Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kierowanie i doprecyzowanie projekcji komórek zwojowych siatkówki (RGC) do śródmózgowia jest popularnym i potężnym systemem modelowym służącym do badania sposobu formowania się precyzyjnych wzorców połączeń neuronalnych podczas rozwoju. U myszy projekcje retinofugalne są ułożone topograficznie i tworzą warstwy specyficzne dla oka w bocznych ciałach kolankowatych (dLGN) wzgórza oraz w wzgórkach górnych (SC). Rozwój tych precyzyjnych wzorców projekcji retinofugalnych był zazwyczaj badany poprzez znakowanie populacji RGC barwnikami fluorescencyjnymi i tracerami, takimi jak peroksydaza chrzanowa1-4. Metody te są jednak zbyt mało precyzyjne, aby dostarczyć wglądu w zmiany rozwojowe w morfologii drzewienia aksonów poszczególnych RGC, które stanowią podstawę formowania się mapy retinotopowej. Nie pozwalają one również na genetyczną manipulację komórkami RGC.
W ostatnim czasie elektroporacja stała się skuteczną metodą zapewniającą precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową dostarczania naładowanych cząsteczek do siatkówki5-11. Obecne protokoły elektroporacji siatkówki nie pozwalają na manipulację genetyczną i śledzenie projekcji retinofugalnych pojedynczych komórek lub niewielkich grup komórek zwojowych siatkówki (RGC) u myszy postnatalnych. Twierdzono, że postnatalna elektroporacja in vivo nie jest wykonalną metodą transfekcji RGC, ponieważ wydajność znakowania jest niezwykle niska, co wymusza celowanie w wiek embrionalny, kiedy progenitory RGC przechodzą procesy różnicowania i proliferacji6.
W tym filmie opisujemy protokół elektroporacji in vivo służący do ukierunkowanego dostarczania genów, shRNA oraz fluorescencyjnych dekstranów do komórek zwoju nerwowego siatkówki (RGC) myszy w okresie postnatalnym. Technika ta stanowi ekonomiczną, szybką i stosunkowo prostą platformę do efektywnego przesiewania genów kandydackich zaangażowanych w różne aspekty rozwoju neuronalnego, w tym retrakcję aksonów, rozgałęzianie, laminację, regenerację oraz tworzenie synaps na różnych etapach rozwoju obwodów. Podsumowując, opisujemy tutaj wartościowe narzędzie, które dostarczy dalszych informacji na temat molekularnych mechanizmów leżących u podstaw rozwoju map sensorycznych.
Protokół
1. Przygotowanie sprzętu do elektroporacji
- Elektrody: Przerobiliśmy pęsetę Dumont #5 tak, aby służyła jako elektrody.
- Rozdzielić i rozebrać pęsetę.
- Przylutować przewód do szerszego końca każdego ramienia. Owinąć przytwierdzony przewód oraz ramiona taśmą izolacyjną, pozostawiając odsłonięte około 25-30 mm końcówek ramion.
- Złożyć zmodyfikowaną pęsetę, umieszczając między ramionami dowolny odpowiedni plastikowy dystans (np. guzik), aby zapewnić sprężystość.
- Sprzęt elektryczny: Używamy stymulatora elektrycznego do podawania impulsów prądu w celu przeprowadzania elektroporacji oraz oscyloskopu i monitora audio do potwierdzenia kształtu fali i liczby podawanych impulsów.
- Podłączyć przewód od jednego ramienia pęsety do pedału nożnego, który jest również połączony szeregowo ze stymulatorem. Pedał nożny pełni funkcję przełącznika. Po naciśnięciu zamyka obwód elektroporacji.
- Podłączyć przewód z drugiego ramienia do stymulatora elektrycznego.
- Podłączyć stymulator do oscyloskopu i monitora audio.
