Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) oraz utraty fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP) umożliwiają badanie dynamiki białek w żywych komórkach z dobrą rozdzielczością przestrzenną i czasową. W niniejszym materiale opisujemy, jak przeprowadzać testy FRAP i FLIP dla białek chromatyny, w tym H1 i HP1, w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ES). W eksperymencie FRAP komórki są transfekowane, przejściowo lub stabilnie, białkiem docelowym połączonym z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub jego pochodnymi (YFP, CFP, Cherry itp.). W transfekowanych, fluorescencyjnych komórkach intensywna, skupiona wiązka lasera wybiela stosunkowo niewielki obszar zainteresowania (ROI). Długość fali lasera jest dobierana zgodnie z białkiem fluorescencyjnym użytym do fuzji. Światło lasera nieodwracalnie wybiela sygnał fluorescencyjny cząsteczek w ROI, a bezpośrednio po wybielaniu, za pomocą obrazowania poklatkowego, monitoruje się odzyskiwanie sygnału fluorescencyjnego w wybielonym obszarze – zapośredniczone przez zastępowanie wybielonych cząsteczek cząsteczkami niewybielonymi. Wygenerowane krzywe odzyskiwania fluorescencji dostarczają informacji o mobilności białka. Jeśli cząsteczki fluorescencyjne są nieruchome, nie zostanie zaobserwowane odzyskiwanie fluorescencji. W podejściu komplementarnym, utracie fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP), wiązka lasera wielokrotnie wybiela ten sam punkt, a intensywność sygnału jest mierzona w innym miejscu fluorescencyjnej komórki. Eksperymenty FLIP mierzą zatem zanik sygnału, a nie odzyskiwanie fluorescencji i są przydatne do określania mobilności białek, a także ich przemieszczania się między przedziałami komórkowymi. Przejściowe wiązanie jest powszechną cechą białek związanych z chromatyną. Chociaż w każdym danym momencie w stanie stacjonarnym główna frakcja każdego białka chromatynowego jest związana z chromatyną, wiązanie to jest przejściowe i większość białek chromatynowych charakteryzuje się wysokim obrotem na chromatynie, z czasem przebywania rzędu sekund. Właściwości te są kluczowe dla generowania wysokiej plastyczności ekspresji genomu1. Eksperymenty z fotowybielaniem są zatem szczególnie użyteczne do określania plastyczności chromatyny przy użyciu wersji białek strukturalnych chromatyny z fuzją GFP, zwłaszcza w komórkach ES, gdzie dynamiczna wymiana białek chromatyny (w tym białka heterochromatyny 1 (HP1), histonu łącznikowego H1 i histonów rdzeniowych) jest wyższa niż w komórkach zróżnicowanych2,3.
Protokół
1. Wysiewanie komórek ES
T = 0 h
Wysiew MEF
- Pokryć 8-dołkowe μ-slajdy do obrazowania na żywo (ibidi; Monachium, Niemcy) żelatyną, lub użyć szkiełek nakrywkowych z komorami (Lab-Tek; Rochester, NY) lub szalek hodowlanych z szklanym dnem (MatTek; Ashland, MA). Pozostawić na 5-30 min, a następnie odessać nadmiar żelatyny.
- Zasiać 22 000 MEFs/dołek w całkowitej objętości 250 μl DMEM [uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)]. Pozostawić komórki do wzrostu w inkubatorze do hodowli tkankowych (37°C, 5% CO2).
T = 6 h
Wysiewanie komórek ES
- Odssać DMEM.
- W każdym studzienku pokrytym MEF wysiać 15 000 komórek R1/studzienek w całkowitej objętości 250 μl pożywki dla komórek ES [uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) klasy ESC, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM nieessentialnych aminokwasów, 0,1 mM β-merkaptoetanolu oraz 1000 U/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF)], aby następnego dnia uzyskać 30% do 50% konfluencji.
2. Transfekcja komórek ES
T = 24 hrs
Transfekcja przejściowa
- Wymień pożywkę dla komórek ES na 250 μl/dołek świeżej pożywki dla komórek ES.
- Do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 100 μl pożywki bezsurowiczej [Opti-MEM (Gibco)], a następnie dodaj 10 μl odczynnika do transfekcji TransIT-LT1 (Mirus) bezpośrednio do pożywki bezsurowiczej. Wymieszaj, delikatnie pipetując, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5-20 min.
