Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Podsumowanie

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Streszczenie

Miesiączkowy pęcherzyk jajnika jest jednostką funkcjonalną jajnika, która wydziela hormony płciowe i wspiera dojrzewanie oocytu. Techniki hodowli pęcherzyków in vitro stanowią narzędzie do modelowania rozwoju pęcherzyka w celu badania biologii podstawowej, a ponadto są rozwijane jako metoda zachowania płodności w praktyce klinicznej^1-4. Nasz system hodowli in vitro wykorzystuje hydrożele w celu naśladowania naturalnego środowiska jajnika poprzez utrzymanie trójwymiarowej architektury pęcherzyka, interakcji międzykomórkowych oraz sygnalizacji paracrynnej kierującej rozwojem pęcherzyka ⁵. Wcześniej pęcherzyki z sukcesem hodowano w alginianie, obojętnym polisacharydzie pochodzenia glonowego, który żeluje w obecności jonów wapnia^6-8. Hydrożele alginianowe tworzone w stężeniu 0,25% w/v okazały się najbardziej sprzyjające hodowli pęcherzyków i pozwoliły na zachowanie najwyższej zdolności rozwojowej ⁹. Hydrożele alginianowe nie są degradowalne, w związku z czym wzrost średnicy pęcherzyka powoduje powstanie siły ściskającej, która może wpływać na jego wzrost¹⁰. Następnie opracowaliśmy system hodowli oparty na przenikającej się sieci fibrynowo-alginianowej (FA-IPN), w której mieszanina fibryny i alginianu żeluje się jednocześnie. Kombinacja ta zapewnia dynamiczne środowisko mechaniczne, ponieważ początkowo oba komponenty przyczyniają się do sztywności macierzy; jednak proteazy wydzielane przez rosnący pęcherzyk degradują fibrynę w macierzy, pozostawiając jedynie alginian jako wsparcie. W przypadku sieci IPN zawartość alginianu może zostać zredukowana poniżej 0,25%, co nie jest możliwe przy zastosowaniu samego alginianu ⁵. Dzięki temu, w miarę rozrastania się pęcherzyka, będzie on poddawany mniejszej sile ściskającej ze względu na zredukowaną zawartość substancji stałych. W niniejszej pracy opisujemy metodę enkapsulacji oraz system hodowli in vitro pęcherzyków jajnika w sieci FA-IPN. Dynamiczne środowisko mechaniczne naśladuje naturalne środowisko jajnika, w którym małe pęcherzyki znajdują się w sztywnej korze i przemieszczają się do bardziej podatnego rdzenia w miarę zwiększania swoich rozmiarów¹¹. Komponent degradowalny może mieć krytyczne znaczenie dla wdrożenia klinicznego, aby umożliwić ponad 10⁶-krotny wzrost objętości, jakiego ludzkie pęcherzyki zazwyczaj ulegają in vivo.

Protokół

1. Izolacja mieszków

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi w National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals oraz zatwierdzonym protokołem Institutional Animal Use and Care na Northwestern University.

Aby uzyskać optymalne wyniki, wszystkie sekcje przeprowadza się w pożywce L15 w celu kontroli pH przy otoczeniu o standardowym stężeniu CO₂, na stolikach grzewczych o temperaturze 37°C dla kontroli temperatury oraz w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne. Pożywkę do sekcji (DM) przygotowuje się z pożywki L15 uzupełnionej o 50 IU/mL penicyliny, 50 μL/mL streptomycyny oraz 1% FBS. Pożywkę do utrzymania (MM) przygotowuje się z pożywki αMEM uzupełnionej o 50 IU/mL penicyliny, 50 μL/mL streptomycyny oraz 1% FBS.