- Konfiguracja mikropipety i injektora: Używamy ostrych, dociągniętych pipet szklanych oraz systemu wtryskiwania Nanoinject II do wstrzykiwania bardzo małych objętości barwnika lub roztworu DNA bezpośrednio do siatkówki.
- Zamontować system injektora na trójosiowym mikromanipulatorze.
- Dociągnąć pipety szklane, tworząc długi stożek i małą końcówkę.
- Napełnić dociągniętą pipetę od tyłu olejem mineralnym i zamocować do injektora (szczegóły znajdują się w instrukcji obsługi Nanoinject II).
- Za pomocą ostrych nożyczek do mikrodyssekcjia odciąć końcówkę pipety, tworząc mały otwór (~2-3 μm).
- Napełnić pipetę żądaną ilością roztworu do wstrzykiwania przez końcówkę pipety. Dopóki końcówka pozostaje nieuszkodzona, może być ona wykorzystywana do wielokrotnych wstrzyknięć i u wielu zwierząt.
Uwaga: i) Należy upewnić się, że do końcówek wprowadzono wystarczającą ilość roztworu do wstrzykiwania, aby olej mineralny wprowadzony od tyłu nigdy nie został wstrzyknięty do oka. ii) System Nanoinject II oraz specjalistyczny sprzęt elektroniczny użyty w tym filmie nie są niezbędne do skutecznego znakowania RGC. Do znakowania RGC można również użyć innych urządzeń, takich jak picospritzer, oraz innych powszechnie stosowanych stymulatorów do elektroporacji.
2. Roztwory plazmidów do znakowania komórek zwojowych siatkówki
- Do znakowania małych skupisk RGC: stosujemy konstrukt kodujący EGFP (enhanced green fluorescent protein, ~2-3 μg/μL) pod kontrolą promotora CAG (promotor kurzej β-aktyny z enhancerem wczesnym CMV). EGFP jest znakowany sekwencją palmitoilacji GAP-43 (growth associated protein-43), co kieruje go do błony komórkowej (mut4EGFP)12. Konstrukt ten określany jest jako pCAG-gapEGFP.
- Do znakowania pojedynczych komórek: stosujemy kombinację dwóch konstruktów. Pierwszy wektor to promotor CAG napędzający rekombinazę Cre (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] plazmid 13775)13, a drugi wektor zawiera kasetę STOP z miejscami loxP, po której następuje EGFP skierowany do błony (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~0,15-ng/μL) stosuje się w stężeniu około 1 000–10 000 razy niższym niż pCAG-LNL-gapEGFP (~1-2 μg/μL), co ogranicza silną ekspresję EGFP do niewielkiej liczby komórek (ze względu na stosunkowo niskie stężenie pCAG-Cre).
3. Protokół iniekcji i elektroporacji siatkówki
- Szczury od 0. dnia postnatalnego (P0) do P5 znieczula się poprzez hipotermię, natomiast myszy starsze niż P5 znieczula się poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (0,7 ml/kg) mieszaniny ketaminy (4,28 mg/mL), ksylazyny (0,82 mg/ml) oraz acepromazyny (0,07mg/ml)14.
- Wszystkie narzędzia chirurgiczne oraz końcówki elektrod należy wysterylizować w sterylizatorze koralikowym. Następnie oba elementy należy schłodzić w sterylnej soli fizjologicznej przed użyciem, aby uniknąć uszkodzeń termicznych oka.
- Umieścić mysz pod mikroskopem sekcyjnym i ustawić injektor.
- W przypadku myszy młodszych niż P14 (przed otwarciem oczu), chirurgicznie otworzyć powiekę, przecinając ją wzdłuż całej długości przyszłej szczeliny powiekowej za pomocą mikro-nożyczek sprężynowychb.
- Powodować częściowe uwypuklenie gałki ocznej, delikatnie przykładając nacisk wokół oka końcówkami pęsetyc.
- Utrzymać oko w miejscu, delikatnie ściskając skórę wokół gałki ocznej.
- Wyregulować mikromanipulator i zbliżyć pipetę do gałki ocznej.
