Ilościowe określanie stanu zapalnego komórek w uszkodzonym lub patologicznie zmienionym OUN za pomocą cytometrii przepływowej jest utrudnione przez obecność resztek lipidowych i mielinowych, które mogą mieć rozmiar i ziarnistość zbliżoną do komórek, co obniża czułość i dokładność pomiarów. Opracowaliśmy metodę przygotowania komórek w celu usunięcia resztek mieliny i poprawy detekcji komórek za pomocą cytometrii przepływowej w uszkodzonym rdzeniu kręgowym.
Artykuł metodologiczny
Ilościowa ocena komórek odpornościowych w uszkodzonej tkance rdzenia kręgowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej: nowe zastosowanie metody oczyszczania komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykrywanie komórek odpornościowych w uszkodzonym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) przy użyciu technik morfologicznych lub histologicznych nie zawsze zapewniało rzetelną analizę ilościową stanu zapalnego w obrębie komórek. Cytometria przepływowa stanowi szybką alternatywną metodę ilościowego oznaczania komórek odpornościowych w uszkodzonej tkance mózgu lub rdzenia kręgowego. Historycznie cytometrię przepływową wykorzystywano do ilościowego oznaczania komórek odpornościowych pobranych z krwi lub dysocjowanej śledziony lub grasicy, a jedynie w kilku badaniach próbowano ilościowo oznaczyć komórki odpornościowe w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem świeżej dysocjowanej tkanki rdzenia. Jednakże dysocjowana tkanka rdzenia kręgowego jest nasycona szczątkami mieliny, które mogą zostać pomylone z komórkami i obniżyć wiarygodność liczby komórek uzyskanej za pomocą cytometru przepływowego. Opracowaliśmy metodę przygotowania komórek z wykorzystaniem systemu gradientowego OptiPrep w celu skutecznego oddzielenia szczątków lipidowych/mielinowych od komórek, co zapewnia czułe i niezawodne ilościowe oznaczenie stanu zapalnego w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej. Jak opisano w naszym niedawnym badaniu (Beck & Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), przygotowanie komórek metodą OptiPrep zwiększyło czułość wykrywania stanu zapalnego w uszkodzonym rdzeniu kręgowym, a liczba konkretnych typów komórek korelowała ze stopniem uszkodzenia. Co kluczowe, nowatorskie zastosowanie tej metody pozwoliło na pierwszą charakterystykę ostrego i przewlekłego stanu zapalnego komórkowego po SCI, obejmującą pełny przebieg czasowy dla leukocytów wielojądrowych (PMNs, neutrofili), makrofagów/mikrogleju oraz limfocytów T w okresie od 2 godzin do 180 dni po urazie (dpi), identyfikując zaskakującą, nową drugą fazę stanu zapalnego komórkowego. Dokładna charakterystyka stanu zapalnego komórkowego z zastosowaniem tej metody może zapewnić lepsze zrozumienie neuroinflamacji w uszkodzonym OUN i ujawnić istotny wielofazowy komponent neuroinflamacji, który może być kluczowy dla projektowania i wdrażania racjonalnych strategii terapeutycznych, w tym interwencji komórkowych i farmakologicznych w przypadku SCI.
Protokół
1. Dysocjacja tkanki rdzenia kręgowego
- Segmenty rdzenia kręgowego T8-T10 u nieuszkodzonych lub z kontuzyjnym urazem rdzenia (uraz na poziomie T9) szczurów Sprague Dawley wypreparowano i poddano dysocjacji mechanicznej za pomocą precyzyjnych nożyczek w roztworze HBSS w temperaturze pokojowej, zgodnie z wcześniejszym opisem 1. Przed dysocjacją tkanki całe kolumny rdzenia kręgowego przechowywano na suchym lodzie przez 5 minut przed wycięciem segmentów T8-T10.
- Fragmenty tkanki odzyskano poprzez wirowanie (1 minuta, 1000 rpm, temperatura pokojowa), a następnie poddano dysocjacji enzymatycznej z użyciem 2,5 mg trypsyny i 5 mg kolagenazy w 5 ml DME (Dulbecco’s Modified Eagle’s Media) przez 20 minut w temperaturze 37°C przed tryturacją (ok. 10 razy w temperaturze pokojowej) za pomocą szklanej pipety Pasteura (9 cali).
- Do komórek dodano 10 ml DME + 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zahamowania aktywności enzymatycznej, a następnie przefiltrowano zawiesinę przez sito komórkowe o oczkach 40 μm. Po krótkim wirowaniu osad komórkowy resuspendowano w 6 ml HBSS i naniesiono na gradienty OptiPrep opisane poniżej.
