Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania restrykcji dietetycznej na sztywnym podłożu u C. elegans z wykorzystaniem zabitych bakterii.

Streszczenie

Wiadomo, że ograniczenie spożycia pokarmu bez doprowadzenia do niedożywienia lub zagłodzenia wydłuża długość życia i opóźnia wystąpienie wielu chorób związanych z wiekiem u szerokiego spektrum gatunków, w tym u ssaków. Powoduje ono również spadek masy ciała i płodności, a także obniżenie poziomu glukozy w osoczu, insuliny oraz IGF-1 u tych zwierząt. Zabieg ten jest często określany jako restrykcja dietetyczna (DR) lub restrykcja kaloryczna (CR). Nicień Caenorhabditis elegans stał się istotnym organizmem modelowym do badania biologii starzenia. Do modelowania DR wykorzystywano zarówno manipulacje środowiskowe, jak i genetyczne, które wykazały działanie wydłużające długość życia u C. elegans. Jednak wiele raportowanych badań nad DR u C. elegans przeprowadzano poprzez hodowlę zwierząt w pożywkach płynnych, podczas gdy większość badań genetycznych w dziedzinie starzenia prowadzono na standardowym stałym agarze w szalkach Petriego. W niniejszym protokole przedstawiamy metodę DR z wykorzystaniem standardowych szalek z agarem NGM z martwymi bakteriami.

Protokół

1. Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej do szacowania stężenia bakterii

W tej sekcji opisano metodę szacowania stężenia bakterii dla dowolnego szczepu bakterii (np. OP50, HT115), który będzie wykorzystywany jako źródło pożywienia w eksperymentach dotyczących restrykcji dietetycznej u C. elegans. Dla każdego użytego szczepu bakterii należy sporządzić oddzielną krzywą kalibracyjną.

1. Zaszczep pojedynczą kolonię bakterii E. coli OP50, pobraną ze świeżego posiewu na agarze LB, do 3 mL płynnej pożywki LB.
2. Umieść kulturę OP50 w wytrząsarce w temperaturze 37 °C i inkubuj bakterie przez noc.
3. Przygotuj seryjne rozcieńczenia dwukrotne zawiesiny bakteryjnej z kultury nocnej (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
4. Zmierz absorbancję (gęstość optyczną) każdego rozcieńczenia przy 600 nm za pomocą spektrofotometru w trzech powtórzeniach.
5. Dalszo rozcieńcz każdą zawiesinę bakteryjną milionkrotnie (dwukrotne rozcieńczenie 1000-krotne).
6. Rozsiej równomiernie 0,4 mL zawiesiny bakteryjnej z każdego rozcieńczenia na płytce z agarem LB o średnicy 100 mm.
7. Umieść płytki LB z OP50 w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 18-24 godziny.
8. Policz liczbę kolonii bakteryjnych, które wyrosły na każdej płytce. Liczbę kolonii wykorzystuje się do obliczenia cfu (jednostek tworzących kolonie) na mL dla każdej próbki.
9. Zależność między zmierzonymi wartościami OD₆₀₀ a stężeniem bakterii OP50 można ustalić, wykreślając OD₆₀₀ jako funkcję stężenia bakterii (cfu/mL) i przeprowadzając analizę regresji liniowej (Rycina 1).

Roztwory:

Pożywka Luria Broth (LB), 1 l:
10 g	Baktotryptona
5 g	Ekstrakt z drożdży
10 g	NaCl

Dopełnić wody dejonizowanej do 1L.
Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie stałych płytek z ograniczeniem kalorycznym (sDR)

W tej sekcji opisano przygotowanie szalek do zastosowania w eksperymentach nad restrykcją kaloryczną w warunkach podłoża stałego (sDR). Zazwyczaj przyjmuje się, że stężenie bakterii 1 x 10¹¹ cfu/mL odpowiada warunkom żywienia ad libitum, a 1 x 10⁸ cfu/mL jest optymalnym stężeniem dla warunków restrykcji kalorycznej (DR) w tej metodzie. Niemniej jednak, w celu ustalenia pełnej zależności od dawki dla sDR oraz wynikających z niej odpowiedzi, konieczne może być zastosowanie 4–6 różnych stężeń bakterii.

