Pomiar kohezji agregatów metodą tensjometrii powierzchni tkanek

Podsumowanie

Opisujemy metodę pomiaru energii wiązania, wyrażonej jako napięcie powierzchniowe tkanki, pomiędzy komórkami wewnątrz trójwymiarowych agregatów przypominających tkankę. Wykazano, że różnice w napięciu powierzchniowym tkanki korelują z inwazyjnością nowotworów płuc, mięśni i mózgu oraz są fundamentalnymi czynnikami determinującymi ustanawianie relacji przestrzennych między różnymi typami komórek.

Streszczenie

Rygorystyczny pomiar energii wiązania międzykomórkowego można przeprowadzić wyłącznie przy użyciu metod opartych na zasadach termodynamiki w systemach znajdujących się w stanie równowagi. Opracowaliśmy tensjometrię powierzchni tkanek (TST) specjalnie w celu pomiaru powierzchniowej energii swobodnej oddziaływania między komórkami. Biofizyczne koncepcje leżące u podstaw TST zostały wcześniej szczegółowo opisane^1,2. Metoda ta opiera się na obserwacji, że komórki wykazujące wzajemną kohezję, jeśli są utrzymywane w kulturze z wytrząsaniem, spontanicznie łączą się w klastry. Z czasem klastry te zaokrąglają się, tworząc sfery. To zachowanie naśladuje procesy charakterystyczne dla układów ciekłych. Energię wiązania międzykomórkowego mierzy się poprzez ściskanie sferycznych agregatów pomiędzy równoległymi płytkami w specjalnie zaprojektowanym tensjometrze powierzchni tkanek. Do pomiaru napięcia powierzchniowego trójwymiarowych, przypominających tkankę agregatów sferycznych wykorzystuje się to samo równanie matematyczne, które służy do pomiaru napięcia powierzchniowego kropli cieczy. Komórkowym odpowiednikiem napięcia powierzchniowego cieczy jest energia wiązania międzykomórkowego, a szerzej – kohezja tkankowa. Poprzednie badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że napięcie powierzchniowe tkanki (1) pozwala przewidzieć, w jaki sposób dwie grupy komórek embrionalnych będą oddziaływać na siebie nawzajem^1-5, (2) może silnie wpływać na zdolność tkanek do oddziaływania z biomateriałami⁶, (3) może być modyfikowane nie tylko poprzez bezpośrednią manipulację kohezją międzykomórkową opartą na kadherynach⁷, ale także poprzez manipulację kluczowymi cząsteczkami ECM, takimi jak FN^8-11, oraz (4) koreluje z potencjałem inwazyjnym linii komórkowych raka płuca¹², włókniaka złośliwego¹³, guza mózgu¹⁴ oraz guza prostaty¹⁵. W niniejszym artykule opiszemy aparaturę, szczegółowo przedstawimy kroki niezbędne do generowania sferoidów, umieszczania sferoidów w komorze tensjometru, inicjowania kompresji agregatów oraz analizy i walidacji uzyskanych pomiarów napięcia powierzchniowego tkanki.

Protokół

1. Przygotowanie agregatów do pomiaru napięcia powierzchniowego tkanki.

W przypadku komórek adherentnych sferoidy można formować, stosując metodę wiszących kropel lub poprzez wytworzenie spójnej warstwy komórek, którą następnie można pociąć na fragmenty o wielkości 1 mm.

Tworzenie agregatów metodą wiszącej kropli:

1. Bliskie konfluencji hodowle komórek adherentnych należy hodować do osiągnięcia 90% konfluencji, po czym monowarstwy należy dwukrotnie przepłukać PBS. Po dokładnym odlaniu płynu dodać 2 ml (dla płytek 100 mm) 0,05% trypsyny-1 mM EDTA i inkubować w 37°C do czasu odklejenia się komórek. Proces trypsynizacji należy przerwać, dodając 2 ml pełnej pożywki, a następnie delikatnie pipetować mieszaninę pipetą 5 ml w celu resuspensji komórek. Przenieść komórki do probówki stożkowej 15 ml.
2. Dodać 40 μl roztworu zapasowego DNAse o stężeniu 10 mg/ml i inkubować przez 5 minut w RT. Krótko wymieszać na wirówce typu vortex i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
3. Odlać supernatant i przemyć osad 1 ml pełnej pożywki do hodowli tkanek. Powtórzyć czynność, a następnie resuspendować komórki w 2 ml pełnej pożywki do hodowli tkanek.
4. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i dostosować stężenie do 2,5 x 10⁶ komórek/ml.
5. Zdjąć pokrywkę z naczynia hodowlowego 60 mm i wlać 5 ml PBS na dno naczynia. Będzie ono pełnić funkcję komory nawilżającej.
6. Odwrócić pokrywkę i za pomocą pipety 20 μl nanieść krople o objętości 10 μl na jej wewnętrzną stronę. Należy upewnić się, że krople są rozmieszczone w odpowiedniej odległości, aby się nie stykały. Możliwe jest naniesienie co najmniej 20 kropli na jedną płytkę.
7. Nałożyć odwróconą pokrywkę na dno naczynia wypełnione PBS i inkubować w 37°C/5% CO₂/95% wilgotności; monitorować krople codziennie i inkubować do czasu utworzenia się arkuszy komórkowych lub agregatów.
8. Po utworzeniu się arkuszy można je przenieść do okrągłodennych szklanych kolb do wytrząsania zawierających 3 ml pełnej pożywki i inkubować w wytrząsanej kąpieli wodnej w 37°C i 5% CO₂ aż do powstania sferoidów.