2. Przygotowanie roztworów gradientowych OptiPrep
- Rozcieńczony OptiPrep przygotowano poprzez rozcieńczenie OptiPrep w stosunku 1:1 buforem MOPS (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4).
- Cztery roztwory gradientu OptiPrep przygotowano, mieszając 350, 250, 200 lub 150 μl rozcieńczonego OptiPrep z HBSS do końcowej objętości 1 ml (Tabela 1).
- Cztery roztwory nakładano powoli i ostrożnie warstwami do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, zaczynając od najmniej rozcieńczonego na spodzie i najbardziej rozcieńczonego na górze (Rycina 1A).
3. Oddzielanie resztek lipidowych/mielinowych od komórek
- 6 ml zdysocjowanych komórek rdzenia kręgowego w HBSS ostrożnie nałożono na roztwory gradientu OptiPrep.
- Probówkę zawierającą komórki i roztwory gradientu odwirowano (15 minut, 1900 rpm lub 726 RCF, 20 °C) w wirówce Eppendorf Centrifuge 5810R z rotorem z koszyczkami (A-4-62), co pozwoliło na rozdzielenie zawiesiny komórkowej na wyraźne warstwy: szczątki lipidowe/mielinowe (górne 7 ml probówki), następnie 3 warstwy neuronów, z komórkami zapalnymi, glejem i erytrocytami w osadzie. Choć większość komórek zapalnych, w tym monocyty, makrofagi, granulocyty PMN i limfocyty, znajdowała się w osadzie, niektóre duże, aktywowane makrofagi mogły występować w warstwach powyżej osadu.
- Warstwę szczątków lipidowych/mielinowych (górne 7 ml) ostrożnie odessano i usunięto. Następnie komórki przemyto i resuspendowano w 2,5 ml HBSS i wykorzystano do poniższego immunoznakowania.
4. Immunoznakowanie specyficznych komórek odpornościowych do cytometrii przepływowej
- Komórki (500 μl) pobrane z preparatów rdzenia kręgowego odwirowano i zawieszono w 0,85% chlorku amonu (rozcieńczonym w wodzie destylowanej) na 5 minut w celu lizy erytrocytów.
- Komórki przemyto 500 μl HBSS, a następnie blokowano przez 30 minut w normalnym surowicy królika lub myszy w temperaturze pokojowej.
- Komórki przemyto i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z przeciwciałem (Rabbit anti-PMN FITC, Accurate Chemical and Scientific; Mouse anti-rat ED1 Alexa 488, Serotec; lub Mouse anti-rat CD3 Alexa 488) lub roztworem izotypowego IgG rozcieńczonym w HBSS (wszystkie w rozcieńczeniu 1:100), zgodnie z wcześniejszym opisem 1.
- Po każdym z powyższych etapów komórki przemyto dwukrotnie, a po ostatnim etapie zawieszono w 300 μl HBSS.
5. Ilościowa ocena komórek metodą cytometrii przepływowej
- Próbki analizowano na cytometrze przepływowym FACS Calibur (Becton-Dickinson) przy użyciu oprogramowania Cell Quest. Dla wszystkich próbek odczytano 5 000 zdarzeń na próbkę, a analizę danych przeprowadzono w programie Summit (DakoCytomation).
- Bramki cytometryczne ustawiono przy użyciu komórek znakowanych izotypem IgG kontrolnym lub komórek rdzenia kręgowego od nieuszkodzonych zwierząt kontrolnych, aby określić wartości bazowe dla normalizacji w różnych punktach czasowych, zgodnie z wcześniejszym opisem 1. Średnie wartości dodatnio znakowanych komórek wyrażono jako procent (± S.E.M.) całej próbki.
