Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Prezentujemy metodę niechirurgicznego podawania materiałów testowych do płuc znieczulonych myszy poprzez tchawicę. Metoda ta umożliwia ekspozycję płuc na patogeny bakteryjne i wirusowe, cytokiny, przeciwciała, koraliki, związki chemiczne lub barwniki. Ponadto opisujemy proces pobierania i przygotowania płuc oraz drenujących je węzłów chłonnych (LDLNs) do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Komórki fagocytarne, takie jak makrofagi pęcherzykowe i dendrytyczne komórki płucne (LDCs), nieustannie pobierają antygeny z przestrzeni pęcherzykowych w płucach. LDCs w szczególności migrują do drenujących płuca węzłów chłonnych (LDLNs), gdzie prezentują wdychane antygeny limfocytom T, inicjując odpowiednią odpowiedź immunologiczną na różnorodne immunogeny^1,2. Aby zamodelować interakcje między płucami a antygenami przenoszonymi drogą powietrzną u myszy, antygeny można podawać donosowo^1,3,4, wewnątrztchzewicznie⁵ lub w formie aerozoli⁶. Podawanie każdą z tych dróg wymaga odmiennych umiejętności technicznych i wiąże się z ograniczeniami, które należy rozważyć przed zaplanowaniem eksperymentu. Na przykład ekspozycja donosowa i aerozolowa dostarcza antygeny zarówno do płuc, jak i do górnych dróg oddechowych. W konsekwencji antygeny mogą dostać się do tkanki limfatycznej związanej z jamą nosową (NALT)⁷, co potencjalnie komplikuje interpretację wyników. Ponadto połykanie, kichanie i częstotliwość oddychania myszy mogą również prowadzić do niespójności w podawanych dawkach. Chociaż zaangażowanie górnych dróg oddechowych może być preferowane w niektórych badaniach, może ono utrudnić eksperymenty skupiające się na zdarzeniach inicjowanych specyficznie w płucach. W takim przypadku preferowana jest droga wewnątrztchzewicza (i.t), ponieważ dostarcza ona materiałów testowych bezpośrednio do płuc i omija NALT. Wiele protokołów iniekcji i.t. obejmuje albo ślepą intubację tchawicy przez jamę ustną, albo chirurgiczne odsłonięcie tchawicy w celu uzyskania dostępu do płuc. W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą, powtarzalną i niesurgicalną metodę instylacji i.t. Otwór tchawicy jest wizualizowany za pomocą laryngoskopu, a następnie zgięta igła do zgłębnika jest wprowadzana bezpośrednio do tchawicy w celu podania inokulum. Opisujemy również procedury pobierania i przetwarzania LDLNs oraz płuc w celu analizy transportu antygenów za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Przed rozpoczęciem procesu należy przygotować i zgromadzić następujące elementy

1. W celu zbudowania drewnianej platformy do unieruchomienia myszy podczas procedury należy zapoznać się z obrazami na rysunku 1a) i 1b).
2. Mieszanina do trawienia węzłów chłonnych – HBSS + 1.25mg/ml kolagenazy typu IV lub 2.5 mg/ml kolagenazy D
3. Mieszanina do trawienia płuc – HBSS + 1 mg/ml kolagenazy
4. Rozcieńczyć kulki lateksowe (1:20) w PBS do wstrzyknięcia doprzewnow brzusznego w celu wizualizacji LDLN

Uwaga: LDLN są małe i trudne do zlokalizowania. Aby nauczyć się je znajdować, należy wstrzyknąć myszy do jamy otrzewnowej (i.p.) 200μl czerwonych fluorescencyjnych kulek lateksowych rozcieńczonych w stosunku 1:20. Jama otrzewnowa drenuje do tych LDLN⁸. Po 24 hpi należy odsłonić jamę klatki piersiowej myszy zgodnie z powyższym opisem. LDLN będą miały różowy kolor dzięki kuleczkom, które spłynęły z jamy otrzewnowej.

5. Bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC) - 0.15M NH₄Cl, 10mM KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA w 1L dH₂0. Dostosować pH do 7.2-7.4 i przechowywać w temperaturze pokojowej.
6. Sito do komórek 70μm lub 100μm
7. Roztwór stokowy 0.5M EDTA, pH = 8.0
8. HBSS bez CaCl₂ i MgCl₂
9. Nożyczki i pęseta tępa
10. Laryngoskop
11. Igła do gavage (rozmiar 22 G) wygięta pod kątem (Rycina 2)
12. Płyta styropianowa i szpilki do unieruchomienia myszy
13. Waga elektroniczna
14. Roztwór błękitu anilinowego - 10mg/ml w H₂O

Uwaga: Rozwiązanie to zostanie wykorzystane do zademonstrowania techniki wstrzykiwania domięśniowego (i.t.).

2. Przygotowanie i podanie środka znieczulającego dla myszy

1. Przygotować mieszaninę ksylazyny i ketaminy w sterylnym PBS w taki sposób, aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 2mg/ml i 10mg/ml.
2. Zważyć mysz na wadze elektronicznej.
3. Obliczyć dawkę wymaganą dla każdej myszy. Podawać ksylazynę (2-4 mg/kg) i ketaminę (70-80 mg/kg) masy ciała, stosując odpowiednią objętość przygotowanej mieszaniny, i wstrzyknąć dostrytonalnie. Każda linia myszy może wymagać optymalizacji znieczulenia. Myszy, które otrzymały zbyt dużą dawkę środka znieczulającego, mogą wykazywać obniżoną częstotliwość oddychania, co może być śmiertelne po wprowadzeniu inokulum do płuc.
4. Po 3-5 minutach obserwować mysz pod kątem działania środka znieczulającego. Sprawdzić następujące oznaki, aby potwierdzić pełne znieczulenie myszy:
   1. Częstotliwość oddychania powinna ulec spowolnieniu.
   2. Mysz nie powinna prostować kończyny przedniej podczas podnoszenia za kark.
   3. Nie powinna wystąpić żadna reakcja po stymulacji kończyn tylnych.
      Jeśli kryteria te nie zostaną spełnione, odczekać kilka minut i sprawdzić ponownie przed przejściem do następnego kroku.

3. Iniekcja dokanałowa (dotchawicza)

1. Przygotować inokulum w 50μl soli fizjologicznej. Napełnić strzykawkę 1ml wyposażoną w sterylną, zagiętą igłę do zgłębnika inokulum. Strzykawka powinna zawierać 100μl poduszkę powietrzną za inokulum, aby zapewnić wprowadzenie całej cieczy do płuca.
2. Umieścić mysz na skośnej drewnianej platformie, zawieszając ją za siekacze na drucie, a następnie delikatnie przymocować ją w tej pozycji za pomocą kawałka wstążki.
3. Włączyć laryngoskop lewą ręką (jeśli pracuje się prawą ręką) i chwycić pęsetę z tępymi końcami. Używając końcówki laryngoskopu i pęsety, delikatnie rozwarte usta.
4. Za pomocą pęsety wyciągnąć język i odsunąć go na bok. Przesunąć ostrze laryngoskopu w stronę tylnej części jamy ustnej. Delikatnie dociskać laryngoskop pod kątem 90°, aż do momentu zobaczenia otworu tchawicy. Przytrzymać laryngoskop w tej pozycji. Należy zachować ostrożność podczas wyciągania języka z pyszczka i robić to delikatnie, aby nie uszkodzić tkanek.
5. Drugą ręką chwycić strzykawkę 1ml z inokulum, wyposażoną w zagiętą igłę do zgłębnika, i wprowadzić igłę do tchawicy, aż zagięcie igły znajdzie się przy przednich siekaczach. Równomiernie nacisnąć tłok, aby podać inokulum. Inokulum nie powinno pienić się. Jak najszybciej wyciągnąć igłę z tchawicy. Myszy uduszą się i zginą, jeśli tchawica będzie zablokowana zbyt długo. Trzymać mysz w pozycji pionowej przez kilka sekund, aby umożliwić wchłonięcie inokulum do płuc.
6. Zdjąć mysz z platformy i umieścić ją w pobliżu lampy grzewczej. Nie pozostawiać myszy pod bezpośrednim wpływem ciepła przez dłuższy czas. Mysz powinna całkowicie się obudzić w ciągu 30 min po zabiegu (czas rekonwalescencji może się różnić w zależności od szczepu). Podczas tego czasu należy uważnie obserwować myszy i nie dopuścić do ich przegrzania lub wychłodzenia, ponieważ mogłoby to doprowadzić do niewydolności oddechowej i śmierci zwierząt.

4. Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych drenażowych płuc oraz płuc do cytometrii przepływowej

1. Uśmierć myszy wybraną metodą zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji. Może to zależeć od indywidualnych wyników pobierania organów. Przykładem odpowiedniej procedury eutanazji jest podanie śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu. Nie zaobserwowano negatywnego wpływu eutanazji za pomocą CO₂ na płuca.
2. Przytwierdź kończyny do deski sekcyjnej szpilkami. Nożyczkami wykonaj nacięcie wzdłuż środka strony brzusznej. Delikatnie odsun skórę, aby odsłonić mięśnie ściany klatki piersiowej.
3. Wykonaj nacięcia przez mięśnie ściany klatki piersiowej, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.
4. Uchwyć pęsetą czubek mostka i przebij przeponę. Przetnij przeponę wzdłuż klatek piersiowych.
5. Trzymając nożyczki równolegle do powierzchni deski sekcyjnej, przetnij jamę klatki piersiowej wzdłuż linii grzbietowo-brzusznej po obu stronach.
6. Lekko unieś klatkę piersiową. Po prawej stronie serca, tuż pod grasicą, zlokalizuj dwa węzły chłonne. Trzeci, nieco większy węzeł chłonny znajduje się pod małym naczyniem krwionośnym tętniczym, biegnącym prostopadle do tchawicy. Pobierz węzły chłonne do 1 ml mieszaniny do trawienia węzłów chłonnych.
7. Po pobraniu węzłów chłonnych przytrzymaj serce jedną pęsetą, a płuca chwyć drugą. Pobierz płuca do 3 ml lodowatego PBS w płytce 6-dołkowej.
8. Rozdziel płaty płuc, odessaj PBS i posiekaj płaty na małe kawałki za pomocą pęsety i nożyczek. Dodaj 3 ml mieszaniny do trawienia płuc. Podczas tego etapu trzymaj płytkę 6-dołkową na lodzie.
9. Inkubuj węzły chłonne przez 25-30 min, a płuca przez 30 min w temperaturze 37°C. Do każdej z mieszanin trawiennych dodaj EDTA do stężenia końcowego 10mM, aby zatrzymać reakcję, a następnie umieść na lodzie.
10. Używając strzykawki 3 ml, przeciągnij kawałki płuc przez igłę 18GA 3 razy. Rozetrzyj kawałki płuc oraz węzły chłonne przez sitka komórkowe 70-100μm, używając tłoka strzykawki 1 ml. Przepłucz sitka komórkowe 10 ml HBSS bez Ca²⁺ i Mg²⁺. Centryfuguj przy 500 x g przez 5 min.
11. Resuspenduj osad w 5 ml buforu do lizy RBC i inkubuj przez 3 min w temperaturze pokojowej. Dodaj 10 ml HBSS bez Ca²⁺ i Mg²⁺, aby przerwać lizę. Centryfuguj przy 500 x g przez 5 min. Doprowadź zawiesiny pojedynczych komórek płuc i LDLN do objętości odpowiednio 10 ml i 5 ml. Policz żywe komórki za pomocą hemacytometru metodą wykluczania błękitu trypanu. Komórki są teraz gotowe do barwienia przed cytometrią przepływową. Jeden płat płuca może być wystarczający do cytometrii przepływowej. Pozostałe płaty można wykorzystać do innych celów eksperymentalnych u tej samej myszy, np. do przygotowania homogenatów w celu oznaczenia cytokin lub do badań histologicznych.

