Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W komórkach ssaków siateczka śródplazmatyczna (ER) odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek, a także w sygnalizacji wapniowej1. Heterotrymeryczny kompleks Sec61 w błonie ER zapewnia wodną drogę dla nowo syntetyzowanych polipeptydów do światła ER. Niedawne prace różnych laboratoriów zasugerowały, że ten heterotrymeryczny kompleks może również tworzyć przejściowe kanały przecieku Ca2+2-8. Kluczową obserwacją dla tej koncepcji był fakt, że uwolnienie powstających polipeptydów z rybosomu i kompleksu Sec61 za pomocą puromycyny prowadzi do przejściowego uwalniania Ca2+ z ER. Ponadto zaobserwowano in vitro, że białko lumenalne ER, BiP, bierze udział w zapobieganiu przepuszczalności jonowej na poziomie kompleksu Sec619,10. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam bezpośrednio zbadać rolę kompleksu Sec61 jako potencjalnego kanału przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować jego domniemane mechanizmy regulacyjne11-13. System ten łączy wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach13. Komórki są traktowane siRNAs skierowanymi odpowiednio przeciwko regionowi kodującemu i niekodującemu (UTR) genu SEC61A1 lub negatywną kontrolą siRNA. W analizie komplementacji komórki są kotransfekowane wektorem IRES-GFP, który umożliwia ekspresję genu SEC61A1 typu dzikiego odporną na siRNA. Następnie komórki są obciążane ratiometrycznym wskaźnikiem Ca2+ FURA-2, aby za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jednocześnie monitorować zmiany stężenia Ca2+ w cytozolu w wielu komórkach. Ciągły pomiar Ca2+ w cytozolu pozwala również na ocenę wpływu różnych czynników, takich jak puromycyna, małocząsteczkowe inhibitory i tapsygargin, na przeciek Ca2+. Ten system eksperymentalny daje nam wyjątkowe możliwości, aby: i) ocenić wkład różnych białek błony ER w pasywny odpływ Ca2+ z ER w różnych typach komórek, ii) scharakteryzować białka i mechanizmy ograniczające ten pasywny odpływ Ca2+ oraz iii) zbadać efekty mutacji związanych z chorobami w odpowiednich komponentach.
Protokół
1. Przygotowanie roztworów stokowych
- Przygotować bufor wolny od wapnia (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM glukozy w 10 mM HEPES-KOH, (pH 7,35)).
- Rozpuścić FURA-2 AM w DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór stokowy. Mieszać za pomocą wortexa, aż roztwór stanie się jednorodnie jasnożółty. Chronić probówkę przed światłem. Rozcieńczyć roztwór stokowy FURA-2 AM w 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny do stężenia końcowego 4 μM w celu obciążenia komórek HeLa.
- Przygotować 12,5 mM roztwór stokowy puromycyny w wodzie destylowanej (pH 7,0). Alikwoty przechowywać w temperaturze -20°C. Rozcieńczyć 12,5 mM roztwór stokowy puromycyny w buforze wolnym od wapnia do stężenia końcowego 500 μM puromycyny.
- Rozpuścić tapsygarginę w DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór stokowy.
- Rozpuścić 1 mg ophioboliny A w 20 μl chloroformu, a następnie zmieszać z 25 μl DMSO. Probówkę do mikrocentryfugi pozostawić otwartą do czasu odparowania chloroformu. W ten sposób końcowe stężenie ophioboliny A wynosi 100 mM. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwory stokowe w buforze wolnym od wapnia do stężenia końcowego 100 μM. Dzięki temu końcowe stężenie DMSO podczas obrazowania żywych komórek nie przekracza 0,1%.
- Rozpuścić trifluoperazynę w DMSO do stężenia 10 mM i przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwory stokowe w buforze wolnym od wapnia do stężenia końcowego 10 μM. Dzięki temu końcowe stężenie DMSO podczas obrazowania żywych komórek, podobnie jak w przypadku ophioboliny A, nie przekracza 0,1%.