6. Reprezentatywne wyniki:
Zdolność gradientu OptiPrep do usuwania resztek mieliny i poprawy detekcji komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej została oceniona poprzez ilościowe oznaczenie PMN w rdzeniu kręgowym w 1. dobie po urazie (Rycina 1B), co zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami stanowi szczyt infiltracji PMN po SCI 1-3. Alternatywnie, identycznie wypreparowane rdzenie kręgowe poddano dysocjacji enzymatycznej bez usuwania resztek mieliny za pomocą OptiPrep, a następnie w sposób analogiczny oceniono równolegle infiltrację PMN metodą cytometrii przepływowej. Jak zgłosiliśmy wcześniej 1, w próbkach izolowanych z zastosowaniem metody oczyszczania gradientem OptiPrep zaobserwowano przesunięcie pozycji zdarzeń w porównaniu do samej dysocjacji enzymatycznej; wykazało to, że odsetek PMN wykrytych w próbkach z nienaruszoną mieliną stanowił jedynie ułamek (0,5%) odsetka PMN wykrytych (5,1%) w próbkach oczyszczonych za pomocą OptiPrep (Rycina 1B). Dane te sugerują, że resztki mieliny w preparatach tkankowych mogą zafałszowywać odczyty cytometrii przepływowej i dowodzą, że usunięcie resztek mieliny zwiększa czułość detekcji komórek odpornościowych w uszkodzonej tkance rdzenia kręgowego.
Po potwierdzeniu czułości systemu gradientowego OptiPrep w wykrywaniu komórek w uszkodzonym rdzeniu kręgowym, scharakteryzowaliśmy zmiany w infiltracji komórkowej w okresie od 2 godzin do 180 dpi oraz wykazaliśmy nową, wielofazową odpowiedź zapalną komórek po SCI, obejmującą PMN, makrofagi/mikroglej oraz limfocyty T. Jak potwierdziły wcześniejsze badania 1-3, PMN najpierw przeniknęły do rdzenia w 2 godzinie po urazie, a ich liczba osiągnęła szczyt w 1 dpi (Rysunek 2 i 4). Z kolei makrofagi/mikroglej 1,4,5 nie były wykrywane w uszkodzonym rdzeniu kręgowym aż do 3 dpi, a ich pierwsza fala szczytowa wystąpiła w 7 dpi (Rysunek 3 i 4). Co zaskakujące, po raz pierwszy wykazujemy, że liczba makrofagów/mikrogleju osiągnęła drugi szczyt w 60 dpi i pozostawała podwyższona aż do 180 dpi (Rysunek 3 i 4). Podobnie jak w przypadku makrofagów/mikrogleju, przewidywano, że infiltracja limfocytów T osiągnie szczyt w 7 dpi 5-7; jednak cytometria przepływowa nie wykazała żadnych zmian w liczbie limfocytów T w ciągu pierwszych 7 dpi, choć podwyższoną liczbę tych komórek stwierdzono w 9 dpi (1,6%) (Rysunek 4). Podczas gdy liczba limfocytów T spadała do 10 dpi, obserwowano trwałą odpowiedź limfocytów T aż do 180 dpi, kiedy to 4,4% komórek było znakowanych dla CD3 (Rysunek 4).
Wspólnie dane te wykazują zależną od czasu wielofazową odpowiedź stanu zapalnego komórek po SCI (Rysunek 4); początkowe fazy zapalenia komórkowego obejmowały wczesny szczyt liczebności PMN w 1 dpi, po którym nastąpił szczyt makrofagów/mikrogleju ED1+ w 7 dpi oraz limfocytów T w 9 dpi, natomiast późniejsze fazy składały się ze wzrostu wszystkich trzech populacji komórkowych po 14 dpi, utrzymującego się do 180 dpi, z wyraźnym drugim szczytem makrofagów/mikrogleju w 60 dpi. To badanie przebiegu czasowego oraz ilościowe dane uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej zostały wcześniej zwalidowane, wykazując wyniki porównywalne z danymi zebranymi z ilościowej stereologii immunoznakowanych przekrojów rdzenia kręgowego 1.
Tabela 1. Przygotowanie gradientu OptiPrep do usuwania resztek mieliny. Cztery roztwory gradientu OptiPrep są przygotowywane z użyciem HBSS oraz rozcieńczonego OptiPrep (rozcieńczenie OptiPrep i MOPS w stosunku 1:1).
Rysunek 1. Gęstości gradientu OptiPrep oddzielają większość mieliny/zanieczyszczeń od tkanek i komórek uszkodzonego rdzenia kręgowego oraz poprawiają ocenę komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Mielina/zanieczyszczenia zostały oddzielone od komórek (neuronów, gleju i komórek odpornościowych) po wirowaniu zdysocjowanej tkanki rdzenia kręgowego w gradiencie OptiPrep, a następnie odessaniu warstwy mieliny/zanieczyszczeń. (B) Liczba PMN w uszkodzonym rdzeniu kręgowym, wykazująca zwiększoną czułość w wykrywaniu PMN po usunięciu zanieczyszczeń (test t Studenta, p = 0.0001). Wszystkie bramki cytometryczne zostały ustawione przy użyciu znakowanych komórek od nieuszkodzonych zwierząt; n=5 na grupę, średnia ± SEM. Dla wszystkich próbek odczytano 5,000 zdarzeń na próbkę, a średnie wartości dodatnio znakowanych komórek wyrażono jako procent (± S.E.M.) całej próbki.