Tworzenie agregatów metodą arkusza komórkowego:

9. Zawiesiny pojedynczych komórek przygotowuje się zgodnie z powyższym opisem, jednak stężenie dostosowuje się do poziomu 1x10⁶ komórek/ml.
10. Przenieść 3 ml zawiesiny komórkowej do kolbek o okrągłym dnie o pojemności 10 ml (Belco, Vineland, NJ).
11. Inkubować kolby w wirującej łaźni wodnej/inkubatorze wytrząsowym (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) w temperaturze 37°C, 5% CO2₂ przez 4 h przy 120 obr./min, aż do momentu, gdy komórki odzyskają zdolność do przylegania po trypsynizacji.
12. Przenieść komórki do szklanej probówki do wirowania z okrągłym dnem i odwirować z siłą 200 X g do uzyskania cienkiego osadu. Inkubować przez kolejne 24 h do czasu utworzenia się spójnej warstwy.
13. Delikatnie zakręć probówką z hodowlą, aby oderwać płat, a następnie przelej zawartość probówki do małego, sterylnego szklanego naczynia do hodowli tkanek.
14. Użyj mikroskalpeli, aby pociąć arkusze na fragmenty o różnych rozmiarach.
15. Inkubować fragmenty w temperaturze 37°C na wytrząsarce z łaźnią wodną przy 120 obr./min w atmosferze 5% CO2₂ przez 2 do 3 dni lub do momentu, aż staną się sferyczne.