5. Reprezentatywne wyniki:

Komórki dendrytyczne płuc (LDC) oraz makrofagi pęcherzykowe w płucach pobierają antygen z przestrzeni pęcherzykowych płuc bezpośrednio po iniekcji i.t. Rycina 3 przedstawia odsetek komórek CD11c+ (wyrażanych na LDC i makrofagach pęcherzykowych), które są dodatnie pod kątem fluorescencyjnie znakowanych przetrwalników Bacillus anthracis, 30 min po iniekcji i.t. W tym czasie ~15,9% komórek CD45+CD11c+ w zawiesinie pojedynczych komórek płuc zawierało przetrwalniki Bacillus anthracis (Rycina 3, dolne panele). W celu dalszej charakterystyki komórek CD11c+ w płucach należy odnieść się do pracy Kim i Braciale⁴. Fluorescencyjnie znakowane kuleczki są rutynowo stosowane do oceny transportu antygenów cząsteczkowych do LDLN⁹. Aby ocenić ten transport z płuc do LDLN, wstrzyknięto i.t. fluorescencyjne kuleczki lateksowe wraz z LPS, a następnie przeanalizowano LDLN w 24 hpi. Około 4% komórek CD11c^hi w LDLN zawierało fluorescencyjne kuleczki w 24 hpi (Rycina 4). Te reprezentatywne eksperymenty pokazują, że niniejszy protokół może być efektywnie wykorzystany do śledzenia komórek, które pobierają wdychane antygeny cząsteczkowe w płucach, a następnie transportują je do LDLN.

Rycina 1. Drewniana platforma do unieruchamiania myszy podczas wstrzykiwania do cisterny (i.t.). Drewniany blok został przycięty pod kątem i dopasowano do niego metalne pręty, widok z przodu rycina 1a) oraz widok z boku rycina 1b). Mały kawałek drutu owinięto wokół metalowego pręta, aby unieruchomić przednie siekacze myszy. Do platformy przymocowano kawałek wstążki, którą obwiązuje się mysz, aby utrzymać ją w miejscu podczas procedury.

Rycina 2. Igła do gavage do iniekcji i.t. Igła do gavage (po prawej) została zgięta pod kątem ˜135° (po lewej) do iniekcji i.t.

Rycina 3. Procent wszystkich komórek CD11c+ w płucach zawierających wstrzyknięte drogą i.t. GFP-ekspresyjne Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), 5h po ekspozycji. Myszy AJ poddano ekspozycji na 1x10⁸ przarodników GFP- Bacillus anthracis, a płuca przeanalizowano 5h po infekcji. Wykresy kropkowe przedstawiają procent komórek CD11c+ w płucach, które są dodatnie w kierunku Bacillus anthracis.

Rycina 4. Detekcja fluorescencyjnych kulek (żółto-zielonych) w węzłach chłonnych odtaczających płuca 24 godziny po wstrzyknięciu i.t. Myszy AJ otrzymały albo PBS (panel lewy), albo 5x10⁹ mikrosfer Fluoresbrite YG (0.5μm) z 10μg LPS (panel prawy) drogą i.t., a węzły chłonne odtaczające płuca (LDLNs) przeanalizowano 24hpi. Reprezentatywne wykresy kropkowe przedstawiają procent komórek CD11c^hi w LDLNs zawierających fluorescencyjne kulki w odniesieniu do pustego kanału.

Dyskusja

Wykorzystaliśmy niniejszy protokół do badania transportu przetrwalników Bacillus anthracis z płuc do LDLNs. W podobnych zastosowaniach liczbę cząstek dostarczanych do płuc należy starannie dobrać tak, aby wstrzyknięty materiał można było wykryć w LDLNs za pomocą cytometrii przepływowej. Metodę tę z powodzeniem stosowaliśmy również do adoptywnego transferu komórek oraz znakowania specyficznych populacji komórek płuc z użyciem przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Ponadto metoda ta jest rutynowo wykorzystywana...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sito do komórek 70μm	BD Biosciences
Błękit anilinowy	Fisher Scientific	A967-25
Igła do karmienia zwierząt	Popper & Sons, Inc.	7920
Kolagenaza	Sigma-Aldrich	C2139
Kolagenaza typu IV	Worthington Biochemical
Kolagenaza D	Roche Group	11088974103
DPBS	Invitrogen	14190
Mikrosfery Fluoresbrite YG (0,5μm)	Polysciences, Inc.	17152
HBSS bez chlorku wapnia i chlorku magnezu	Invitrogen	14170
Ketamina HCl (100mg/ml)	Hospira Inc.
Piórko laryngoskopu	PennCentury, Inc	Do modelu LS-1	Patrz www.penncentury.com
Lekki laryngoskop światłowodowy	Welch Allyn	80814
Czerwone kuleczki fluorescencyjne (0,5μm)	Invitrogen	F8812	Do iniekcji d.o.
Ksylazyna (100mg/ml)	Lloyd, Inc.