- Do rozcieńczonego odczynnika TransIT-LT1 dodaj 1,5 μg plazmidowego DNA fuzji GFP (H1e, H1o lub HP1). Wymieszaj, delikatnie pipetując, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15-30 min.
- Dodaj 13,5 μl/dołek mieszaniny do transfekcji. Delikatnie zakręć 8-dołkowymi szkiełkami μ-Slides, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Po 24 h wymień zużytą pożywkę dla komórek ES na 250 μl świeżej pożywki dla komórek ES.
3. Przeprowadzanie FRAP i FLIP
T = 48-72 h
- Eksperyment można przeprowadzić na dowolnym konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym (CLSM), jednak ponieważ w typowym eksperymencie FRAP/FLIP pozyskuje się wiele następujących po sobie obrazów, zaleca się stosowanie konfokalnego mikroskopu z dyskiem rotującym (spinning-disk), który zapewnia odpowiednią szybkość akwizycji i gwarantuje, że po początkowym, zamierzonym procesie wybielania nie wystąpi niepożądane wybielanie próbki. W tym przypadku zalecamy użycie systemu konfokalnego z dyskiem rotującym Revolution (www.Andor.com) z głowicą z dyskiem rotującym Yokogawa CSU-X. System ten posiada podwójną funkcjonalność: pozwala na fotowybielanie przy użyciu specjalistycznego modułu FRAPPA z systemem skanowania punktowego oraz na szybkie przełączenie światła z powrotem w celu zbierania obrazów za pomocą dysku rotującego. Trzema najczęściej stosowanymi białkami fluorescencyjnymi w eksperymentach z fotowybielaniem są GFP, YFP i Cherry. W przypadku użycia GFP lub YFP wymagany jest laser o długości fali ~488 nm. Dla Cherry należy użyć lasera ~560 nm. W każdym przypadku zalecamy stosowanie laserów półprzewodnikowych (solid state). Automatyczny stolik jest przydatny, ale nie jest wymagany. Ponieważ obrazowane są żywe komórki, niezbędne jest zastosowanie komory inkubacyjnej (my używamy komory firmy LIS, Szwajcaria), kontrolującej poziom tlenu, wilgotność, CO2 i temperaturę. FRAP przeprowadza się przy maksymalnej intensywności lasera, natomiast obrazowanie wykonuje się przy minimalnej mocy lasera, jaka jest wymagana (zwykle w okolicach 10%, gdy poziom fluorescencji jest odpowiedni).
Obserwuj komórki przy użyciu światła fluorescencyjnego o odpowiedniej długości fali i wybierz komórkę wykazującą ekspresję GFP, używając obiektywu imersyjnego 60X. Upewnij się, że dystrybucja subkomórkowa jest prawidłowa. Czasami, gdy poziomy ekspresji są zbyt wysokie, lokalizacja białka może „przesiąkać” do innych przedziałów, takich jak jąderko. Takich komórek nie należy wybierać. - Następnie ustaw protokół obrazowania: zarejestruj 3-5 klatek przed fotowybielaniem, następnie przeprowadź fotowybielanie w obrębie euchromatyny lub heterochromatyny (widocznej jako skondensowane ogniska GFP) i zarejestruj 90-120 klatek po fotowybielaniu w odstępach 250-1000 ms: H1e-GFP, 1000 ms, H1o oraz HP1-GFP, 250 ms (czas odstępu zmienia się w zależności od dynamiki białka, przy czym białka o wysokiej dynamice wymagają krótszego czasu odstępu). Zazwyczaj stosujemy 80-100% intensywności lasera do fotowybielania z impulsem laserowym 20-40 μs (1-2 iteracje), ale wartości te mogą ulec zmianie w zależności od analizowanego białka i poziomów ekspresji. Gdy fotowybielanie przebiega prawidłowo, powinieneś zaobserwować „czarną dziurę” w fluorescencji GFP. Czarna dziura jest stopniowo wypełniana fluorescencją w miarę następującego powrotu. Chociaż dysk rotujący może uzyskać do około 60 obrazów na sekundę (przy dobrej intensywności fluorescencji i powiększeniu pojedynczej komórki), nie zalecamy korzystania z systemu przy tak dużych prędkościach ze względu na niską jakość obrazu i potencjalny wzrost fototoksyczności.
