Ograniczenia dietetyczne oparte na stałych talerzach w Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania restrykcji diety opartej na stałym talerzu u C. elegans z zabitymi bakteriami.

Streszczenie

Zmniejszenie spożycia żywności bez niedożywienia lub głodu zwiększa długość życia i opóźnia pojawienie się różnych chorób związanych z wiekiem u wielu gatunków, w tym ssaków. Powoduje również spadek masy ciała i płodności, a także niższy poziom glukozy w osoczu, insuliny i IGF-1 u tych zwierząt. Leczenie to jest często określane jako ograniczenie dietetyczne (DR) lub ograniczenie kalorii (CR). Nicień Caenorhabditis elegans stał się ważnym organizmem modelowym do badania biologii starzenia się. Do modelowania DR wykorzystano zarówno manipulacje środowiskowe, jak i genetyczne, które wykazały, że wydłużają życie C. elegans. Jednak wiele z opisanych badań DR u C. elegans przeprowadzono poprzez rozmnażanie zwierząt w płynnych pożywkach, podczas gdy większość badań genetycznych w dziedzinie starzenia przeprowadzono na standardowym stałym agarze na płytkach Petriego. Tutaj przedstawiamy protokół DR z wykorzystaniem standardowej stałej płytki na bazie agaru NGM z zabitymi bakteriami.

Protokół

1. Ustalanie krzywej kalibracyjnej do szacowania stężeń bakterii

Ta sekcja opisuje metodę szacowania stężenia bakterii dla danego szczepu bakterii (np. OP50, HT115), który będzie używany jako źródło pożywienia do eksperymentów z ograniczeniami dietetycznymi u C. elegans. Dla każdego zastosowanego szczepu bakterii należy ustalić oddzielne krzywe kalibracyjne.

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię bakterii E. coli OP50 pobranych ze świeżej smugi bakterii na agarze LB w 3 ml płynnego bulionu LB.
2. Umieść kulturę OP50 w wytrząsarce o temperaturze 37 °C i pozwól bakteriom rosnąć przez noc.
3. Przygotować seryjne 2-krotne rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej z hodowli przez noc (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
4. Zmierzyć absorbancję (gęstość optyczną) każdego rozcieńczenia przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru w trzech egzemplarzach.
5. Dalej rozcieńczyć każdą zawiesinę bakteryjną 1 000 000 razy (1000-krotne rozcieńczenie dwukrotnie).
6. Rozprowadzić równomiernie 0,4 ml zawiesiny bakteryjnej z każdego rozcieńczenia na płytce agarowej LB o średnicy 100 mm.
7. Umieść płytki LB z OP50 w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 18-24 godziny.
8. Policz liczbę kolonii bakterii wyhodowanych na każdej płytce. Liczba kolonii służy do obliczania cfu (jednostki tworzącej kolonię) na ml dla każdej próbki.
9. Zależność między zmierzonymi wartościami OD₆₀₀ a stężeniami bakterii OP50 można ustalić, wykreślając OD₆₀₀ jako funkcję stężenia bakterii (jtk/ml) i przeprowadzając analizę regresji liniowej (rysunek 1).

Rozwiązania:

Bulion Luria (LB), 1L: 10 g Baktootrypton 5 gramów Ekstrakt drożdżowy 10 gramów Zawartość NaCl

Dodaj wodę dejonizowaną do 1L.
Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie płytek z ograniczeniami dietetycznymi (sDR) na solidnych talerzach

Ta sekcja opisuje przygotowanie płytek do użycia w eksperymentach z ograniczeniami dietetycznymi (sDR) opartymi na płytkach stałych. Zwykle za warunki żywienia ad libitum uważamy stężenie bakterii 1 x 10¹¹ jtk/ml i 1 x 10⁸ jtk/ml za optymalne warunki żywienia DR dla tej metody. Jednak 4-6 różnych stężeń bakterii może być potrzebnych do ustalenia pełnej zależności zależnej od dawki dla sDR i jego odpowiedzi.