- Nacisnąć pedał nożny podłączony do systemu Nanoinject II, aby wypuścić kilka kropel roztworu do iniekcji i w ten sposób zweryfikować, czy pipeta nie jest zapchana.
- Stabilizując gałkę oczną jedną ręką, przesuwać mikromanipulator tak, aby końcówka szklanej pipety przebiła nabłonek barwnikowy siatkówki i weszła do siatkówki.
- Wstrzyknąć pożądaną ilość roztworu, naciskając pedał nożny systemu Nanoinject II. Na przykład, aby znakować pojedyncze RGCs, wykonujemy pojedynczą iniekcję 2,3-4,6nL.
- Wycofać pipetę, ostrożnie umieścić końcówki elektrod bezpośrednio nad miejscem iniekcji i nacisnąć pedał nożny stymulatora, aby zamknąć obwód i przeprowadzić elektroporację oka. Zazwyczaj stosujemy impulsy prostokątne o napięciu 25V, czasie trwania 50msec i odstępach 1sec. W przypadku myszy starszych niż P4 stosuje się 10 impulsów (po 5 impulsów każdej polaryzacji), a dla myszy od P0 do P3 stosuje się 6 impulsów (po 3 impulsy każdej polaryzacji).
- Delikatnie wcisnąć gałkę oczną z powrotem do oczodołu i nałożyć sterylną maść okulistyczną na nacięte powieki.
- Umieścić zwierzęta na podgrzewaczu z kontrolą temperatury, a po pełnym powrocie do sprawności, w tym odpowiednim ogrzaniu i odzyskaniu mobilności, zwrócić zwierzę matce.
- Monitorować zwierzęta co 12 godzin pod kątem wszelkich oznak bólu, stresu lub dyskomfortu, takich jak utrata mobilności, nieprawidłowa postawa lub brak pielęgnacji. Wielokrotnych cykli znieczulenia, iniekcji i elektroporacji nie należy przeprowadzać u tego samego zwierzęcia.
4. Uwagi
- Metoda iniekcji opisana w tym filmie to iniekcja „ślepa”. W przypadku pracy z myszami albinosami i kolorowymi roztworami (DiI lub roztwor roztworem plazmidu ze śladowymi ilościami fast blue) możliwe jest zwizualizowanie ilości i miejsca iniekcji. Jednak w przypadku pigmentowanych szczepów myszy miejsce iniekcji nie może być bezpośrednio zwizualizowane, przez co trudno jest opisowo określić, czy dotarto do zamierzonego miejsca w siatkówce lub jak daleko należy przesunąć pipetę, aby precyzyjnie trafić w warstwę RGC. Dlatego zdecydowanie zalecamy nowym użytkownikom rozpoczęcie od iniekcji DiI u myszy albinosów, ponieważ iniekcje te można natychmiast zwizualizować w siatkówce, a znakowanie projekcji RGC do siatkówki i mózgu może służyć do oceny jakości iniekcji. Do iniekcji ogniskowych należy przygotować 10% DiI w N,N-dimetyloformamidzie (100%). Po opanowaniu tej procedury użytkownicy powinni być w stanie konsekwentnie celować w RGC, stosując klarowne roztwory plazmidów DNA u myszy pigmentowanych.
- Metodę iniekcji opisaną w tym filmie można wykorzystać do wykonywania ogniskowych iniekcji DiI w celu znakowania małych populacji komórek do badań retinotopii (4,6 nL znakuje kilkaset RGC)14 oraz do masowego znakowania RGC fluoroforami (Alexa555, 488 itp.) sprzężonymi z podjednostką B toksyny cholerycznej w celu badania segregacji specyficznej dla oka, z pominięciem etapu elektroporacji opisanego w punkcie 10 powyżej. Zaleca się, aby maksymalna całkowita objętość iniekcji dowolnego roztworu wynosiła 2-3 µL dla myszy starszych niż P14 oraz 1-2 µL dla myszy młodszych niż P14.
