Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) oraz utraty fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP) umożliwiają badanie dynamiki białek w żywych komórkach z dobrą rozdzielczością przestrzenną i czasową. W niniejszym materiale opisujemy, jak przeprowadzać testy FRAP i FLIP dla białek chromatyny, w tym H1 i HP1, w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ES). W eksperymencie FRAP komórki są transfekowane, przejściowo lub stabilnie, białkiem docelowym połączonym z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub jego pochodnymi (YFP, CFP, Cherry itp.). W transfekowanych, fluorescencyjnych komórkach intensywna, skupiona wiązka lasera wybiela stosunkowo niewielki obszar zainteresowania (ROI). Długość fali lasera jest dobierana zgodnie z białkiem fluorescencyjnym użytym do fuzji. Światło lasera nieodwracalnie wybiela sygnał fluorescencyjny cząsteczek w ROI, a bezpośrednio po wybielaniu, za pomocą obrazowania poklatkowego, monitoruje się odzyskiwanie sygnału fluorescencyjnego w wybielonym obszarze – zapośredniczone przez zastępowanie wybielonych cząsteczek cząsteczkami niewybielonymi. Wygenerowane krzywe odzyskiwania fluorescencji dostarczają informacji o mobilności białka. Jeśli cząsteczki fluorescencyjne są nieruchome, nie zostanie zaobserwowane odzyskiwanie fluorescencji. W podejściu komplementarnym, utracie fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP), wiązka lasera wielokrotnie wybiela ten sam punkt, a intensywność sygnału jest mierzona w innym miejscu fluorescencyjnej komórki. Eksperymenty FLIP mierzą zatem zanik sygnału, a nie odzyskiwanie fluorescencji i są przydatne do określania mobilności białek, a także ich przemieszczania się między przedziałami komórkowymi. Przejściowe wiązanie jest powszechną cechą białek związanych z chromatyną. Chociaż w każdym danym momencie w stanie stacjonarnym główna frakcja każdego białka chromatynowego jest związana z chromatyną, wiązanie to jest przejściowe i większość białek chromatynowych charakteryzuje się wysokim obrotem na chromatynie, z czasem przebywania rzędu sekund. Właściwości te są kluczowe dla generowania wysokiej plastyczności ekspresji genomu1. Eksperymenty z fotowybielaniem są zatem szczególnie użyteczne do określania plastyczności chromatyny przy użyciu wersji białek strukturalnych chromatyny z fuzją GFP, zwłaszcza w komórkach ES, gdzie dynamiczna wymiana białek chromatyny (w tym białka heterochromatyny 1 (HP1), histonu łącznikowego H1 i histonów rdzeniowych) jest wyższa niż w komórkach zróżnicowanych2,3.
Protokół
1. Wysiewanie komórek ES
T = 0 h
Wysiew MEF
- Pokryć 8-dołkowe μ-slajdy do obrazowania na żywo (ibidi; Monachium, Niemcy) żelatyną, lub użyć szkiełek nakrywkowych z komorami (Lab-Tek; Rochester, NY) lub szalek hodowlanych z szklanym dnem (MatTek; Ashland, MA). Pozostawić na 5-30 min, a następnie odessać nadmiar żelatyny.
- Zasiać 22 000 MEFs/dołek w całkowitej objętości 250 μl DMEM [uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)]. Pozostawić komórki do wzrostu w inkubatorze do hodowli tkankowych (37°C, 5% CO2).
T = 6 h
Wysiewanie komórek ES
- Odssać ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przeciwieństwie do większości dostępnych technik, które wykorzystują oczyszczoną chromatynę z populacji komórkowych lub utrwalone komórki, eksperymenty FRAP pozwalają śledzić zmiany w dynamice białek chromatyny w żywych komórkach. Stwierdziliśmy, że dynamika białek chromatyny jest dobrym wskaźnikiem plastyczności chromatyny. Jednak ze względu na konieczność połączenia badanego genu z GFP, dodanie znacznika fluorescencyjnego może zakłócać funkcję białka. Dlatego przed przystąpieniem do FRAP białko fuzyjne musi zostać ry.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratorium Meshorera, w szczególności Shai Melcerowi, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ramowi, Badi Sri Sailaja, Annie Mattout i Alva Biranie, za krytyczne uwagi oraz za codzienną pomoc w rozwiązywaniu problemów podczas eksperymentów z fotoblaknięciem. EM jest starszym wykładowcą nauk o życiu (Joseph H. and Belle R. Braun Senior Lecturer in Life Sciences) i otrzymuje wsparcie z Israel Science Foundation (ISF 943/09), izraelskiego Ministerstwa Zdrowia (6007), Unii Europejskiej (IRG-206872 oraz 238176), Israel Cancer Research Foundation, wewnętrznych grantów medycyny aplikacyjnej Uniwersytetu Hebrajskiego oraz Israel Psychobiology Institute.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Żelatyna | Merck & Co., Inc. | 1.04078 | |
| Opti-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31985 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Slajdy μ-Slides 8-dołkowe | ibidi | 80826 |
Bibliografia
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