Rycina 2. Wykrywanie nacieku PMN w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej. Po umiarkowanym urazie stłuczeniowym (200 kd) na poziomie T9, PMN szybko przenikały do rdzenia kręgowego, zaczynając od 2 h (B) po urazie, z osiągnięciem szczytu w 1 dpi (C). Wszystkie bramki cytometryczne zostały ustawione przy użyciu znakowanych komórek z nieuszkodzonych zwierząt (A).
Rycina 3. Wykrywanie infiltracji makrofagów/mikrogleju w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej. Po umiarkowanym urazie stłuczeniowym (200 kd) na poziomie T9, liczba makrofagów/mikrogleju ED1+ w uszkodzonym rdzeniu kręgowym wzrosła poczynając od 3 dpi (D), osiągnęła ostry szczyt w 7 dpi (E), spadła do niskich poziomów w 14 dpi (F), a następnie wzrosła do drugiego szczytu w 60 dpi (G) i utrzymywała się w uszkodzonym rdzeniu kręgowym do 180 dpi (H). Kontrola izotypowa IgG dla komórek rdzenia w 7 dpi (B) wykazała minimalne tło znakowania przeciwciałami i brak różnic w porównaniu do komórek znakowanych przeciwciałami z zwierząt 2 h po urazie (C) lub zwierząt nieuszkodzonych (A). Wszystkie bramki cytometryczne ustawiono przy użyciu znakowanych komórek od zwierząt nieuszkodzonych.
Tabela 2. Próbki zwierzęce w eksperymentach z przebiegiem czasowym. Dla każdego punktu czasowego (od 0 h do 180 dpi) pięć zwierząt otrzymało umiarkowany (200 kd) uraz stłuczeniowy na poziomie T9, a tkanki rdzenia kręgowego poddano analizie cytometrią przepływową w celu określenia liczby PMN, makrofagów/mikrogleju ED1+ oraz limfocytów T CD3+. Jednak nie wszystkie próbki zwierzęce zostały pomyślnie odzyskanymi do analiz cytometrycznych PMN (4-5), ED1 (3-5) i CD3 (4-5).
Rycina 4. Przebieg czasowy stanu zapalnego w rdzeniu kręgowym po umiarkowanym urazie stłuczeniowym (200 kd) na poziomie T9. Oceny wykonanej za pomocą cytometrii przepływowej wykazały, że liczba PMN, makrofagów/mikrogleju ED1+ oraz limfocytów T CD3+ osiągnęła szczyt w fazie ostrej (odpowiednio 1, 7 i 9 dpi) i utrzymywała się w fazie chronicznej w uszkodzonym rdzeniu kręgowym. n=3 do 5 na grupę, średnia ± SEM.
Dyskusja
Wykorzystanie cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek odpornościowych w OUN jest utrudnione przez zawartość lipidów/mieliny oraz obecność debris. Oprócz zakłócania wiązania i specyficzności przeciwciał, debris mielinowe może posiadać rozmiar i właściwości granulacji podobne do komórek odpornościowych, co obniża czułość i dokładność pomiarów 8. Opisana tutaj nowa metoda przygotowania komórek jest skuteczna w usuwaniu debris mielinowego, a tym samym zwiększa czułość cytometrii przepływowej w wykrywaniu zmian w zapaleniu komórkowym w uszkodzonym rdzeniu kręgowym. Na przykład usunięcie debris mielinowego za pomocą tej metody poprawiło wykrywanie komórek odpornościowych w porównaniu do samej dysocjacji enzymatycznej. Co kluczowe, nowatorskie zastosowanie tej metody pozwoliło na pierwszą charakterystykę ostrego i przewlekłego zapalenia komórkowego po SCI, obejmującą pełny przebieg czasowy dla PMN, makrofagów/mikrogleju oraz limfocytów T do 180 dpi, a także pozwoliło zidentyfikować nową, drugą fazę zapalenia komórkowego. Te istotne odkrycia dotyczące wielofazowego komponentu neurozapalenia mogą mieć krytyczne znaczenie dla projektowania i wdrażania racjonalnych strategii terapeutycznych, w tym interwencji komórkowych i farmakologicznych w SCI.