1. Zaszczep pojedynczą kolonię bakterii E. Coli OP50 w 3 mL płynnej pożywki LB.
2. Umieść kulturę OP50 w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i pozostaw bakterie do wzrostu na 6-8 godzin.
3. Przenieś kulturę OP50 do nowej kolby zawierającej 500 mL pożywki LB i ponownie umieść kulturę OP50 w inkubatorze z wytrząsaniem w 37 °C na noc.
4. Zmierz OD₆₀₀ kultury OP50, aby określić stężenie bakterii (stężenie oblicza się przy użyciu krzywej kalibracyjnej wygenerowanej w Części 1). W celu dokładnego pomiaru absorbancji może być konieczne wykonanie odpowiednich rozcieńczeń.
5. Z pelletuj bakterie OP50 poprzez wirowanie przy 1,500 g przez 20 minut.
6. Resuspenduj bakterie do stężenia 1 x 10¹² cfu/mL.
7. Przygotuj 10 mL kultury bakterii w sześciu różnych stężeniach: 1 x 10¹², 10¹¹, 10¹⁰, 10⁹, 10⁸, 10⁷ cfu/mL.
8. Pipetuj 0,2 mL kultury bakterii na środek utwardzonej płytki NGM o średnicy 60 mm. Unikaj dotykania powierzchni płytki końcówką pipety, ponieważ nacięcia na powierzchni umożliwiają nicieniom wgryzanie się w agar.
9. Umieść płytki w inkubatorze w 37 °C na 1 godzinę.
10. Nanieś 10 μL karbenicyliny o stężeniu 100 mg/mL oraz 10 μL kanamycyny o stężeniu 50 mg/mL na każdą płytkę, aby zahamować wzrost bakterii.
11. Przechowuj płytki z różnymi stężeniami bakterii zabitych antybiotykiem w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (do jednego miesiąca). Ważne jest, aby przygotować i przechować odpowiednią liczbę płytek na cały zaplanowany eksperyment z co najmniej 1-2 dniowym wyprzedzeniem. Preferowane jest używanie tej samej partii płytek przez cały okres trwania eksperymentów.
12. Aby zweryfikować żywotność bakterii, zeskrob część bakterii z płytek sDR i rozsiej je na pustej płytce NGM z karbenicyliną i kanamycyną. Umieść płytkę w inkubatorze w 37 °C na 6-8 godzin, a następnie sprawdź, czy wystąpił wzrost bakterii (nie powinien być obserwowany żaden wzrost bakterii).

Roztwory

Pożywka do hodowli nicieni (NGM), 1 L:
3 g	NaCl
2,5 g	Pepton Bacto
20 g	Agar

Autoklawować przez 40 minut i schłodzić do 65 °C, a następnie dodać:

1 mL	1 M MgSO44
1 ml	1 M CaCl22
1 ml	5 mg/mL cholesterolu
25 ml	1M fosforan potasu, pH 6,0

Natychmiast wlej płynne podłoże NGM do szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm w ilościach 10 mL na szalkę

3. Przygotowanie eksperymentów sDR

W większości badań związanych z sDR, takich jak analiza długości życia i profilowanie płodności, niezbędne jest przygotowanie populacji nicieni zsynchronizowanych pod względem wieku. W przypadku innych badań, aby zapoczątkować restrykcję dietetyczną, wystarczy przenieść nicienie z regularnej płytki OP50 na płytkę sDR. W tej sekcji, jako przykład, opisano protokół przygotowania analizy długości życia dla zwierząt poddanych sDR.