- Rozpuścić siRNA (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA oraz kontrolne siRNA) w wodzie wolnej od RNazy, aby przygotować 20 μM roztwór stokowy. Mieszać za pomocą wortexa i kontrolować rozpuszczanie wizualnie. Alikwoty o objętości 50 μl przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Wyciszanie genów w komórkach HeLa
W celu zbadania udziału konkretnego białka w odpływie Ca2+ z ER, odpowiedni gen musi zostać efektywnie wyciszony za pomocą dwóch różnych siRNA (Rys. 1). Dodatkowo efekt wyciszenia musi zostać zniesiony poprzez ekspresję odpowiedniego genu typu dzikiego. Zazwyczaj stosujemy siRNA skierowane odpowiednio przeciwko regionowi kodującemu i niekodującemu (UTR) badanego genu. Zastosowanie siRNA skierowanego przeciwko UTR stanowi dogodną metodę komplementacji.
- Wysiać 5,2 x 105 komórek HeLa (ATCC nr CCL-2) w 6-centymetrowej szalce hodowlanej z 25-milimetrowym szkiełkiem nakrywkowym (wstępnie potraktowanym 200 μl poli-L-lizyny (1 mg/ml) przez 1 h) w pożywce DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny, a następnie inkubować w 37°C w warunkach zwiększonej wilgotności z 5% CO2 (objętość końcowa 3,9 ml).
- Przeprowadzić transfekcję komórek siRNA przeciwko SEC61A1, siRNA przeciwko SEC61A1-UTR lub kontrolnym siRNA negatywnym, używając odczynnika HiPerFect zgodnie z instrukcją producenta (stężenie końcowe siRNA: 20 nM). W skrócie: przygotować świeże roztwory siRNA w oddzielnej probówce do mikrocentryfugi przed właściwą procedurą transfekcji: dodać 20 μl odczynnika do transfekcji HiPerFect do 4 μl każdego siRNA (20 μM) rozpuszczonego w 80 μl OptiMEM. Mieszaninę delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Mieszaninę siRNA (104 μl) dodać kroplami do wysianych 5,2 x 105 komórek HeLa (3,9 ml).
- Po 24 h wymienić pożywkę (3,9 ml) i przeprowadzić drugą transfekcję komórek tą samą mieszaniną siRNA (104 μl).
- Ocenić wyciszenie za pomocą analizy Western blot. Powinno ono przekraczać 80%. Przemyć komórki z szalki hodowlanej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i zebrać je w pożywce DMEM. Policzyć komórki przy użyciu automatycznego licznika komórek Countess. Zlizować komórki w buforze do lizy komórek (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 mM MgCl2, 0,5% NP40) uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteaz (3 μg/ml Pepstatyny A, 3 μg/ml Leupeptyny, 3 μg/ml Antipainu, 3 μg/ml Chymastatyny) i zmieszać z buforem do próbek SDS (60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerolu, 5% β-merkaptoetanolu, 0,01% błękitu bromofenolowego), aby uzyskać stężenie końcowe 10 000 komórek/μl. Próbki podgrzewać w 56 °C przez 15 min, a następnie dodać szklane kuleczki i mieszać na wirówce typu vortex przez 20 min w celu fragmentacji DNA. 20 μl każdej próbki rozdzielić za pomocą SDS-PAGE typu Laemmli (zazwyczaj 15% poliakryloamidu dla żelu rozdzielającego). Przenieść rozdzielone białka na membranę PVDF metodą elektrotransferu („wet-blot”) przy stałym natężeniu 400 mA przez 3 h lub przez noc w buforze do transferu (100 mM glicyny, 12,5 mM Tris-HCl). Następnie blokować 5% (w/v) odtłuszczonym mlekiem w proszku w PBS przez 30 min w temperaturze pokojowej, a potem inkubować membranę z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko końcowi C-terminalnemu Sec61α z królika oraz przeciwciałem przeciwko β-aktynie z myszy. Przemyć membranę w roztworze PBS-TritonX-100 (0,05%) i dwukrotnie w PBS przez odpowiednio 5 min. Wizualizować przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą koniugatu ECL Plex goat-anti-rabbit IgG-Cy5 lub ECL Plex goat-anti-mouse IgG-Cy3 oraz systemu obrazowania Typhoon-Trio w połączeniu z oprogramowaniem Image Quant TL 7.0. W przypadku genu SEC61A1 maksymalny efekt wyciszenia obserwuje się zazwyczaj 96 h po pierwszej transfekcji. Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Rys. 2.
