Wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Zasobniki konserwowanych szlaków sygnalizacji insulinowej występujące u muszki owocówki Drosophila melanogaster sprawiają, że organizm ten jest potencjalnym narzędziem do modelowania zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. W związku z tym kluczowe jest opracowanie testów fizjologicznych pozwalających na skuteczne pomiary ogólnoustrojowego działania insuliny w zakresie obwodowej utylizacji glukozy u dorosłych much.

Streszczenie

Między ssakami a muszką owocową istnieją konserwatywne mechanizmy wykrywania składników odżywczych, w których peptydy przypominające odpowiednio insulinę i glukagon u ssaków pełnią funkcję utrzymywania homeostazy glukozy podczas larwalnych stadiów rozwojowych ^1,2. Badania nad dorosłymi muchami, które są w przeważającej mierze postmitotyczne, wykazały zaburzenia homeostazy glukozy w wyniku genetycznej ablacji komórek produkujących peptydy insulinopodobne (IPCs) ³. Zatem dorosłe muszki owocowe stanowią obiecujący i odpowiedni model genetyczny dla zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. Aby dalej rozwijać system wykorzystujący muszkę owocową, należy opracować porównywalne testy fizjologiczne służące do pomiaru tolerancji glukozy i wrażliwości na insulinę, jakie stosuje się u ssaków. W tym celu opisaliśmy niedawno nową procedurę pomiaru odpowiedzi na doustną próbę obciążenia glukozą u dorosłej muchy i wykazaliśmy znaczenie dorosłych IPCs w utrzymaniu homeostazy glukozy ^4,5. W niniejszej pracy zmodyfikowaliśmy wcześniej opisaną procedurę wstrzykiwania insuliny ⁶ i połączyliśmy ją z nową metodą ekstrakcji hemolimfy w celu pomiaru obwodowej wrażliwości na insulinę u dorosłej muchy. Unikalną cechą naszego protokołu jest umożliwienie bezpośrednich pomiarów fizjologicznych zdolności dorosłej muchy do usuwania obwodowego obciążenia glukozą po wstrzyknięciu insuliny; metodologia ta pozwala na charakterystykę mutantów sygnalizacji insulinowej oraz potencjalnych interwencji wpływających na tolerancję glukozy i wrażliwość na insulinę u dorosłej muchy.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu insuliny

1. Przygotować świeży roztwór insuliny wołowej, rozpuszczając insulinę w PBS do uzyskania stężenia 0,01 mg/ml. Zarówno roztwór insuliny w PBS, jak i kontrolny roztwór PBS muszą być przechowywane w lodzie przez cały czas trwania procedury wstrzykiwania. Roztwory te należy przygotować z dodatkiem 0,5% (v/v) barwnika spożywczego FD&C Blue no. 1.

2. Przygotowanie igły i konfiguracja zestawu do iniekcji

1. Przygotować szklane igły kapilarne za pomocą wyciągacza mikropipet. Następujące ustawienia wyciągacza pozwalają na uzyskanie igieł o jakości wystarczającej do iniekcji: Heat, 345; Pull, 210; Velocity, 10; Time, 20 (10ms). Nowo wyciągnięte igły należy stępić, dociskając ich końcówkę do chusteczki Kimwipe. Proces ten usuwa wydłużoną końcówkę o wysokiej oporności i tworzy sztywniejszą końcówkę o większej średnicy otworu.
2. Umieścić stępione igły końcówkami do góry w probówce do mikrowirowania zawierającej roztwór insuliny/PBS lub sam PBS. W wyniku działania kapilarnego każda igła zostanie wypełniona od tyłu. Obserwować końcówkę igły pod stereomikroskopem, aby upewnić się, że nie ma na niej zanieczyszczeń ani pęcherzyków powietrza. Odrzucić wszystkie igły, które nie zostały wypełnione całkowicie.
3. Włożyć wypełnione igły do uchwytu igieł manualnego mikroinjektora i ustawić uchwyt za pomocą mikromanipulatora tak, aby końcówka igły była widoczna pod stereomikroskopem. Nadać nadciśnienie kolumnie cieczy w igle, obracając pokrętło mikrometryczne manualnego mikroinjektora przymocowane do tłoka strzykawki mikroinjektora.
4. Zweryfikować, czy zastosowano ciśnienie wystarczające do przemieszczenia cieczy, dotykając końcówki igły chusteczką Kimwipe i potwierdzając przepływ cieczy.
5. Po przygotowaniu igły do iniekcji przytwierdzić tabelę kalibracyjną do trzonu igły za pomocą przezroczystej taśmy i ustawić ostrość obrazu końcówki igły pod stereomikroskopem przy powiększeniu 20X.