- Pipety można napełniać od tyłu roztworami przeznaczonymi do iniekcji, a następnie napełniać od tyłu olejem mineralnym przed zamontowaniem pipety w injektorze i ścięciem końcówki. Jest to szczególnie przydatne przy stosowaniu roztworów DNA o wysokim stężeniu (~6 µg/µL), które są zazwyczaj bardzo lepkie i trudne do nabrania przez końcówkę pipety.
- Jeśli szklana pipeta zostanie zapchana, należy ostrożnie przetrzeć końcówkę pipety patyczkiem nasączonym wodą w przypadku roztworów DNA oraz etanolem (100%) w przypadku roztworów barwnika (DiI).
- Po wykonaniu iniekcji w oko należy wycofać końcówkę pipety z gałki ocznej i nacisnąć pedał, aby ponownie wstrzyknąć roztwór. Ma to na celu potwierdzenie, że końcówka nie zapchała się podczas procesu iniekcji. Jeśli roztwór nie zostanie wydzielony, jest wysoce prawdopodobne, że iniekcja nie powiodła się. Nie należy jednak traktować tego jako absolutnego sygnału niepowodzenia iniekcji. Eksperymentator może wykonać ponowną iniekcję w to samo oko, jeśli pożądane są liczne miejsca iniekcji i znakowanie większej liczby komórek.
- W celu znakowania pojedynczych RGC należy ustawić prędkość iniekcji na „slow” w jednostce sterującej Nanoinject. Pozwala to dodatkowo zmniejszyć ilość roztworu wstrzykiwanego do siatkówki, ponieważ przy tym ustawieniu system potrzebuje więcej czasu na wydzielenie roztworu, podczas gdy końcówka szklanej pipety jest jednocześnie szybko wycofiwana z gałki ocznej.
- Elektroporacja myszy w dniach postnatalnych od 0 do 3 (P0 do P3) wymaga szczególnej ostrożności, ponieważ bardzo łatwo jest uszkodzić oko (staje się to widoczne po kilku dniach rekonwalescencji, gdy oko jest wyraźnie mniejsze niż normalnie). W przypadku noworodków zaleca się zmniejszenie liczby impulsów i przyłożonego napięcia. Po dniu P4 gałki oczne są bardziej odporne na uszkodzenia wynikające z elektroporacji.
- W naszym doświadczeniu wersje EGFP lub RFP skierowane do błony komórkowej („gapEGFP”, patrz12) są znacznie lepsze niż niezmodyfikowane GFP do badania projekcji retinofugalnych do mózgu. Jednak pCAG-tdTomato, który nie posiada modyfikacji kierującej do błony, również działa dobrze (Rycina 1E). Dodatkowo do znakowania RGC przy użyciu opisanego powyżej protokołu elektroporacji można stosować barwniki fluorescencyjne sprzężone z dekstranem.
- Zazwyczaj 9 na 10 iniekcji prowadzi do oznakowania RGC, choć tylko około 15% iniekcji z zastosowaniem podejścia z dwoma plazmidami skutkuje oznakowaniem tylko jednej pojedynczej RGC. Liczbę udanych przypadków można zwiększyć, wstrzykując DNA w wielu miejscach w jednym oku lub wstrzykując plazmidy kodujące różne białka fluorescencyjne do każdego oka.
5. Reprezentatywne wyniki
Oznakowanie RGC zaobserwowano w każdym wieku, od P2 do P25, przy czym oznakowanie EGFP w RGC wystąpiło do 24 h po elektroporacji, a ekspresja była utrzymywana przez co najmniej trzy tygodnie po transfekcji.
Fluorescencyjnie znakowane dendryty (Rysunek 1A, B) oraz drzewa aksonalne (Rysunek 1F) pojedynczych RGC mogą zostać wyraźnie zwizualizowane i zrekonstruowane.