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię bakterii E. Coli OP50 w 3 ml płynnego bulionu LB.
2. Umieść kulturę OP50 w wytrząsarce o temperaturze 37 °C i pozwól bakteriom rosnąć przez 6-8 godzin.
3. Przenieść kulturę OP50 do nowej kolby zawierającej 500 ml bulionu LB i umieścić kulturę OP50 z powrotem w wytrząsarce o temperaturze 37 °C na noc.
4. Zmierz OD₆₀₀ w kulturze OP50, aby określić stężenie bakterii (stężenie oblicza się przy użyciu krzywej kalibracyjnej wygenerowanej w części 1). Do dokładnego pomiaru absorbancji mogą być potrzebne odpowiednie rozcieńczenia.
5. Bakterie OP50 osadzać przez odwirowanie w ilości 1 500 g przez 20 minut.
6. Zawiesić bakterie do stężenia 1 x^{10 12} jtk/ml.
7. Przygotuj 10 ml kultury bakterii w sześciu różnych stężeniach: 1 x 10¹², 10¹¹, 10¹⁰,^{10 9}, 10⁸, 10⁷ jtk/ml.
8. Odpipetować 0,2 ml kultury bakterii do środka zestalonej płytki NGM o średnicy 60 mm. Unikaj dotykania powierzchni płytki końcówką pipety, ponieważ nacięcia na powierzchni umożliwiają robakom zakopanie się w płytkach agarowych.
9. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
10. Nałóż 10 μl 100 mg/ml karbenicyliny i 10 μl 50 mg/ml kanamycyny na każdą płytkę, aby zatrzymać rozwój bakterii.
11. Płytki z różnymi stężeniami bakterii zabitych przez antybiotyk należy przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości (do jednego miesiąca). Ważne jest, aby przygotować i przechowywać wystarczającą ilość płytek na cały planowany eksperyment z co najmniej 1-2 dniowym wyprzedzeniem. Preferowane jest użycie tej samej partii płytek do całych eksperymentów.
12. Aby zweryfikować żywotność bakterii, zeskrob niektóre bakterie z płytek sDR i rozprowadź je na pustej płytce NGM z karbenicyliną i kanamycyną. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 6-8 godzin, a następnie sprawdzić, czy bakterie się rozwijają (nie należy zaobserwować wzrostu bakterii).

Rozwiązania

Pożywka do hodowli nicieni (NGM), 1L: 3 g Zawartość NaCl 2,5 gr Bakto-pepton 20gr agar

Autoklaw przez 40 minut i ostudź do 65 °C, a następnie dodaj:

1 ml 1 M_MgSO4 1 ml 1 M CaCl₂ 1 ml 5 mg/ml cholesterolu 25 ml 1M fosforan potasu, pH 6,0

Natychmiast wlej płynny NGM na szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm w porcjach 10 ml

3. Ustawianie eksperymentów sDR

Dla większości badań związanych z sDR, takich jak analiza długości życia i profilowanie płodności, niezbędne jest przygotowanie populacji robaków zsynchronizowanej z wiekiem. W przypadku innych badań wystarczy przenieść robaki ze zwykłej płytki OP50 na płytkę sDR, aby zainicjować ograniczenie dietetyczne. W tej sekcji opisano protokół konfiguracji analizy długości życia zwierząt z sDR jako przykład.