3. Przygotowanie much

1. Do eksperymentów z iniekcją wykorzystuje się dziesięciodniowe samice much. Zbieraj muchy w ciągu 24 h od wyjścia z poczwarki. Znieczul muchy wilgotnym CO₂ na podkładce gazowej, oddziel samce, a samice umieść w probówkach zawierających dietę standardową lub testową. Utrzymuj samice na dietach eksperymentalnych przez 10 dni.
2. Dziesiątego dnia po wyjściu z poczwarki i rozdzieleniu na diety eksperymentalne, przenieś muchy z probówek z pożywką do probówek zawierających czop z 2% agaru o objętości 5 ml i poddaj je głodzeniu przez 12-16 h.
3. Przed iniekcją insuliny przenieś głodzone muchy do probówek zawierających filtry nasączone 10% glukozą na 1 godzinę.
4. Po podaniu glukozy krótko znieczul muchy wilgotnym CO₂, a następnie unieruchom je w niskiej temperaturze na lodzie.

4. Procedura wstrzykiwania

1. Delikatnie chwyć unieruchomioną zimnem muchę za pomocą precyzyjnej pęsety i przytrzymaj ją blisko końcówki igły, tak aby końcówka znajdowała się w sąsiedztwie przedniego regionu lewej strony klatki piersiowej muchy. Ustaw ostrość stereomikroskopu na końcówkę igły oraz klatkę piersiową muchy.
2. Delikatnie przesuń muchę w stronę końcówki igły, tak aby końcówka dotknęła centrum wypukłości lewego regionu prescutum klatki piersiowej muchy (Rys. 1). Po odpowiednim zorientowaniu i wyrównaniu muchy względem końcówki igły, kontynuuj napieranie muchy na igłę, aż zostanie ona wbita w środek prescutum.
3. W razie potrzeby przyłóż dodatnie ciśnienie, przesuwając tłok strzykawki za pomocą pokrętła mikromanipulatora mikroinjektora, aż do momentu wstrzyknięcia 0,1 μl płynu do muchy. Przepływ płynu do hemocelu muchy nada niebieski kolor lewej stronie przedniej części klatki piersiowej. Okazyjnie należy kilkakrotnie wycofać i ponownie przesunąć igłę, aby usunąć ewentualne zatory w końcówce i umożliwić przepływ płynu.
4. Pozostaw wstrzyknięte muchy do regeneracji w fiolkach z 2% agarem przez wyznaczone okresy czasu przed ekstrakcją hemolimfy.

5. Pobieranie hemolimfy

1. Krótko znieczulić muchy wilgotnym CO₂ w wybranych punktach czasowych po wstrzyknięciu i ułożyć każdą muchę grzbietem do dołu na dwustronnej taśmie przyklejonej do powierzchni podkładki do CO₂. Rozmieścić muchy w równych rzędach z wyrównanymi torebkami głowowymi. Można użyć przyciętego drewnianego patyczka aplikacyjnego, aby docisnąć skrzydła do kleju taśmy i zapewnić unieruchomienie.
2. Po przytwierdzeniu much do taśmy, chwycić aparat gębowy (proboscis) każdej muchy precyzyjną pęsetą i delikatnie odciągnąć go w kierunku brzusznej, a następnie tylnej części ciała, tak aby przednia część torebki głowowej była widoczna pod stereomikroskopem.
3. Drugą ręką, trzymając aparat gębowy w pozycji, przebić środek torebki głowowej tuż nad szwem ptilinalnym za pomocą ostrej igły wolframowej (Rys. 2). Należy uważać, aby nie wprowadzić igły zbyt głęboko, ponieważ łatwo jest przebić końcówką igły drugą stronę torebki głowowej, co może doprowadzić do utraty kontroli nad przepływem hemolimfy. Należy przebić torebki głowowe wszystkich much w grupie wstrzyknięciowej przed rozpoczęciem pobierania hemolimfy.
4. Po przebiciu torebki głowowej, użyć przyciętego drewnianego patyczka aplikacyjnego, aby delikatnie wywrzeć nacisk na odwłok muchy. Pomocne może być obrócenie muchy na stronę brzuszną podczas wywierania nacisku. Ta procedura spowoduje wydzielenie kropli hemolimfy w miejscu nakłucia torebki głowowej.
5. Dotknąć jednym końcem mikrokapilary o objętości 1μl kropli hemolimfy wydobywającej się z miejsca nakłucia torebki głowowej. Hemolimfa zostanie wciągnięta do rurki dzięki działaniu kapilarnemu. Ustalić i zapisać ilość pobranej hemolimfy, sprawdzając wysokość słupa cieczy w mikrokapilarze przy pomocy skali objętości.