3. Komplementacja komórek HeLa
Aby przywrócić fenotyp po wyciszeniu SEC61A1, cDNA SEC61A1 wprowadzono do miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) wektora pCDNA3-internal ribosomal entry site (IRES)-GFP, który zawierał promotor cytomegalowirusa (CMV), MCS, IRES oraz sekwencję kodującą zielone białko fluorescencyjne (GFP).
- 48 h po pierwszej transfekcji siRNA, wymień medium (3.9 ml) po raz drugi i przekształć komórki za pomocą pustego wektora lub plazmidu ekspresyjnego SEC61A1 przy użyciu Fugene HD zgodnie z protokołem producenta (ostateczny stosunek wektora do Fugene HD wynosi 4 μg wektora na 16 μl Fugene HD). W skrócie, przed procedurą transformacji przygotuj świeżo plazmidy w oddzielnej probówce do mikrowirówki: dodaj 16 μl odczynnika do transformacji Fugene HD do 4 μg każdego plazmidu rozpuszczonego w 80 μl OptiMEM. Delikatnie wymieszaj tę mieszaninę w wirówce vortex i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min. Dodaj kroplami mieszaninę plazmidową (0.1 ml) do wysianych 5.2 x 105 komórek HeLa (3.9 ml).
- Po 48 h ekspresji plazmidu poddaj szalki hodowlane mikroskopii fluorescencyjnej przed obrazowaniem wapnia i zbiorami. W razie potrzeby zastąp DMEM roztworem PBS, aby uzyskać lepsze sygnały fluorescencyjne. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD. Wydajność transformacji można określić, dzieląc liczbę komórek wykazujących fluorescencję GFP przez liczbę komórek policzonych w trybie jasnego pola; powinna ona wynosić powyżej 80%. Typowy wynik przedstawiono na Rys. 3.
4. Obrazowanie wapnia w żywych komórkach
- Przed pomiarem przenieś szkiełko podstawowe z transfektowanymi komórkami HeLa do oddzielnej szalki hodowlanej o średnicy 3,5 cm. Obciąż komórki 4 μM FURA-2 AM w 1 ml DMEM przez 45 min w temperaturze 25°C w ciemności11,12.
- Zamocuj szkiełko podstawowe o średnicy 25 mm w metalowej komorze iMIC, przemyj komórki dwukrotnie i inkubuj w buforze wolnym od wapnia (za każdym razem 300 μl).
- Rozpocznij zbieranie danych za pomocą mikroskopu iMIC z modułem polychrome V, stosując naprzemienne wzbudzanie przy 340 nm i 380 nm oraz mierząc emitowaną fluorescencję przy 510 nm (zestaw filtrów: dzielnik wiązki, 565 nm; emitter, 605/70 nm). Pobieraj obrazy próbek zawierające 20-50 komórek na klatkę co 3 s. Rejestruj sygnały FURA-2 jako stosunki F340/F380, gdzie F340 i F380 odpowiadają odpowiednio natężeniu fluorescencji po odjęciu tła przy 340 i 380 nm.
- Po 1 min potraktuj komórki puromycyną (500 μM) w buforze wolnym od wapnia lub samym buforem. Alternatywnie, potraktuj komórki inhibitorem małocząsteczkowym (takim jak 10 μM trifluoperazyny lub 100 μM ophiboliny A) lub buforem wolnym od wapnia.
- Po przeprowadzeniu pomiarów ratiometrycznych przez 2 lub 10 min dodaj tapsygarginę (1 μM) i kontynuuj pomiary.
- Ostatecznie, stężenie cytozolowe [Ca2+] szacuje się z pomiarów stosunków (ratio) za pomocą uznanej metody kalibracyjnej.2 Przeanalizuj dane za pomocą programów Excel 2007 i Origin 6.1.