2. Pomiar napięcia powierzchniowego agregatów

1. Tensiometr powierzchni tkanek. Aparatura przedstawiona jest na rys. 1 i 2. Komora kompresyjna (rys. 3) składa się z dwóch części. Komora zewnętrzna (OC) jest połączona z pompą cyrkulacyjną wody o temperaturze 37°C i służy do regulacji temperatury komory wewnętrznej (IC). Komory są wykonane z frezowanego Delrinu i zawierają okna kwarcowe do wizualizacji agregatu. Zespół dolny (LA) jest przykręcony do podstawy komory wewnętrznej i służy do: 1) pozycjonowania agregatu w komorze wewnętrznej; 2) uszczelniania dna komory wewnętrznej; 3) unoszenia agregatu w celu zainicjowania kompresji; oraz (4) kontrolowania odległości między równoległymi płytkami, a tym samym stopnia kompresji agregatu. Rdzeń centralny (CC) zespołu jest regulowany. Końcówka rdzenia centralnego (postument) wykonana jest z gładkiego Teflonu i pełni rolę dolnej płytki kompresyjnej (LCP). Górna płytka kompresyjna (UCP) to cylinder teflonowy o długości 15mm, zawieszony na ramieniu wagi (B) za pomocą prostowanego płomieniem drutu niklowo-chromowego (NCW)*. W trakcie eksperymentu agregat komórkowy (A) jest umieszczany na dolnej płytce i unoszony, aż zetknie się z górną płytką. Górna płytka jest połączona z ramieniem wagi (B). Kompresja agregatu powoduje przemieszczenie ramienia wagi. Waga to rejestrująca elektrowaga model 2000 firmy Cahn/Ventron, która działa na zasadzie wagi zerowej. Punkt podparcia ramienia wagi posiada armaturę w stałym polu magnetycznym. Podczas pracy waga stale moduluje prąd przepływający przez zespół elektromagnetyczny, co z kolei utrzymuje ramię wagi w pozycji poziomej. Gdy obiekt jest zawieszony na ramieniu wagi, napięcie, które waga przykłada w celu utrzymania ramienia w pozycji poziomej, jest proporcjonalne do masy obiektu. Napięcie to mierzy zewnętrzną siłę kompresji przyłożoną do agregatu. Kształt agregatu jest monitorowany poprzez obserwację wizualną za pomocą stereoskopu Nikon SMZ10A 25x połączonego z komputerem wyposażonym w moduł przechwytywania obrazu (frame grabber). Aby zminimalizować adhezję agregatów komórkowych do płytek kompresyjnych, zarówno dolna, jak i górna płytka kompresyjna zostały pokryte poli(2-hydroksyetylometakrylanem) {poly(HEMA)}, materiałem polimerowym, do którego komórki nie przylegają ¹⁶.
   * Drut jest prostowany płomieniem poprzez zawieszenie 15-calowego odcinka drutu na statywie i przymocowanie małego klipsa do końca. Następnie palnikiem Bunsena prowadzi się ogień wzdłuż drutu, aż ten rozżarzy się na czerwono. Wyprostowany drut można następnie pociąć na odpowiednie długości. Mały haczyk tworzy się, zginając drut w odległości około ¼ cala od końca za pomocą dwóch żyletek. Drugi koniec zostaje następnie włożony do gniazda dolnej płytki kompresyjnej.
2. Kompresja agregatu.
   1. Komorę wewnętrzną wypełnia się uprzednio ogrzaną, niezależną od CO₂ pożywką do hodowli tkanek (Gibco/BRL, NY).
   2. Agregaty o rozmiarach od około 200-300 μ są umieszczane na dolnej płytce kompresyjnej (rys. 4A). Agregaty są pobierane poprzez zasysanie agregatu w pożywce do hodowli tkanek do połowy końcówki pipety Pasteura wyposażonej w silikonową gruszkę, przeniesienie pipety do komory wewnętrznej i umieszczenie końcówki pipety nad LCP. Następnie agregat jest delikatnie wypuszczany na LCP poprzez lekkie ściśnięcie gruszki. Alternatywnie agregat może opaść na LCP pod wpływem grawitacji.
   3. Górną płytkę kompresyjną (UCP) ustawia się nad agregatem i pozwala jej osiąść, ustanawiając linię bazową pozornej masy UCP przed kompresją.
   4. Następnie LCP jest unoszona, aż agregat zostanie ściśnięty przeciwko UCP (rys. 4B). Regulacja wysokości rdzenia wewnętrznego dolnego urządzenia pozwoli na kontrolę różnych stopni kompresji. Kompresja jest monitorowana poprzez obserwację pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w kamerę wideo CCD.
   5. Obrazy agregatów są przechwytywane, digitalizowane i analizowane za pomocą programu ImageJ. Zmiana pozornej masy UCP jest stale rejestrowana na rejestratorze paskowym, a osiągnięcie równowagi kształtu jest sygnalizowane przez ustabilizowanie się wyjścia napięciowego wagi Cahn. Każdy agregat jest poddawany dwóm różnym stopniom kompresji.
3. Obliczanie napięcia powierzchniowego agregatu.
   W stanie równowagi kształtu kohezyjność agregatu komórek ściśniętych między równoległymi płytkami, do których nie przylegają, może zostać wyznaczona z równania Younga-Laplace'a (rys. 5), gdzie σ to kohezyjność, F to siła działająca w celu ściśnięcia agregatu, πr₃² to powierzchnia agregatu, na którą działa siła F, a R₂ i R₃ to odpowiednio promień równika ściśniętego agregatu oraz promień łuku definiującego jego profil powierzchni prostopadły do płytek kompresyjnych i rozciągający się między nimi (rys. 6). Pomiar siły kompresji i geometrii w stanie równowagi siły i kształtu oraz zastosowanie tych pomiarów w równaniu Younga-Laplace'a pozwala uzyskać wartości liczbowe pozornego napięcia powierzchniowego tkanki. Po osiągnięciu równowagi i obliczeniu σ₁, agregaty są dekompresowane i pozostawione do osiągnięcia drugiej równowagi, po czym oblicza się σ₂ w opisany wyżej sposób.
4. Potwierdzenie płynności agregatu.
   Obliczone napięcie powierzchniowe agregatu płynnego, poddanego dwóm różnym kompresjom, pozostanie stałe. W takich agregatach stosunek σ₂/σ₁ będzie równy 1 i będzie mniejszy niż stosunek siły przyłożonej przy każdej kolejnej kompresji (F₂/F₁). W przeciwieństwie do tego, obliczone napięcie powierzchniowe agregatu sprężystego będzie zgodne z prawem Hooke'a i wzrośnie proporcjonalnie do przyłożonej siły. Dla agregatów sprężystych stosunek σ₂/σ₁ nie będzie równy 1, lecz będzie zbliżać się do stosunku F₂/F₁. Napięcie powierzchniowe agregatów płynnych będzie również niezależne od wielkości agregatu ^2,17. Do obliczenia średniego σ dla każdej linii komórkowej wykorzystuje się wyłącznie pomiary, w których napięcie powierzchniowe jest niezależne od przyłożonej siły i rozmiaru.