1. Użyj platynowego zbieracza robaków, aby przenieść 20-30 aktywnych reprodukcyjnie dorosłych na kilka zwykłych płytek NGM z OP50. W zależności od liczby jaj wymaganych do eksperymentów, może być potrzebnych więcej dorosłych osobników.
2. Pozostaw talerze w temperaturze 20°C na 4 godziny, aby umożliwić złożenie jaj.
3. Usuń dorosłe osoby z talerza. Talerze powinny być sprawdzone wzrokowo pod kątem jaj.
4. Pozostaw płytki w temperaturze 20°C i pozwól potomstwu rozwinąć się do stadium dorosłego późnego L4/dzień 1. Zwykle trwa to 3 dni w przypadku dzikich typów robaków N2 w temperaturze 20 °C.
5. Przenieś odpowiednią liczbę dorosłych w dniu 1 na płytkę sDR, aby zainicjować ograniczenie dietetyczne.
6. Aby przeprowadzić analizę żywotności, ustaw łącznie 6-8 płytek po 10-20 robaków na płytkę dla każdego warunku sDR.
7. Oceniaj żywotność każdego robaka co 2 dni, aż wszystkie robaki umrą. Bardzo ważne jest, aby robaki były przenoszone na świeże płytki sDR co 12-48 godzin, aby uniknąć całkowitego pozbawienia pokarmu.

4. Reprezentatywne wyniki:

Na rysunku 1 pokazany jest wykres reprezentatywnej krzywej kalibracyjnej do oszacowania stężenia OP50 w stosunku do OD₆₀₀. Równanie wygenerowane przez analizę regresji liniowej może być wykorzystane do wszystkich przyszłych obliczeń stężeń bakterii OP50. Na rycinie 2 przedstawiono przykład oznaczania wpływu przewlekłego leczenia sDR na średnią długość życia różnych szczepów robaków. Niebieska linia reprezentuje normalną, zależną od dawki odpowiedź robaków typu dzikiego na sDR. Czerwona linia wskazuje, że efekt długości życia sDR jest częściowo tłumiony przez drr-2 o.e., podczas gdy daf-16 (mu86) nie ma wpływu na wydłużenie żywotności wywołane sDR. Szczegółowa metoda przeprowadzania analizy długości życia C. elegans została opisana w poprzedniej literaturze ^1-3.

Rysunek 1. Reprezentatywny wynik krzywej kalibracyjnej do oszacowania stężenia E. Coli OP50. Stężenie OP50 jest wykreślane jako funkcja zmierzonych wartości OD₆₀₀. Słupki błędów = S.D. Nocną hodowlę bakteryjną rozcieńczano 1,5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x przed pomiarem absorbancji, a następnie rozcieńczano 1000x dwukrotnie przed pomiarem jtk.

Rysunek 2. Reprezentatywny wynik eksperymentu dotyczącego długości życia C. elegans porównującego dzikie zwierzęta typu N2 (niebieskie) z dwoma różnymi mutantami (zielonym i czerwonym) w odpowiedzi na sDR (rysunek z Ching i wsp. ⁴). Słupki błędów = SEM

Dyskusja

Wiadomo, że ograniczenia dietetyczne (DR) wydłużają życie i opóźniają wystąpienie różnych chorób związanych z wiekiem u wielu gatunków, w tym ssaków ^5-7. Do modelowania DR u C. elegans wykorzystano zarówno manipulacje środowiskowe, jak i genetyczne, w tym hodowlę robaków w częściowo zdefiniowanym płynnym pożywce ^8,9, rozcieńczenie źródła pokarmu bakteryjnego w płynnym podłożu ^10-12 oraz użycie mutantów behawioralnych, które żerują w wolniejszym tempie ¹³. Jednak gene...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Carbenicillin	Duchefa Biochemie	C0109.25	Rozpuszczony w wodzie.
Kanamycyna	Roche Group	10106801001	rozpuszczona w wodzie.
Bacto-peptone	BD Biosciences	DF0118072
Bacto-tryptone	BD Biosciences	DF0123075
Ekstrakt z drożdży bakto-baktonowych	BD Biosciences	DF0127071
Agar	BD Biosciences	DF00145170
Sterylna probówka hodowlana	USA Scientific, Inc.	1485-0810
Spektrofotometr	Amersham	Gene Quant pro	Amersham jest teraz częścią GE Healthcare.
Mikroskop preparacyjny	Carl Zeiss, Inc.	Stemi 2000
Wirówka	Beckman Coulter Inc.	Accuspin FR