Oprócz komórek zwojowych siatkówki (RGC), technika ta może być wykorzystana do znakowania innych typów komórek siatkówki, takich jak komórki poziome, komórki dwubiegunowe oraz różne podtypy komórek amakrynowych (Rysunek 1C)
Metoda ta nie zakłóca normalnego przebiegu czasowego udoskonalania mapy wizualnej, co potwierdzono poprzez prawidłową retinotopię w SC (Rycina 1E).
W każdym wieku, w około 90% przypadków, wstrzyknięcie niewielkiej objętości (~2,3-4,6 nL) pCAG-gapEGFP prowadziło do ekspresji w kilku RGC (Rysunek 1D).
W około 15% prób z zastosowaniem pojedynczej iniekcji kombinacji plazmidów pCAG-Cre i pCAG-LNL-gapEGFP na zwierzę, uzyskano znakowanie pojedynczych neuronów siatkówki, w tym RGC (Rycina 1A,B,D) oraz innych typów komórek, takich jak komórki amakrynowe (Rycina 1C).
Rycina 1 - A, B. Przykłady pojedynczych komórek zwojowych siatkówki znakowanych EGFP (grot strzałki wskazuje akson) w preparacie siatkówki flat-mount w 14. dniu po urodzeniu (P14). C. Przykład pojedynczej komórki amacrynej typu starburst w P8. D. Grupa neuronów siatkówki znakowanych EGFP, w tym RGC i komórki amacryne, w preparacie siatkówki flat-mount w P14. E. Grzbietowe i brzuszne RGC w prawym oku zostały poddane elektroporacji i znakowane EGFP, a skroniowe i brzuszne RGC w lewym oku zostały poddane elektroporacji i znakowane tdTomato w P1. Strefy docelowe (gwiazdki) utworzone przez znakowane RGC są widoczne w ich topograficznie poprawnych lokalizacjach w SC w P9 (whole-mount, biały obrys). F. Przykład pojedynczego drzewa aksonalnego RGC znakowanego EGFP (projekcja 2-D) w przekroju strzałkowym (grubość 250 μm) SC (linia przerywana). Dla przejrzystości obrazy w (D) i (F) zostały przekonwertowane na skalę szarości i odwrócone. Paski skali (μm): (A) - (D), (F): 100; (E): 500
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym filmie prezentujemy protokół elektroporacji in vivo, który pozwala na znakowanie pojedynczych neuronów siatkówki lub ich małych skupisk u myszy postnatalnych za pomocą konstruktów DNA kodujących białka fluorescencyjne. Małe skupiska fluorescencyjnie znakowanych projekcji RGC do dLGN i SC odtworzyły wzorce projekcji podobne do tych uzyskanych w poprzednich badaniach z wykorzystaniem znakowania RGC barwnikami lipofilnymi, co wskazuje, że elektroporacja nie zakłóciła prawidłowego procesu doprecyzowania...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Plazmid pCAG-gapEGFP był darem od dr S. McConnella (Stanford, CA). Plazmid pCAG-tdTomato był darem od dr M. Fellera (Berkeley, CA). Dziękujemy dr Edwardowi Ruthazerowi za zasugerowanie zastosowania strategii dwu-plazmidowej do znakowania pojedynczych komórek, Anne Schohl (Montreal, QC) za walidację strategii Cre/loxP z wykorzystaniem dwóch plazmidów w badaniach pilotażowych oraz członkom laboratorium Craira za wsparcie techniczne. Praca finansowana z grantów R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) oraz NIH P30 EY000785 (MC).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pinceta Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Stymulator elektryczny | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscyloskop | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Monitor audio | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Wyciągacz elektrod | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Nożyczki Vannasa a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Mikronożyczki b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Pinceta Dumont AA c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| System Nanoinject II | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Pipety szklane | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Pedał nożny | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Olej mineralny | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-dimetyloformamid | Sigma-Aldrich | D4551 |
Bibliografia
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