1. Przenieść świeżo wypreparowane jajniki od 16-dniowej myszy do nowej szalki Petriego 35 mm zawierającej 1-2 mL MM z dodatkiem 0,1% kolagenazy i 0,1% DNazy. Inkubować przez 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂.
2. Po inkubacji przeprowadzić kilka etapów płukania w DM w celu usunięcia kolagenazy, a następnie przenieść materiał do szalki Petriego 35 mm ze świeżym DM. Wyizolować pęcherzyki z jajnika, delikatnie odrywając (lub odcinając) je od całej tkanki jajnika za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 28 5/8 G przymocowanych do jednorazowych strzykawek. Usunąć jak najwięcej zrębu, nie naruszając integralności pęcherzyka. Wypreparować 20-40 pęcherzyków wtórnych z jednego jajnika (130-150 mm). Pęcherzyki te mają zazwyczaj 2-3 warstwy komórek somatycznych.
3. Dodać 1 mL MM do centralnej zagłębienia szalki Petriego do IVF (in vitro fertilization) 60 mm oraz 3 mL MM do zewnętrznego pierścienia. Za pomocą pipety przenieść nienaruszone pęcherzyki do zewnętrznego pierścienia szalki IVF w celu krótkiego opłukania, a następnie selektywnie przenieść je do centralnego zagłębienia (Patrz 1.4). Przechowywać szalkę IVF w inkubatorze.
4. Po zebraniu wszystkich pęcherzyków przeprowadzić etap selekcji pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 5-8x. Zdrowe pęcherzyki charakteryzują się następującymi cechami morfologicznymi:
   • 2-3 warstwy komórek somatycznych
   • 130-150 mm
   • Brak separacji między oocytem a komórkami somatycznymi
   • Nienaruszone i okrągłe oocyty
     Przenieść zdrowe pęcherzyki do centrum szalek IVF w celu enkapsulacji.

2. Enkapsulacja pęcherzyka, Metoda 1 – „Metoda kropli”

1. Do środkowej studni naczynia do IVF dodać 1 mL trombiny (50 IU/mL) w TBS z 40 mM CaCl₂. Rozmrozić i przechowywać zapas fibrynogenu (50 mg/mL w TBS) na lodzie. Bezpośrednio przed użyciem doprowadzić fibrynogen do temperatury pokojowej.
2. Przygotować roztwór fibrynogenu/alginianu, mieszając 1x PBS, 0,5% roztwór alginianu w PBS oraz roztwór fibrynogenu (50 mg/mL) w stosunku 2:1:1 w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do roztworu. Delikatnie wymieszać na vortexie i odwirować. Roztwór ma lekko mętny wygląd i powinien być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.
3. Nanieść dwie krople roztworu fibrynogenu/alginianu na zewnętrzny pierścień naczynia do IVF: kroplę 90 μL do enkapsulacji oraz kroplę 10 μL do płukania. Aby zmniejszyć parowanie, wyłączyć podgrzewany stolik w mikroskopie sekcyjnym. Przenieść 10-15 pęcherzyków do kropli 10 μL z minimalną ilością pożywki (< 5 μL), używając końcówki mikropipety 200 μm, a następnie szybko wymieszać. Przenieść wszystkie pęcherzyki do kropli 90 μL z minimalną ilością roztworu (< 5 μL) z pierwszej kropli i wymieszać.
4. Jednocześnie aspirować jeden pęcherzyk oraz 5 μL roztworu fibrynogenu/alginianu za pomocą końcówki pipety 10 μL, a następnie uwolnić je do roztworu trombiny/Ca²⁺ w naczyniu do IVF. Powtarzać ten krok, aż wszystkie pęcherzyki zostaną zamknięte w kuleczkach.
5. Sieciować kuleczki przez 5-7 minut w roztworze trombiny/Ca²⁺. Kuleczki staną się ciemniejsze w miarę żelowania fibryny. Przenieść kuleczki do szalki Petriego zawierającej MM, zaczynając od tych ciemniejszych. Inkubować naczynie w inkubatorze przez 15-30 minut, aby wypłukać pozostałą trombinę.
6. Przenieść kuleczki do 96-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 100 μL pożywki do wzrostu pęcherzyków i niezwłocznie wykonać obrazowanie. Pożywka do wzrostu (GM) jest przygotowana na bazie pożywki αMEM uzupełnionej o 10 mIU/mL rekombinowanego FSH, 3 mg/mL BSA, 1 mg/mL wołowej fetuiny, 5 μg/mL insuliny, 5 μg/mL transferyny oraz 5 ng/mL selenu.