5. Reprezentatywne wyniki:
Do tej pory analizowaliśmy kwestię tego, czy wyciszenie genu SEC61A1 wpływa na wyciek wapnia (Ca2+) z ER (Rys. 1). Gen SEC61A1 został wyciszony za pomocą dwóch różnych siRNA w komórkach HeLa przez 96 godzin. Podczas gdy wyciszenie niemal nie wpłynęło na wzrost i żywotność komórek, transport białek do ER w komórkach półprzepuszczalnych został niemal całkowicie zahamowany. Co więcej, komórki z wyciszonym genem SEC61A1 wykazały znaczne zaburzenia w zakresie wycieku Ca2+ z ER. Efekt wyciszenia genu został odwrócony poprzez ekspresję genu SEC61A1. Zatem kompleksy Sec61 obecne w błonie ER wszystkich komórek jądrzastych tworzą kanały wycieku Ca2+, które prawdopodobnie odgrywają kluczową rolę w homeostazie Ca2+. Jednakże obecność dużych, wypełnionych wodą porów o niekontrolowanej przepuszczalności jonowej, takich jak te tworzone przez kompleksy Sec61 w błonie ER, poważnie zakłócałaby regulowane uwalnianie Ca2+ z lumeny ER do cytosolu, co jest niezbędnym mechanizmem sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Zidentyfikowaliśmy motyw wiążący kalmodulinę (CaM) w cytozolowym N-końcu ssaczej Sec61α, który wiązał CaM, ale nie wolną od Ca2+ apokalmodulinę, z powinowactwem nanomolarnym i specyficznością sekwencyjną. Na poziomie komórkowym dwa różne antagoniści CaM stymulowały uwalnianie Ca2+ z ER w obecności, ale nie w przypadku braku kanałów Sec61 (Rys. 4 i 5). Zjawisko to nie zostało zaobserwowane w przypadku obecności kanałów Sec61 zawierających mutacje w motywie IQ białka Sec61α. Zatem kompleks Ca2+-CaM uczestniczy w ograniczaniu wycieku Ca2+ z ER (Rys. 6).
Rysunek 1. Schemat blokowy. Szczegóły znajdują się w tekście.
Rycina 2. Analiza danych dotyczących wydajności wyciszania. Wyciszanie oceniono za pomocą analizy Western-blot przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko Sec61α oraz β-actin (kontrola załadunku). Przeciwciała pierwotne wizualizowano przy użyciu przeciwciał wtórnych ECL Plex oraz obrazowania fluorescencyjnego.
Rycina 3. Analiza danych dotyczących wydajności transfekcji. Obrazy zarejestrowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD. Wydajność transformacji można określić, dzieląc liczbę komórek wykazujących fluorescencję GFP przez liczbę komórek policzonych w trybie jasnego pola.
Rycina 4. Zrzuty ekranu z obrazowania wapnia w żywych komórkach HeLa w obecności kontrolnego siRNA lub siRNA przeciwko SEC61A1 oraz w obecności lub przy braku antagonisty CaM, ophioboliny A. Komórki HeLa były traktowane siRNA skierowanym przeciwko SEC61A1 (B) lub negatywnym kontrolnym siRNA (A) przez 96 h, zgodnie z oznaczeniem. Komórki te załadowano wskaźnikiem wapnia FURA-2 AM i inkubowano w buforze wolnym od Ca2+ zawierającym 0,5 mM EGTA, a następnie dodano bufor lub ophiobolinę A (Ophio A) w buforze i wznowiono inkubację. Po 10 min zainicjowano uwalnianie Ca2+ poprzez zastosowanie tapsygarginy (TG) w obecności braku zewnętrznego Ca2+ i kontynuowano inkubację. Zrzuty ekranu z ciągłego obrazowania wapnia wykonano we wskazanych odstępach czasu.
Rycina 5. Analiza danych dla eksperymentów obrazowania wapnia w żywych komórkach. (A) Analiza kinetyczna i ilościowa serii eksperymentów przedstawionych na Ryc. 4A. Cytosoliczne [Ca2+] oszacowano na podstawie pomiarów stosunku (ratio) przy użyciu uznanej metody kalibracji2. Efekt działania tapsygarginy przedstawiono na wykresie słupkowym. (B-D) Komórki traktowano kontrolnym siRNA lub wskazanym siRNA przeciwko SEC61A1 przez 48 h, a następnie transformowano wektorem kontrolnym (C), plazmidem ekspresyjnym SEC61A1 (C) lub zmutowanym plazmidem ekspresyjnym SEC61A1 (D), zgodnie z oznaczeniem. Po 48 h przeprowadzono eksperymenty obrazowania wapnia, analogicznie jak na Ryc. 4 i 5A. Przedstawiono analizę statystyczną zmian stężenia Ca2+ w cytozolu po dodaniu tapsygarginy w eksperymentach takich jak zaprezentowane w A. Wartości P < 0,001 uznano za istotne statystycznie w nieparzystym teście t i oznaczono trzema gwiazdkami (***); n.s. – brak istotności statystycznej. Podano liczbę analizowanych komórek. Przedstawiono wartości średnie, a słupki błędów reprezentują standardowe błędy średniej (s.e.m.). Zaznaczamy, że przykłady te zostały zaadaptowane z ref. 13.