6. Oznaczanie poziomu glukozy w hemolimfie

1. Wprowadź próbki hemolimfy do studzienek mikropłytki zawierających 10 μl odczynnika Infinity Glucose Reagent. Podczas nakładania próbek hemolimfy należy przechowywać płytkę w lodzie.
2. Utwórz krzywą wzorcową, nakładając oddzielnie po 1 μl roztworów stokowych glukozy o stężeniach 50mM, 25mM, 12.5mM, 6.25mM oraz 3.125mM.
3. Inkubuj próbki w temperaturze 37°C przez 10 minut.
4. Zmierzy absorbancję przy 340 nm.
5. Uwzględnij objętość pobranej hemolimfy i wyznacz stężenie glukozy w próbkach na podstawie krzywej wzorcowej z known stężeniami glukozy.

7. Reprezentatywne wyniki

Typowa odpowiedź na test tolerancji insuliny jest wykrywana u much po wstrzyknięciu insuliny, gdzie spadek poziomu glukozy w krążeniu obserwuje się 15 minut po iniekcji. W przeciwieństwie do tego, taka odpowiedź nie występuje u much po wstrzyknięciu PBS (Rys. 3). Odpowiedź ta w zakresie obwodnego usuwania glukozy utrzymuje się u much po wstrzyknięciu insuliny do 30 minut po iniekcji. Rutynowo pobieramy 0,2-0,5 μl hemolimfy z 4-5 much w każdej grupie iniekcyjnej. W każdym eksperymencie uwzględniane są trzy grupy iniekcyjne.

Rysunek 1. Lewa strona klatki piersiowej Drosophila z zaznaczonym miejscem wkłucia igły (Modyfikowano na podstawie Demerec, 1950) ⁷Wprowadź igłę przez środek prescutum w przedniej, grzbietowej części klatki piersiowej po lewej stronie.

Rysunek 2. Widok z przodu głowy Drosophila wskazujący miejsce nakłucia w celu pobrania hemolimfy (Zmodyfikowano na podstawie: Demerec, 1950) ⁷Przebij kapsułę głowy za pomocą precyzyjnie zaostrzonej sondy wolframowej w centrum kapsuły głowy, tuż powyżej szwu ptilinalnego.

Rysunek 3. Typowa odpowiedź na test tolerancji insuliny wykryta u dorosłych much kontrolnych. Kontrola w¹¹¹⁸ Muchy wstrzyknięto insuliną bydlęcą (1 ng w PBS) lub samym PBS. Następnie grupom powtórzonym pozwolono na regenerację przez 0, 15 lub 30 minut, po czym zmierzono poziomy krążącej glukozy.

Dyskusja

Technika opisana w niniejszym raporcie jest potencjalnie użyteczna w każdym badaniu analizującym procesy fizjologiczne prowadzące do wykrywalnych zmian w składzie hemolimfy Drosophila. Dzięki połączeniu iniekcji i pobierania hemolimfy w ten sposób, możliwe jest ustalenie bezpośrednich, istotnych fizjologicznie efektów konkretnej procedury eksperymentalnej lub manipulacji. Główną zaletą tej techniki „upuszczania krwi” w pobieraniu hemolimfy w porównaniu z wcześniejszymi metodami obejmującymi dekapitację ²

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Insulina wołowa	Sigma-Aldrich	I5500
Odczynnik do oznaczania glukozy Infinity Glucose Reagent	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TR1541
Ręczny mikroinjektor	Sutter Instrument Co.
Wytciągacz do mikropipet P-87 Flamming/Brown	Sutter Instrument Co.
Jednokanalowe kapilary borokrzemianowe	A-M Systems	626000
FD&C Blue No. 1	McCormick & Co.
Mikrokapiary 1 μl	Drummond Scientific
Trzyosiowy ręczny mikromanipulator z podstawą	World Precision Instruments, Inc.