3. Enkapsulacja mieszyków, metoda 2 – „Metoda z użyciem Parafilmu”

1. Przygotować roztwór fibrynogenu/alginianu, mieszając 0,5% roztwór alginianu i 50 mg/mL roztwór fibrynogenu w stosunku 1:1 w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL.
2. Nanieść krople po 7,5 μL mieszaniny fibrynogenu/alginianu na szkiełko przedmiotowe pokryte parafilmem z dystansami 3 mm. Przenieść 1 pęcherzyk do każdej kropli wraz z minimalną ilością pożywki.
3. Dodać 7,5 μL roztworu trombiny/Ca²⁺ do każdej kropli. Mieszanie nie jest konieczne, ponieważ żel tworzy się niemal natychmiastowo.
4. Przykryć żele drugim szkiełkiem przedmiotowym pokrytym parafilmem, umieścić szkiełka odwrócone do góry dnem w szalce Petriego o średnicy 100 mm i przenieść do inkubatora na 5 minut.
5. Przenieść kuleczki do szalki Petriego zawierającej MM, a następnie do dołka hodowlanego, zgodnie z wcześniejszym opisem. Jeśli kuleczki skleiły się ze sobą wskutek sieciowania między nimi, można je delikatnie rozdzielić pęsetą.

4. Obrazowanie pęcherzyków i wymiana pożywki

1. Co 2 dni hodowane pęcherzyki są obrazowane za pomocą mikroskopu świetlnego, a średnicę pęcherzyków mierzy się przy użyciu programu komputerowego ImageJ.
2. Co 2 dni połowę pożywki wzrostowej (50 μL) wymienia się na świeżą, uprzednio wyrównaną pożywkę wzrostową.

5. Odzyskiwanie mieszków z macierzy 3D i dojrzewanie oocytów in vitro (IVM)

1. Po 8 dniach hodowli hydrożele stają się przezroczyste z powodu całkowitej degradacji komponentu fibrynowego, a pęcherzyki powiększają się do średnicy 300-400 μm. Pozostały alginian jest degradowany przez alginianliozę, enzym pochodzenia roślinnego, który specyficznie degraduje alginian i nie wpływa na komórki zwierzęce.
2. Usunąć pożywkę wzrostową z dołków zawierających kuleczki i dodać 100 mL alginianliozy w stężeniu 10 IU/mL w αMEM. Pozostawić płytkę w inkubatorze na 25-30 minut.
3. Usunąć pęcherzyki z rozpuszczonych kuleczek za pomocą końcówki o tępym zakończeniu. Przenieść je najpierw do zewnętrznego pierścienia naczynia do IVF zawierającego DM, a następnie do dołka centralnego, również zawierającego DM, w celu przemycia.
4. Po przemyciu przenieść pęcherzyki do zewnętrznego, a następnie wewnętrznego pierścienia naczynia do IVF zawierającego pożywkę do dojrzewania. Pożywka do dojrzewania in vitro (IVM) składa się z αMEM, 10% FCS, 1,5 IU/mL hCG oraz 5 ng/mL epidermal growth factor (EGF).
5. Przenieść do inkubatora CO₂ na 15-16 godzin.
   Zbadać pęcherzyki pod kątem ekspansji komórek cumulus. Aby usunąć komórki cumulus z oocytu, dodać roztwór hialuronidazy do stężenia końcowego 0,1 mg/mL i inkubować w inkubatorze przez 2-3 minuty. Użyć końcówki mikropipety 75 mm, aby oddzielić komórki cumulus od oocytu poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół. Określić stopień dojrzałości oocytu pod mikroskopem świetlnym lub stereoskopowym. Możliwe stadia, od najmniej do najbardziej dojrzałego, to:
   • Zdegenerowany. Oocyt jest pofragmentowany na dwa lub więcej kawałków.
   • Stadium pęcherzyka zarodkowego (GV). Oocyt nie wznowił mejozy w odpowiedzi na ekspozycję na hCG, co objawia się dalszą obecnością jądra oocytu (GV).
   • Rozpad pęcherzyka zarodkowego (GVBD). Błona jądrowa w oocycie jest nieobecna, ale nie występuje ciało polarne. Zatem oocyt nadal znajduje się w mejozie-I.
   • Oocyt zatrzymany w metafazie-II (MII). Oocyt wznowił mejozę i jest obecnie zatrzymany w metafazie-II. Ciało polarne powinno być widoczne pod mikroskopem świetlnym lub stereoskopowym. Oocyt pozostanie w stadium MII, chyba że zostanie zapłodniony w późniejszych eksperymentach.

