na łożysko naczyniowe w całym procesie przygotowania i wysiewu rusztowania oraz hodowli ponownie zasiedlonego płuca. Sterylność najlepiej utrzymać poprzez autoklawowanie wszystkich materiałów przed użyciem oraz poprzez umieszczenie płuc w systemie zamkniętym wkrótce po eksplantacji i unikanie późniejszego naruszenia tej bariery. Po dokładnym wypłukaniu matrycy pozbawionej komórek i przeniesieniu jej do sterylnego bioreaktora w celu hodowli, silikonowa nasadka oraz inne uszczelki i połączenia nie powinny być naruszane ani usuwane. Aby utrzymać ciśnienie w ryzach, preferowany jest przepływ napędzany grawitacją, gdy tylko jest to możliwe. Gdy do recyrkulacji płynu wymagana jest pompa, rozpoczynająca się po przepłukaniu PBS i kontynuowana podczas hodowli, zalecamy bezpośredni pomiar ciśnienia tuż przed wejściem płynu do tętnicy płucnej za pomocą przetwornika ciśnienia. Wielkość przyłożonego ciśnienia nie powinna przekraczać 15 mm Hg.

Recellularizowane płuca mogą być hodowane przez różne okresy czasu, zwykle od 4 dni do 3 tygodni. Perfuzja naczyniowa jest zwykle wykonywana z prędkością 1-3 ml / min podczas hodowli śródbłonka, podczas gdy wentylacja jest zwykle stosowana z szybkością 1 oddechu / min podczas hodowli nabłonka. Podczas połączonych okresów hodowli odpowiednia jest jednoczesna wentylacja i perfuzja. Wentylacja może być wykonywana za pomocą medium płynnego lub powietrza.

W ciągu ostatnich kilku dekad kilka grup przeprowadziło ważne prace z zakresu inżynierii tkankowej, wykazując możliwość różnicowania nabłonka płuc in vitro i odtworzenia kilku aspektów mikroanatomii płuc^7,8,9,10. Jednak do niedawna ^{żadna z} tych prób inżynierii tkanki płucnej nie doprowadziła do powstania wszczepialnego narządu, który byłby w stanie utrzymać separację między przedziałami krwi i dróg oddechowych i który mógłby uczestniczyć w wymianie gazowej. Dlatego, chociaż opisane metody są tylko pierwszym krokiem w kierunku długoterminowego celu, jakim jest wygenerowanie funkcjonalnej tkanki płucnej, ta praca jest zachęcającym krokiem w kierunku możliwości zwiększenia ilości tkanki płucnej dostępnej do przeszczepu. Co więcej, praca ta rozwija prace wykonane przez Otta i wsp. oraz Uyguna i współpracowników^11,12, wykazując skuteczność zdecelularizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej jako rusztowania dla złożonych trójwymiarowych struktur inżynierii tkankowej i wspierającej wzrost i przetrwanie różnych typów komórek. Praca ta jest również istotna ze względu na jej wkład w arsenał biologów chorób układu oddechowego, komórek i biologii molekularnej. Zapewniając unikalne, trójwymiarowe środowisko, które może również dostarczać odpowiednich bodźców mechanicznych i które nie dzieli towarzyszącego ryzyka szybkiego odróżnicowania, które można napotkać podczas hodowli nabłonka gryzoni w laboratorium przy użyciu bardziej tradycyjnych metod¹³, naukowcy mogą wykorzystać nasz system do uzyskania nowego wglądu w interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, które odgrywają rolę w różnicowaniu i funkcjonowaniu komórek. Wiedza ta może być szczególnie potężna, jeśli zostanie wykorzystana jako dźwignia do kierowania losem różnych populacji komórek macierzystych, jak wykazała grupa Cortielli we wstępnych^badaniach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eutanazja
Heparyna	Sigma-Aldrich	H4784
Nitrofrozydek sodu	Fluka	71778
Euthasol roztwór do eutanazji	Virbac Animal Health	710101	390 mg/ml pentobarbitalu roztwór podstawowy sodu powinien być odpowiednio rozcieńczony do podania
Roztwór decell
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
NaCl	AB01915		bioanalityczny
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaOH	JT Baker	3722-01
1X PBS	GIBCO, firmy Life Technologies	14190
Składniki bioreaktora
480 ml słoik	Cole-Parmer	EW-3460560
Korek silikonowy, rozmiar 14	Cole-Parmer	EW-06298-26
Łączniki Y	Cole-Parmer	ED-30614-08	Używany do kaniul tętniczych i tchawicy Rurki
silikonowe Masterflex	(Cole Palmer)	96420-14; 16	L/S 14; 16
Przetworniki ciśnienia	Edwards Lifesciences	PX-212
Zawór zwrotny	Cole-Parmer	EW-98553-20	Zawór
jednokierunkowy 4-drogowy Zawory odcinające	Edwards Lifesciences	594WSC
Filtr strzykawkowy	Cole-Parmer	2915-08	PTFE, 0,2μ m
Decell i aparaty do płukania (dodatki do bioreaktora)
Butelki szklane o pojemności 500 i 1000 ml	Corning	1395-500; -1L	Używane do decell i płukania grawitacyjnego
Leczenie benzonazą
Penicylina/streptomycyna	GIBCO, firmy Life Technologies	15140122
FBS	Hyclone	SH30071.03
Tris-HCl	Amerykański AB14043 Bioanalityczny		1M, pH 8,0
MgCl2	JT Baker	2444-01
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Nukleaza benzonazowa	Sigma-Aldrich	E1014	Endonukleaza stosowana do usuwania resztek DNA z macierzy