- W przypadku eksperymentu FLIP ustaw inny protokół obrazowania: zarejestruj 3-5 klatek przed wybielaniem, a następnie rozpocznij powtarzalne wybielanie w tym samym punkcie, jednocześnie zbierając obrazy. Dla H1e-GFP wybielaj co 5 s, dla H1o-GFP wybielaj co 2 s, a dla HP1-GFP wybielaj co 1 s. Powtarzaj wybielanie i zbieranie obrazów przez cały czas trwania eksperymentu.
- W obu technikach powtórz proces na 20-30 komórkach. Do celów statystycznych powtórz eksperyment 3 razy lub więcej, najlepiej w różne dni. W homogenicznych populacjach i przy prawidłowych ustawieniach odchylenie standardowe jest zazwyczaj niskie (< 5%).
Zarówno w przypadku FRAP, jak i FLIP, wielkość i kształt wybielonego obszaru wpływają na dynamikę powrotu i muszą pozostać stałe w ramach jednego eksperymentu. Ponadto, przy porównywaniu dwóch komórek, należy stosować identyczne protokoły, a komórki muszą być analizowane sekwencyjnie tego samego dnia, ponieważ moc lasera i inne warunki mogą ulegać wahaniom, co może wpłynąć na wynik eksperymentu.
4. Analiza danych FRAP i FLIP
- W każdej zebranej klatce FRAP należy zmierzyć intensywność fluorescencji w obszarze zainteresowania (ROIb = obszar wybielony), obszarze tła (ROIbg) oraz niewybielonym obszarze jądra (ROInb) jako funkcję czasu przed i po wybielaniu. W przypadku, gdy obszar wybielony jest pomijalny, do celów normalizacji można wybrać całe jądro.
- Dla każdego punktu czasowego należy znormalizować dane zgodnie ze wzorem: (ROIb - ROIbg)/(ROInb - ROIbg) / (pbROIb - pbROIbg)/(pbROInb - pbROIbg), gdzie pb oznacza stan przed wybieleniem (pre-bleach). Dla obrazów przed wybieleniem powinna zostać otrzymana wartość około 1. Pierwszy obraz po wybieleniu wskaże głębokość wybielenia (Bleach Depth). Aby uzyskać rzeczywistą wartość głębokości wybielenia, należy odjąć tę wartość od 1. Procedurę należy powtórzyć dla każdej komórki i wyciągnąć średnią z 20-30 komórek z każdego eksperymentu.
- W każdej zebranej klatce FLIP należy zmierzyć intensywność fluorescencji w niewybielonym obszarze jądra oraz w obszarze tła (ROInb = obszar niewybielony,
ROIbg = tło). Obliczanie danych FLIP jest analogiczne do krzywej FRAP, z tą różnicą, że analizowany ROI (ROInb) musi być inny niż rzeczywisty obszar wybielony, który nie jest wykorzystywany do obliczeń: (ROInb - ROIbg)/(pbROInb - pbROIbg). Można również wykorzystać sąsiednią komórkę (ROIn = komórka sąsiednia) do celów normalizacji: (ROInb - ROIbg)/(ROIn - ROIbg) / (pbROInb - pbROIbg)/(pbROIn - pbROIbg).
Po zebraniu danych możliwe jest dopasowanie danych eksperymentalnych do symulacji komputerowej. Pozwala to na obliczenie z dużą dokładnością frakcji mobilnej, frakcji immobilnej oraz czasu połowicznego maksymalnego powrotu. Nie będziemy tutaj omawiać matematycznych i statystycznych aspektów analiz FRAP i odsyłamy czytelnika do innych znakomitych publikacji4-9. Głębokość wybielenia odnosi się do odległości (na osi y) między sygnałem przed wybieleniem (100%) a pierwszym obrazem po wybieleniu; frakcja mobilna odnosi się do odległości (na osi y) między głębokością wybielenia a sygnałem odzyskanym w momencie, gdy kinetyka osiąga plateau, a frakcja immobilna odnosi się do odległości (na osi y) między sygnałem odzyskanym a sygnałem przed wybieleniem (100%) (patrz rysunki 1B i 2B). Poza tą analizą istnieją dobre modele matematyczne do dopasowania danych. W przypadku pojedynczego wykładnika, do dopasowania danych można użyć równania
gdzie t to czas, A to frakcja mobilna, 1-A to frakcja immobilna, a koff to stała dysocjacji; pozwala to na uzyskanie bezpośredniej oceny szybkości dysocjacji wiązania (koff), jak również parametru A, który może być wykorzystany do obliczenia szybkości asocjacji.
5. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. A i B przedstawiają reprezentatywne krzywe FRAP dla HP1 (lewo), H1o (środek) i H1e (prawo) w komórkach R1 ES. Dla uproszczenia i przejrzystości rycina 1A pokazuje surowe dane z pojedynczej komórki przed normalizacją i obliczeniami. Żółta krzywa odpowiada obszarowi wybielonemu, fioletowa krzywa odpowiada niewybielonemu obszarowi jądra (gdy obszar wybielony jest pomijalny, do celów normalizacji można wybrać całe jądro), a czerwona linia odpowiada fluorescencji tła, która w tym przypadku jest minimalna. Pionowa strzałka oznacza czas wybielania. Znormalizowane i uśrednione dane przedstawiono na rycinie 1B. Należy zwrócić uwagę na wolniejszy powrót H1 (niebieski) w porównaniu z HP1 (czerwony). Również wariant H1e (ciemnoniebieski) wykazuje wolniejszy powrót niż wariant H1o (jasnoniebieski). Dla HP1 wskazano frakcje ruchome i nieruchome oraz głębokość wybielenia (Bleach Depth).
Rycina 2. A i B przedstawiają reprezentatywne krzywe FRAP porównujące euchromatynę (lewo) z heterochromatyną (prawo) dla HP1 w komórkach ES R1. Podobnie jak na Rycini 1, Rycina 2A pokazuje surowe dane z pojedynczej komórki, gdzie żółta krzywa odpowiada obszarowi wybielonemu, fioletowa krzywa obszarowi jądra niewybielonemu, a czerwona linia fluorescencji tła. Pionowa strzałka oznacza moment wybielenia. Znormalizowane i uśrednione dane przedstawiono na Rycini 2B. Należy zwrócić uwagę na wolniejszy powrót fluorescencji w heterochromatynie (ciemnoczerwony) w porównaniu do euchromatyny (jasnoczerwony). Dla euchromatyny zaznaczono frakcje mobilne i niemobilne oraz głębokość wybielenia (Bleach Depth).
Rycina 3.. Typowy eksperyment FLIP dla komórek H1o R1 ES przedstawiono na Rycini 3A (surowe dane, nieunormowane) oraz B (dane unormowane i uśrednione). W tym eksperymencie krzywa fioletowa odpowiada niewyblakłemu obszarowi jądra komórkowego, linia zielona odpowiada sąsiedniemu jądru komórkowemu, a linia czerwona odpowiada fluorescencji tła.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przeciwieństwie do większości dostępnych technik, które wykorzystują oczyszczoną chromatynę z populacji komórkowych lub utrwalone komórki, eksperymenty FRAP pozwalają śledzić zmiany w dynamice białek chromatyny w żywych komórkach. Stwierdziliśmy, że dynamika białek chromatyny jest dobrym wskaźnikiem plastyczności chromatyny. Jednak ze względu na konieczność połączenia badanego genu z GFP, dodanie znacznika fluorescencyjnego może zakłócać funkcję białka. Dlatego przed przystąpieniem do FRAP białko fuzyjne musi zostać ry...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratorium Meshorera, w szczególności Shai Melcerowi, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ramowi, Badi Sri Sailaja, Annie Mattout i Alva Biranie, za krytyczne uwagi oraz za codzienną pomoc w rozwiązywaniu problemów podczas eksperymentów z fotoblaknięciem. EM jest starszym wykładowcą nauk o życiu (Joseph H. and Belle R. Braun Senior Lecturer in Life Sciences) i otrzymuje wsparcie z Israel Science Foundation (ISF 943/09), izraelskiego Ministerstwa Zdrowia (6007), Unii Europejskiej (IRG-206872 oraz 238176), Israel Cancer Research Foundation, wewnętrznych grantów medycyny aplikacyjnej Uniwersytetu Hebrajskiego oraz Israel Psychobiology Institute.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Żelatyna | Merck & Co., Inc. | 1.04078 | |
| Opti-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31985 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Slajdy μ-Slides 8-dołkowe | ibidi | 80826 |
Bibliografia
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E. Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. Girard, L. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge. (2008).
- Meshorer, E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , Cold Spring Harbor Press. (2009).
- Dundr, M., Misteli, T. Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).
- Ellenberg, J. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).
- Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus. Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).
- Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know. Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).
- Poser, I. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Sigal, A. Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells. Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).
- Cohen, A. A. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug. Science. 322, 1511-1516 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