6. Reprezentatywne wyniki:

Opisaliśmy nowatorską metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w FA-IPN do hodowli in vitro (Rycina 1). Pęcherzyki jajnikowe składają się z oocytu otoczonego kilkoma warstwami komórek somatycznych. Komunikacja między wieloma przedziałami komórkowymi jest niezbędna dla prawidłowego rozwoju pęcherzyka i dojrzewania oocytu. Enkapsulacja pęcherzyka w hydrożelu 3D wspomaga jego ekspansję, zachowując jednocześnie architekturę pęcherzyka ^9,11,12. W miarę rozwoju pęcherzyków ich objętość zwiększa się wykładniczo, a enkapsulujący biomateriał powinien umożliwiać tę ekspansję bez generowania hamującej siły ściskającej. FA-IPN to sieć zbudowana z dwóch naturalnych materiałów, w której fibryna jest proteolitycznie degradowalna przez aktywowaną przez pęcherzyk plazminę, a alginian jest biologicznie obojętny ¹³(Rycina 2). Podczas wzrostu pęcherzyka degradacja fibryny rozpoczyna się lokalnie w jego sąsiedztwie i trwa do momentu usunięcia fibryny z hydrożelu. Niedegradowalny komponent alginianowy, który pozostaje nienaruszony przez cały okres hodowli, utrzymuje strukturę 3D hydrożelu.

Mieszki izolowano na wtórnym etapie rozwoju (średnica 150-180 μm) i powiększano do 400 μm na etapie antralnym rozwoju w żelach FA-IPN. Po stymulacji hCG hodowane mieszki mogą ulec ekspansji komórek cumulus, a oocyty mogą wznowić mejozę i przejść do metafazy II w celu zapłodnienia. Wyniki te sugerują, że metoda enkapsulacji oraz materiał enkapsulujący umożliwiły hodowlę mieszków i ich pomyślne dojrzewanie in vitro (Rysunek 3).

Degradacja fibryny wokół enkapsulowanych pęcherzyków rozpoczyna się w pierwszym dniu hodowli i kończy do 6. dnia. Aprotynina, rozpuszczalny inhibitor plazminy, może być stosowana w celu zmiany tempa degradacji fibryny i przedłużenia gradientu mechanicznego w materiale enkapsulującym (Rycina 4). Jeśli pęcherzyki są hodowane z aprotyniną w stężeniu 0,01 TIU/mL, fibryna ulega wolniejszej degradacji przez pierwsze 4 dni. Mimo to pęcherzyki wciąż mogą rozwijać się do stadium antralnego, a oocyty pozostają zdolne do wznowienia mejozy do metafazy II po usunięciu aprotyniny. Wysokie stężenie aprotyniny (0,1 TIU/mL) znacząco hamuje degradację fibryny, sztywność macierzy zapobiega ekspansji pęcherzyków i obserwuje się inwazję komórek somatycznych do macierzy.