System gradientowy OptiPrep był wykorzystywany do oddzielania zanieczyszczeń od komórek we krwi 9 lub do oczyszczania neuronów z mózgu na potrzeby hodowli komórkowych 10; zmodyfikowaliśmy i udoskonaliliśmy jednak ten system w celu oddzielenia fragmentów mieliny od zdysocjowanych komórek rdzenia kręgowego, co umożliwiło szybką i dokładniejszą kwantyfikację stanu zapalnego komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta, w połączeniu z cytometrią przepływową, może przynieść znaczący postęp w badaniach nad zapaleniem po urazach OUN lub w stanach patologicznych, ponieważ większość badań charakteryzowała zapalenie komórkowe w OUN jedynie za pomocą technik morfologicznych i histologicznych, które nie są specyficzne dla typu komórek lub nie zawsze pozwalają na rzeczywistą ocenę ilościową. Ponadto w kilku niedawnych badaniach podjęto próby ilościowego oznaczenia komórek odpornościowych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej, wykorzystując świeżą zdysocjowaną tkankę rdzenia 11,12 lub komórki oddzielone za pomocą systemu gradientowego Percoll 13; badania te wykazały jednak albo niską wydajność uzyskiwania komórek, albo niską czułość detekcji komórek odpornościowych.
W przeciwieństwie do tego, metoda przygotowania komórek z wykorzystaniem gradientu OptiPrep umożliwiła po raz pierwszy czułą i wiarygodną ocenę ilościową za pomocą cytometrii przepływowej zmian w zapaleniu komórkowym w odpowiedzi na stopniowany stopień ciężkości urazu oraz w przedłużonym przebiegu czasowym do 180 dpi. Czułość i wiarygodność analizy cytometrycznej zależą również od specyficzności przeciwciał użytych do wykrywania konkretnych typów komórek odpornościowych, ponieważ cytometria przepływowa nie pozwala na wykorzystanie kryteriów morfologicznych do dalszego rozróżnienia typów komórek. Specyficzność przeciwciał dla PMN, makrofagów/mikrogleju lub limfocytów T została dokładnie przetestowana w cytometrii przepływowej dla PMN otrzewnowych i makrofagów pęcherzykowych w kulturze oraz komórek w uszkodzonej tkance rdzenia kręgowego 1,2. Wraz z systemem gradientowym OptiPrep, przeciwciała te wykorzystane w cytometrii przepływowej przyczyniły się do stworzenia czasowej i ilościowej analizy zapalenia komórkowego, co dostarczyło nowej wiedzy na temat dynamiki mikrośrodowiska SCI i pozwoliło po raz pierwszy zidentyfikować rozszerzoną, wielofazową odpowiedź zapalną komórek. Ta wielofazowa odpowiedź komórek po SCI może być istotna dla zbadania roli konkretnych typów komórek obecnych w określonych momentach po urazie lub dla opracowania interwencji terapeutycznych przeciwko konkretnym typom komórek, które mogą pogarszać obrażenia. Ponadto wyniki te mogą pomóc w opracowaniu odpowiedniego uzasadnienia dla optymalnych interwencji lekowych lub komórkowych w SCI.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Rebecca Nishi, M.S., oraz technikom z Christopher & Dana Reeve Foundation Animal Core Facility na UC Irvine za pomoc w przeprowadzaniu operacji na zwierzętach. Dziękujemy również Gabriella Funes, Usha Nekanti i Denisse Moreno za pomoc techniczną, przygotowanie rękopisu i nagrań wideo oraz animacje. Badania te były wspierane przez NINDS (RO1 NS43428-01 dla AJA), Paralysis Project of America (PPA-32574 dla HXN) oraz California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) w ramach Stem Cell Training Award T1-00008 dla HXN. KDB otrzymał wsparcie z programu szkoleniowego w zakresie neuronauki molekularnej i komórkowej na UC Irvine (T32 NS007444).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Królicze przeciwciało anty-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mysie przeciwciało anty-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mysie przeciwciało anty-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Kolagenaza | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Hyclone | SH30070.03 | |
| Surowica królicza | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Surowica mysia | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Sito do komórek | BD Biosciences | 352340 |
Bibliografia
- Beck, K. D. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. Brain. 133, 433-447 (2010).
- Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).
- Saville, L. R. A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment. J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).
- Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).
- Popovich, P. G. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).
- Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury. J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).
- Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury. J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).
- Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal. J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).
- Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 65, 84-87 (2005).
- Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media. Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).
- Tjoa, T. The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord. J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).
- Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
Przedruki i uprawnienia