3. Reprezentatywne wyniki:

Poniżej znajduje się tabela typowych wyników TST dla agregatów fibroblastów prostaty szczura (RPF) oraz komórek mięśni gładkich prostaty szczura (RPSMC). Jak widać na Rys. 7, agregaty komórek RPF mają napięcie powierzchniowe wynoszące 22,8 ± 1,1 dynes/cm. Ponadto średnie wartości napięcia powierzchniowego zmierzone po pierwszej kompresji (compression 1) i drugiej kompresji (compression 2) były statystycznie identyczne w analizie za pomocą testu t dla prób zależnych. Porównaliśmy również stosunki σ₂/σ₁ oraz F₂/F₁, aby upewnić się, że agregaty te nie spełniają prawa Hooke'a, co miałoby miejsce, gdyby zachowywały się jak ciała stałe sprężyste. Jak wykazano w Tabeli 1, stosunek σ₂/σ₁ rzeczywiście zbliża się do 1,0. Co więcej, stosunek F₂/F₁ był istotnie większy niż σ₂/σ₁ (test t dla prób zależnych, P < 0,05), co dodatkowo potwierdza, że agregaty te nie spełniają prawa Hooke'a i w rzeczywistości zachowują się jak ciecze. W przeciwieństwie do nich, komórki RPSMC spełniały prawo Hooke'a. Jak wynika z Tabeli 1, stosunek σ₂/σ₁ jest istotnie większy od 1 i nie różnił się statystycznie od stosunku F₂/F₁. Aby dalej wykazać zachowanie przypominające ciecz, zbadaliśmy zależność między napięciem powierzchniowym (σ) a objętością agregatu. Jak widać na Rys. 8, objętość jest niezależna od sigma dla komórek RPF (czerwona linia regresji, r² = 0,002), podczas gdy dla komórek RPSMC wydaje się istnieć pewna zależność sigma od objętości (niebieska linia regresji, r² = 0,146). Dane te dodatkowo potwierdzają, że agregaty RPF zachowują się w sposób przypominający ciecz, podczas gdy agregaty RPSMC wydają się zachowywać bardziej jak ciała stałe sprężyste. Do obliczenia napięcia powierzchniowego wykorzystywano wyłącznie pomiary uzyskane z agregatów zachowujących się jak ciecze.

Rysunek 1. Przegląd tensjometru powierzchni tkanek.

Rycina 2. Bardziej szczegółowy widok komory tensiometru (panel prawy).

Rycina 3. Schematyczny widok komory tensjometru.

Rysunek 4. Obrazy agregatów niesciśniętych (A) i ściśniętych (B).

Rycina 5. Równanie Laplace'a.

Rycina 6. Schemat kropli cieczy ściśniętej między dwiema równoległymi płytami, do których słabo przylega, w stanie równowagi kształtu. R₁ i R₂ to dwa główne promienie krzywizny, odpowiednio na równiku kropli oraz w płaszczyźnie przechodzącej przez jej oś symetrii. R₃ to promień kołowej powierzchni styku kropli z każdą z płyt kompresyjnych. H to odległość między górną a dolną płytą kompresyjną. X to jeden z boków trójkąta prostokątnego o przeciwprostokątnej R₂, prowadzącej do punktu styku między powierzchnią kropli a każdą z płyt kompresyjnych.

	σ1(dyn/cm ± SEM)	σ2(dyn/cm ± SEM)	Pσ1 vs σ2	σ1,2(dyn/cm ± SEM)	σ2/σ1	F2/F1	Pσ2/σ1 oraz F2F1
RPF	22.6 ± 1.7	22.9 ± 1.4	> 0.05*	22.8 ± 1.1	1.04 ± 0.04	1.47 ± 0.06	< 0.05
RPSMC	15.0 ± 2.8	23.0 ± 3.2	0.039	N/D	1.9 ± 0.3	1.6 ± 0.1	0.16*

Rysunek 7. Pomiary TST i potwierdzenie płynności agregatów dla agregatów fibroblastów prostaty szczura oraz komórek mięśni gładkich.

Rysunek 8. Zależność między sigma a objętością dla agregatów RPF (linia czerwona) i RPSMCs (linia niebieska).

Dyskusja

Pomiar kohezji agregatów za pomocą TST jest stosunkowo prosty. Istnieją jednak kluczowe kroki, które muszą zostać opanowane, aby uzyskać użyteczne dane TST; 1) agregaty muszą być „zdrowe”. Można to kontrolować, upewniając się, że formowanie agregatów rozpoczyna się od komórek o optymalnej konfluencji przed ich odłączeniem. Należy również kontrolować wielkość agregatów oraz czas ich hodowli, aby zminimalizować powstawanie rdzenia nekrotycznego wewnątrz agregatu; 2) innym parametrem, który może wpływać na pomiary TST, jest...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
łaźnia wodna z wytrząsarką	New Brunswick Scientific
kolby okrągłodenne 10 ml	Bellco Glass