Rycina 1. Schemat rozwoju pęcherzyka jajnikowego. Pęcherzyk jajnikowy składa się z centralnie położonego oocytu otoczonego jedną lub większą liczbą warstw komórek somatycznych, które wspierają rozwój oocytu. W miarę rozwoju pęcherzyków od stadium wtórnego do przedowulacyjnego stadium antralnego, komórki somatyczne otaczające oocyt proliferują i różnicują się, a oocyt zwiększa swoją wielkość. Dojrzewanie in vitro (IVM) jest ostatnim etapem hodowli pęcherzyków, podczas którego komórki somatyczne przylegające do oocytu, nazywane komórkami cumulus, ulegają ekspansji po stymulacji hCG, a oocyt wznawia mejozę i przechodzi do stadium metafazy II (MII).

Rycina 2a. Alginian i fibryna-alginian do hodowli pęcherzyków 3D in vitro. (a) Alginian jest naturalnym biomateriałem odpowiednim do hodowli pęcherzyków in vitro ze względu na łagodne żelowanie i charakterystykę biochemiczną, taką jak rozmiar oczek sieci, kontrolowana sztywność i biologiczna obojętność. Alginian jest liniowym kopolimerem polisacharydowym kwasu α-L-guluronowego (G) i kwasu β-D-mannuronowego (M). Obszary z powtarzającymi się monomerami G, nazywane „blokami G”, ulegają sieciowaniu w obecności dwuwartościowych jonów wapnia, tworząc hydrożel.

Rycina 2b. (b-i) Małe enkapsulowane pęchyki podlegają niskiej sile ściskania w alginianie na początku hodowli. Jednak w miarę rozrostu pęchyka zwiększa się objętość wyparta w kulce, co skutkuje większą siłą ściskania działającą w kierunku przeciwnym do ekspansji pęchyka (b-ii).

Rycina 2c. Łańcuchy poszczególnych polimerów w roztworze fibryno-alginianowym są całkowicie splątane przed sieciowaniem. Oba komponenty FA-IPN rozpoczynają proces sieciowania natychmiast po wystawieniu na działanie mieszaniny trombiny i wapnia.

Rycina 3a. Schemat blokowy izolacji pęcherzyków i ich enkapsulacji w FA-IPN. Pęcherzyki wtórne są izolowane z 16-dniowej myszy (A-i). Narządy rozrodcze zostają wypreparowane (A-ii), a wyizolowane pęcherzyki przeniesione do naczynia z podłożem utrzymującym (A-iii).

Rycina 3b. Metoda kropelkowa enkapsulacji mieszków w roztworze alginianu i fibrynogenu (B:i-iv). Do szalki pipetuje się dwie krople roztworu alginianu i fibrynogenu: kroplę płuczącą (10 μL) oraz kroplę do enkapsulacji (90 μL) (B-i). Następnie 3-5 mieszków przenosi się do kropli płuczącej (B-ii). Po wypłukaniu i usunięciu medium, mieszki przenosi się do kropli do enkapsulacji (B-iii). Każdy mieszek aspiruje się wraz z 5 μL roztworu alginianu i fibrynogenu za pomocą końcówki do pipety 10 μL, a następnie wydmuchuje do roztworu trombiny i wapnia (B-iv).

Rycina 3c. Sieciowanie kuleczki trwa 5 minut. Metoda z użyciem parafilmu do enkapsulacji mieszków w roztworze fibrinogenu i alginianu (C:i-iii). Roztwór fibrinogenu i alginianu (7,5 μL) jest pipetowany na szkiełko przedmiotowe pokryte parafilmem, a następnie po płukaniu poszczególne mieszki są przenoszone do każdej kropli (C-i, ii). Do każdej kropli dodaje się roztwór trombiny (7,5 μL) (C-iii).