1. Za pomocą platynowego zgłębnika przeniieść 20-30 osobników dorosłych w okresie aktywności rozrodczej na kilka standardowych płytek NGM z bakteriami OP50. W zależności od liczby jaj wymaganych do eksperymentów, może być konieczne użycie większej liczby osobników dorosłych.
2. Pozostawić płytki w temperaturze 20°C na 4 godziny, aby umożliwić zniesienie jaj.
3. Usunąć osobniki dorosłe z płytek. Płytki należy sprawdzić wizualnie pod kątem obecności jaj.
4. Pozostawić płytki w temperaturze 20°C i pozwolić potomstwu rozwinąć się do stadium późnego L4/dorosłego dnia 1. W przypadku nicieni dzikiego typu N2 w temperaturze 20 °C trwa to zazwyczaj 3 dni.
5. Przenieść odpowiednią liczbę osobników dorosłych dnia 1 na płytki sDR, aby rozpocząć restrykcję dietetyczną.
6. W celu analizy długości życia przygotować łącznie 6-8 płytek z 10-20 nicieniami na płytkę dla każdego warunku sDR.
7. Oceniać żywotność każdego nicienia co 2 dni, aż do śmierci wszystkich osobników. Krytyczne jest przenoszenie nicieni na świeże płytki sDR co 12-48 godzin, aby uniknąć całkowitego braku pożywienia.

4. Reprezentatywne wyniki:

Na rysunku 1 przedstawiono wykres reprezentatywnej krzywej kalibracyjnej dla szacowania stężenia OP50 w odniesieniu do OD₆₀₀. Równanie uzyskane w drodze analizy regresji liniowej może być wykorzystane do wszystkich przyszłych obliczeń stężeń bakterii OP50. Na rysunku 2 przedstawiono przykład badania wpływu chronicznych zabiegów sDR na średnią długość życia różnych szczepów nicieni. Niebieska linia reprezentuje typową odpowiedź zależną od dawki nicieni typu dzikiego na sDR. Czerwona linia wskazuje, że efekt sDR na długość życia jest częściowo tłumiony przez drr-2 o.e., natomiast daf-16(mu86) nie ma wpływu na indukowane przez sDR wydłużenie życia. Szczegółowa metoda przeprowadzania analizy długości życia u C. elegans została opisana w poprzedniej literaturze ^1-3.

Rysunek 1. Reprezentatywny wynik krzywej kalibracyjnej do szacowania stężenia E. Coli OP50. Stężenie OP50 przedstawiono jako funkcję zmierzonych wartości OD₆₀₀. Słupki błędów = S.D. Nocna hodowla bakteryjna została rozcieńczona 1,5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x przed pomiarem absorbancji, a następnie dwukrotnie rozcieńczona 1000x przed pomiarem cfu.

Rycina 2. Reprezentatywny wynik C. elegans eksperyment dotyczący długości życia porównujący zwierzęta typu dzikiego N2 (niebieski) z dwoma różnymi mutantami (zielony i czerwony) w odpowiedzi na sDR (rycina z pracy Ching) i wsp. ⁴). Słupki błędów = S.E.M.

Dyskusja

Wiadomo, że restrykcje dietetyczne (DR) wydłużają czas życia i opóźniają wystąpienie wielu chorób związanych z wiekiem u szerokiego grona gatunków, w tym u ssaków ^5-7. Do modelowania DR u C. elegans wykorzystywano zarówno manipulacje środowiskowe, jak i genetyczne, w tym hodowlę nicieni w półzdefiniowanym medium ciekłym ^8,9, rozcieńczanie bakteryjnego źródła pokarmu w medium ciekłym ^10-12 oraz wykorzystanie mutantów behawioralnych, które żywią się wolniej ¹³. Jednak ge...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Karbenicylina	Duchefa Biochemie	C0109.25	Rozpuszczona w wodzie.
Kanamycyna	Roche Group	10106801001	Rozpuszczona w wodzie.
Bacto-pepton	BD Biosciences	DF0118072
Bacto-trypton	BD Biosciences	DF0123075
Bacto-ekstrakt drożdżowy	BD Biosciences	DF0127071
Agar	BD Biosciences	DF00145170
Sterylna probówka do hodowli	USA Scientific, Inc.	1485-0810
Spektrofotometr	Amersham	Gene Quant pro	Amersham jest obecnie częścią GE Healthcare.
Mikroskop stereoskopowy	Carl Zeiss, Inc.	Stemi 2000
Wirówka	Beckman Coulter Inc.	Accuspin FR