Rycina 6. Dane te wskazują, że uwalnianie nowo powstających łańcuchów z kompleksu Sec61 rzeczywiście prowadzi do uwalniania wapnia z ER i powstania nanodomeny wapniowej wokół cytozolowego wylotu kompleksu Sec61. Wapń ten jest wiązany przez kalmodulinę, a kompleks wapń-kalmodulina zamyka kompleks Sec61.
Dyskusja
W komórkach ssaków siateczka śródplazmatyczna (ER) odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek, jak również w sygnalizacji wapniowej. W niniejszej pracy opisaliśmy układ eksperymentalny, który pozwala nam bezpośrednio zbadać rolę jednego z potencjalnych kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować jego domniemane mechanizmy regulacyjne13. Ten układ eksperymentalny daje nam wyjątkowe możliwości, aby: i) ocenić wkład różnych białek błony ER w pasywny odpływ Ca2+ z ER w różnych typach komórek, ii) scharakteryzować białka i mechanizmy ograniczające ten pasywny odpływ Ca2+ oraz iii) zbadać wpływ mutacji związanych z chorobami w odpowiednich komponentach.
Zauważamy, że do analizy należy wykorzystać wyłącznie żywe komórki, a ogólna żywotność powinna przekraczać 80%. W związku z tym żywotność komórek jest rutynowo oceniana przy użyciu odczynnika do badania żywotności komórek Nuclear-ID blue/green zgodnie z protokołem producenta. Ponadto obowiązkowa jest analiza statystyczna zmian stężenia Ca2+ w cytozolu. Eksperymenty muszą być zatem przeprowadzone na czterech różnych seriach komórek, a w ramach jednego eksperymentu dla każdego stanu należy przeanalizować dwa szkiełka podstawowe zawierające co najmniej 20 komórek. Zaznaczamy, że poszczególne eksperymenty muszą zostać przeprowadzone w tym samym czasie po wysianiu komórek na szkiełka podstawowe.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
S.L. otrzymał wsparcie w ramach stypendium z DFG (Graduate Research School 845). Praca ta była finansowana z grantów DFG (SFB 530/C1 oraz FOR 967) oraz przez HOMFOR.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 | |
| OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 | |
| FBS | Biochrom AG | S0115 | |
| Penicylina/Streptomycyna | PAA Laboratories | P11-010 | |
| HiPerFect | Qiagen | 301707 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04709713 | |
| Odczynnik do oceny żywotności komórek Nuclear-ID Blue/Green | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 | |
| FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 | |
| Puromycyna | Sigma-Aldrich | P 7255 | |
| Tapsygargina | Invitrogen | T-7459 | |
| Ofiobolina A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 | |
| Trifluoperazyna | Sigma-Aldrich | T 6062 | |
| Automatyczny licznik komórek Countess® | Invitrogen | ||
| System obrazowania Typhoon-Trio | GE Healthcare | ||
| Mikroskop TE2000-S z kamerą DS-5Mc | Nikon Instruments | ||
| Mikroskop iMIC z polychrome V | Till Photonics |
Bibliografia
- Clapham, D. E. Calcium signalling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).
- Van Coppenolle, F. Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores. J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).
- Flourakis, M. Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation. FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).
- Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).
- Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry. Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).
- Amer, M. S. Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).
- Tu, H. Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations. Cell. 126, 981-993 (2006).
- Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation. Cell. 92, 747-758 (1998).
- Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).
- Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells. J. Immunol. 174, 119-130 (2005).
- Gross, S. A. TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels. J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).
- Erdmann, F. Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. EMBO J. 30, 17-31 (2011).
Przedruki i uprawnienia