Rycina 3d - e. Krople zostają przykryte drugim szkiełkiem przedmiotowym pokrytym parafilmem, a FA-IPN jest sieciowany w inkubatorze przez 5 minut. (D) Enkapsulowane pęcherzyki są przenoszone do pożywki wzrostowej w płytce 96-dołkowej. (E) Obraz enkapsulowanego pęcherzyka w FA-IPN (biała strzałka).

Rycina 4. Degradacja fibryny przez rosnący pęcherzyk. Pęcherzyki degradują komponent fibryny w FA-IPN w okresie hodowli, co objawia się powstaniem przejrzystego okręgu wokół pęcherzyka. Architektura 3D pęcherzyka jest wspierana przez pozostały alginian. W dniu 0 (D0) fibryna jest wciąż nienaruszona, a macierz wokół pęcherzyka jest mętna; po 1 dniu hodowli (D1) pojawia się przejrzysty pierścień wokół pęcherzyka (biała strzałka), a front degradacji fibryny nadal rozszerza się promieniście w dniu 2 (D2) i dniu 4 (D4) hodowli.

Rycina 5. Obrazy wzrostu mieszków. Reprezentatywne obrazy wzrostu mieszków wtórnych w FA-IPN w dniu 0 (A), 4 (B), 6 (C) i 8 (D) hodowli. Po 8 dniach mieszki antralne dojrzewały in vitro, a wynikające z tego oocyty w stadium MII przedstawiono na obrazie (E, ciałko polarne wskazano czarną strzałką).

Rysunek 6. Degradacja fibryny została zahamowana przez aprotininę. W pierwszym rzędzie przedstawiono rosnące pęcherzyki w dniach 2, 4, 10 i 12. Aprotininę w stężeniach 0,01 TIU/mL (drugi rząd) i 0,1 TIU/mL dodawano do mediów hodowlanych w dniach 0, 2 i 4. Tylko hodowle pęcherzyków z 0,01 TIU/mL aprotininy zdegradowały fibrynę po usunięciu aprotininy i osiągnęły stadium antralne. Pęcherzyki hodowane w 0,1 TIU/mL aprotininy nie rosły w FA-IPN.

Skrót	Pełna nazwa
CO2 incubator	Inkubator 37°C z 5% CO2
COC	Kompleks oocyt-komórki cumulus
3D	Trójwymiarowy
DM	Poziomka do sekcji
EGF	Epidermalny czynnik wzrostu
FA-IPN	Fibryno-alginianowa sieć przenikająca
FBS	Płodowa surowica bydlęca
GM	Pożywka wzrostowa
GV	Pęcherzyk zarodkowy
hCG	Ludzka gonadotropina kosmórkowa
ITS	Suplement insulinowo-transferryno-selenowy
IVF dish	Szalka do zapłodnienia in vitro 60 mm z wgłębieniem centralnym
MM	Pożywka do utrzymania
MII stage oocyte	Oocyt w stadium metafazy II
rFSH	Rekombinowana hormon stymulująca pęcherzyki jajnikowe
TBS	Bufor solny Tris
TIU	Jednostki inhibicyjne trypsyny

Tabela 1. Skróty

Dyskusja

Przedstawiona metoda enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w FA-IPN umożliwia hodowlę pęcherzyków w środowisku trójwymiarowym in vitro. FA-IPN to dynamiczna, komórkowo responsywna macierz, w której początkowe właściwości mechaniczne są określone przez kombinację fibryny i alginianu. Podczas hodowli enkapsulowany pęcherzyk aktywuje proteazy, które degradują tylko jeden składnik IPN – fibrynę – co prowadzi do stopniowego zmniejszania sztywności żelu, która pod koniec hodowli wynika wyłącznie z pozostałego alginianu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fetuina	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotynina	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Zestaw fibryny Tisseel	Baxter Internationl Inc.	921030
Alginian sodu	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa