Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Podsumowanie

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Streszczenie

Mechaniczna dysocjacja neuronów z ośrodkowego układu nerwowego ma tę zaletę, że kolbki presynaptyczne pozostają przytwierdzone do izolowanego neuronu, który jest przedmiotem badania. Pozwala to na badanie transmisji synaptycznej w warunkach, w których środowisko pozakomórkowe oraz wewnątrzkomórkowe postsynaptyczne mogą być dobrze kontrolowane. Najpopularniejszą techniką izolacji mechanicznej jest metoda oparta na wibracjach, bez użycia proteaz, znana jako wibrodysocjacja. Mikropipetę, której końcówka została wypalona do kształtu małej kuleczki, umieszcza się w plastrze mózgu gryzonia w wieku P1-P21. Mikropipeta wibruje równolegle do powierzchni plastra i jest obniżana przez jego grubość, co prowadzi do uwolnienia izolowanych neuronów. Izolowane neurony są gotowe do badania w ciągu kilku minut od wibrodysocjacji. Technika ta wykazuje przewagę nad zastosowaniem pierwotnych kultur neuronalnych, plastrów mózgu i neuronów izolowanych enzymatycznie, obejmującą: szybką produkcję żywych, stosunkowo dojrzałych neuronów odpowiednich do badań elektrofizjologicznych i obrazowych; lepszą kontrolę środowiska pozakomórkowego, wolnego od wpływu sąsiednich komórek; przydatność do dobrze kontrolowanych eksperymentów farmakologicznych z wykorzystaniem szybkiej aplikacji leków i całkowitej superfuzji komórki; oraz poprawione zacepanie potencjału (space-clamp) podczas rejestracji w konfiguracji whole-cell w porównaniu do neuronów w plastrach mózgu lub preparatach kultur komórkowych. Preparat ten może być wykorzystywany do badania fizjologii, farmakologii, modulacji i plastyczności synaptycznej. Wykorzystując neurony poddane wibrodysocjacji, możliwe jest również obrazowanie w czasie rzeczywistym elementów przed- i postsynaptycznych w żywych komórkach i kolbkach. Charakterystykę składników molekularnych elementów przed- i postsynaptycznych można również przeprowadzić za pomocą metod immunologicznych oraz obrazowania.

Protokół

1. Przygotowanie szklanej mikropipety uszczelnianej płomieniem

1. Używając szklanych mikroelektrod, wytnij standardową mikropipetę do patch-clampu w naciągaczu do mikropipet Flaming-Brown lub równoważnym (średnica końcówki ˜2 μm). Umieść końcówkę mikropipety w płomieniu palnika Bunsena przez ˜2 s, aż utworzy się stopiona kulka o średnicy 20-300 μm.
2. Zamocuj uszczelnioną płomieniem pipetę patch w uchwycie mikromanipulatora, który może być szybko wibrowany na boki (zakres ruchu 100-20 μm) za pomocą bimorfu piezoelektrycznego, przekaźnika lub innego równoważnego urządzenia.

2. Przygotowywanie skrawków mózgu szczurów lub myszy w wieku P1-P21

1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) o następującym składzie (w mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1,2 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃ oraz 10 D-glukozy. Napowietrzać roztwór mieszaniną gazów 95% tlenu/5% CO₂ przez ok. 15 min, a następnie dodać 2 mM CaCl₂ i 1 mM MgCl₂.
2. Wycinanie skrawków mózgu:
   1. Zanestezjować zwierzę halotanem lub izofluranem. Odciąć głowę zwierzęcia, wyjęć mózg i zablokować go w wybranej orientacji (koronalnej, parasagitalnej, poprzecznej itp.), tak aby objął interesujące obszary.
   2. Przymocować zablokowany mózg do stolika wibrującej mikrotomii do mózgu zanurzonej w aCSF – wyciąć skrawki o grubości 250-40 μm – umieścić skrawki w aCSF napowietrzanym karbogenem w komorze „preinkubacyjnej” na siatce umożliwiającej dostęp płynu i gazu do wszystkich powierzchni – pozostawić skrawki do wyrównania w tym medium przez co najmniej jedną godzinę.

3. Vibrodysocjacja

1. Wypełnij naczynie hodowlane o średnicy 35 mm roztworem soli buforowanej HEPES o następującym składzie (mM): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl₂, 2.5 CaCl₂, 10 D-glucose, z pH ustawionym na 7,4 za pomocą NaOH oraz osmolarnością dostosowaną do ˜30 mOsM za pomocą sacharozy. Naczynia hodowlane mogą być naczyniami do zawiesin, standardowymi naczyniami do hodowli komórkowej, naczyniami z wkładkami ze szkiełek coverglass lub naczyniami powlecznymi, np. poli-L-lizyną, w zależności od potrzeby zwiększenia adhezji komórek do dna naczynia.
2. Umieść skibkę w naczyniu hodowlanym i zwizualizuj ją za pomocą stereomikroskopu preparacyjnego przy powiększeniu 250 x. Przytrzymaj skibkę przy dnie, używając zgiętego drutu platynowego (średnica 0,5 mm) umieszczonego na górnej powierzchni skibki, aby pełnił on rolę obciążnika.
3. Ustaw końcówkę zapieczonej mikropipety na powierzchni skibki w pożądanym regionie mózgu. Aktywuj mikromanipulator, aby końcówka drgała bocznie z częstotliwością 10-30 Hz, przy amplitudzie wychylenia ˜10 μm. Za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę głębiej w tkankę skibki tak, aby przeszła przez całą jej grubość w czasie ˜30 s. Powtórz ten krok w razie potrzeby, aby zmaksymalizować liczbę izolowanych neuronów możliwych do uzyskania z danego regionu mózgu.
4. Usuń końcówkę ze skibki – podnieś skibkę pęsetą i delikatnie nią potrząśnij, gdy wciąż znajduje się w roztworze – następnie całkowicie usuń skibkę i ją odrzuć.
5. Pozostaw zdysocjowane komórki na co najmniej 10 min, aby opadły i przywarły do dna naczynia.

4. Rejestracja elektrofizjologiczna

1. Umieść naczynie z neuronami na stoliku mikroskopu odwróconego i obrazuj przy użyciu obiektywów od 10x do 63x. Poszukaj neuronów z gładką, przejrzystą błoną, bez pęcherzykowania (blebbing) i z widocznym, ale niepowiększonym jądrem. W przypadku użycia optyki kontrastowej fazowej szukaj neuronów jasnych w fazie o żółtawym odcieniu, nie zbyt niebieskich. Perfunduj komórki roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym odpowiednie sole, substancje odżywcze, antagonisty receptorowe itp. (naszym standardem jest wspomniany wyżej buforowany HEPES-em roztwór soli (sekcja 3.1)), często uzupełniony o 5 μM 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide disodium (NBQX) oraz 25-10 μM kwasu D-2-amino-5-fosfonopentanowego (AP5) w celu zablokowania jonotropowych receptorów glutaminianu, co pozwala na izolację szybkich IPSC pośredniczonych przez receptory GABA_A^1,2.
2. Wytnij standardową micropipetkę do patch-clampu za pomocą wyciągarki Flaming-Brown lub równoważnej. Rezystancja końcówki pipety powinna wynosić 2-4 MΩ (w zależności od wielkości komórki docelowej) po napełnieniu roztworem opartym na Cl^-.
3. Ustanów rejestrację whole-cell z wybranego neuronu, korzystając ze standardowych technik elektrofizjologicznych.
4. Rejestruj spontaniczne prądy postsynaptyczne (sPSC) przy użyciu protokołu akwizycji danych bez przerw (gap-free). Zastosuj 0,2-1 μM tetrodotoksyny i/lub roztwór zewnątrzkomórkowy o niskiej zawartości Ca²⁺ w celu rejestracji miniaturowych prądów postsynaptycznych (mPSC).
5. Roztwory i środki farmakologiczne mogą być aplikowane bezpośrednio do komórek. Stosujemy lokalną perfuzję z zatopionych szklanych rurek o kwadratowym przekroju, gdzie wymiana roztworu odbywa się poprzez ruch boczny rurek zamocowanych na mikromanipulatorze sterowanym silnikiem krokowym. Pozwala to na wymianę roztworu w czasie od 10 do 10 ms, co umożliwia szybkie zmiany zawartości cząsteczkowej środowiska zewnątrzkomórkowego, aplikację agonistów receptorowych itp.
6. Akaike i współpracownicy opracowali techniki stymulacji pojedynczych zakończeń presynaptycznych (boutons)^3,4. Micropipetkę umieszcza się w pobliżu widocznego zakończenia i podaje stymulację (ujemne prądy stymulujące 5-10 μA, czas trwania 0,1-0,2 ms). Rejestrowane są jednostkowe IPSC, a metody takie jak metoda niepowodzeń (method of failures) mogą być wykorzystane do badania zmian w funkcji presynaptycznej i postsynaptycznej.

5. Obrazowanie zakończeń presynaptycznych

1. Neurony postsynaptyczne można wypełnić różnymi barwnikami za pomocą pipety do patch-clampu. Można również wykorzystać neurony pochodzące od myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych (FP), takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), w wybranych populacjach komórkowych.
2. Terminale presynaptyczne można wizualizować w neuronach vibrodysocjowanych pochodzących od myszy, które wykazują ekspresję FP w konkretnych populacjach interneuronów. Na przykład myszy wykazujące ekspresję GFP sterowaną przez promotorydekarboksylazy glutaminianowej 65 (GAD65) wykazują zielone somaty i wypustki w komórkach koszyczkowych hipokampa oraz innych interneuronach. Vibrodysocjowane neurony piramidalne z obszaru CA1 hipokampa mają GFP-dodatnie terminale aksonalne przylegające do ich somatów i dendrytów proksymalnych (Rysunek 1A). Neurony piramidalne vibrodysocjowane od myszy wykazujących ekspresję synaptopHlouriny (mutanta GFP wrażliwego na pH, połączonego z białkiem VAMP2 związanym z pęcherzykami synaptycznymi) pod kontrolą promotora Thy1 również posiadają przyłączone boutons dodatnie pod kątem FP, które wykazują fluorescencję wrażliwą na pH (Rysunek 1B).
3. Boutons presynaptyczne można załadować barwnikami wskaźnikowymi wapnia i innymi cząsteczkami fluorescencyjnymi, używając związków estryfikowanych AM⁵. Rysunek 2 przedstawia przykład ładowania przy użyciu barwnika wskaźnikowego wapnia Fluo4-AM. Najpierw 1-2 μM estryfikowanego AM barwnika nanosi się na neurony w temperaturze 37° przez 10 min. Barwnik może przeniknąć do środowiska wewnątrzkomórkowego, gdzie esterazy rozszczepiają cząsteczkę, uwalniając wolny, nieprzenikający przez błony komórkowe i nienigaszony barwnik. Podejście to pozwala na załadowanie zarówno elementów presynaptycznych, jak i postsynaptycznych. Po załadowaniu komórki przemywa się roztworem soli buforowanej HEPES i utrzymuje w temperaturze 37° przez dodatkowe 10 min. Przed utworzeniem uszczelnienia GΩ za pomocą szklanej pipety-elektrody, komórki płucze się 3 razy zewnętrznym roztworem buforowanym.
4. Następnie ustanawia się rejestrację w konfiguracji whole-cell, używając wewnątrzkomórkowego roztworu pozbawionego barwnika. Po 2-5 min rejestracji barwnik zostaje w większości usunięty z neuronu postsynaptycznego, co umożliwia wizualizację boutons synaptycznych załadowanych Fluo-4. Technika ta została opracowana przez Ye i współpracowników⁵.
5. Załadowane barwnikiem boutons można następnie wizualizować za pomocą obiektywu o dużym powiększeniu i wysokiej aperturze numerycznej, korzystając z mikroskopu z kamerą lub mikroskopu wielofotonowego. Jednoczesną rejestrację whole-cell i obrazowanie wapnia można osiągnąć, używając układu przedstawionego na Rysunku 3. Obrazy neuronów i boutons pokazane na Rysunku 2C zostały zarejestrowane za pomocą kamery z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem i mnożeniem elektronów (EMCCD). Moc źródła światła do wzbudzenia została osłabiona do 1,2 % za pomocą filtra neutralnego o gęstości 1,0 oraz filtra irysowego ustawionego na 12% wyjścia. Przejściowe zmiany poziomu wapnia w zielonych boutons presynaptycznych można obserwować i rejestrować w czasie rzeczywistym oraz mierzyć w trybie offline.

6. Reprezentatywne wyniki:

Spontaniczne i wywołane wstrzyknięciem prądu wyładowania neuronów po wibrodysocjacji

Rejestracje z typowego neuronu piramidowego obszaru CA1 hipokampa poddanego wibrodysocjacji przedstawiono na rysunku 4A. Spontaniczne potencjały czynnościowe z przestrzałem (overshooting action potentials) można zaobserwować w neuronach piramidowych dysocjowanych z bocznego jądra migdałowatego, hipokampa oraz VTA szczura^1,5. Podczas rejestracji w trybie zaciskania prądu (current-clamp) z neuronów piramidowych CA1, wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego wywołuje typowe odpowiedzi napięciowe, natomiast prądy depolarizujące o odpowiedniej wartości wywołują potencjały czynnościowe z przestrzałem, charakteryzujące się typowym wzorcem opóźnionego wyładowania przy umiarkowanych poziomach prądu oraz potencjałami czynnościowymi bez akomodacji w odpowiedzi na wstrzyknięcie silniejszego prądu (rysunek 4B).

Spontaniczne i miniaturowe hamujące prądy postsynaptyczne GABAergiczne w neuronach poddanych wibrodysocjacji

Podczas rejestracji metodą clampa napięciowego z użyciem wewnątrzkomórkowego roztworu opartego na CsCl obserwuje się spontaniczne prądy synaptyczne (Rysunek 5A). Zjawiska te zanikają w roztworze o niskiej zawartości wapnia^2,6, a w większości typów neuronów są całkowicie blokowane przez antagonisty receptorów GABA_A, takie jak bikukulina lub gabazyna (Rysunek 5B, C), co wskazuje, że są to sIPSC pośredniczone przez uwalnianie GABA i aktywację tego jonotropowego podtypu receptorów. Jednak w neuronach głównych z obszarów mózgu, takich jak boczna część ciała migdałowatego² oraz brzuszny obszar tegmentalny^5,7, blokada receptorów GABA_A ujawnia EPSC o krótszym czasie trwania, pośredniczone przez glutaminergiczną aktywację receptorów typu AMPA. Co ciekawe, zastosowanie TTX w stężeniach specyficznych dla blokady najbardziej wrażliwych na toksynę napięciowo zależnych kanałów sodowych zmniejsza częstotliwość i amplitudę sIPSC obserwowanych w neuronach wibrodysocjowanych z kilku obszarów mózgu (Rysunek 6A)^2,4,7. Zatem aktywność kanałów sodowych bierze udział w uwalnianiu GABA w oddzielonych guzkach synaptycznych. Nie jest jeszcze jasne, czy w tych terminalach występują pełnowymiarowe sodowe potencjały czynnościowe. Warto zauważyć, że oporność wejściowa dobrze uszczelnionego terminala aksonu o średnicy 1 μM prawdopodobnie mieści się w zakresie GΩ. W związku z tym otwarcie nawet niewielkiej liczby kanałów sodowych może być wystarczające do depolaryzacji terminali i aktywacji kanałów wapniowych, które pośredniczą w sprzężeniu pobudzenia z sekrecją. W odniesieniu do tych kanałów wapniowych, dowody sugerują, że kanały typu N i P/Q uczestniczą w uwalnianiu w terminalach GABAergicznych w preparatach wibrodysocjowanych z obszaru CA1 hipokampa oraz w innych miejscach⁸.

Modulację i plastyczność przekaźnictwa wielu neuroprzekaźników i receptorów badano z wykorzystaniem neuronów vibrodysocjowanych^3,4,9. Wykazano, że takie działanie modulujące wykazują m.in. adenozyna, GABA, serotonina oraz endokannabinoidy^2,6,10,11,12. Ponadto w tym preparacie opisano krótkotrwałą plastyczność synaptyczną, taką jak zależne od endokannabinoidów tłumienie hamowania indukowane depolaryzacją (DSI)^2,1. Wyniki te wskazują, że wiele form sygnalizacji transsynaptycznej i receptorowej za pośrednictwem endogennych neuromodulatorów jest zachowanych w preparacie vibrodysocjowanym.

Przejściowe zmiany stężenia wapnia i uwalnianie pęcherzykowe w zakończeniach aksonalnych w preparacie vibrodysocjowanym

Używając opisanego powyżej odwróconego mikroskopu wyposażonego w EMCCD, zbadaliśmy przejściowe zmiany poziomu wapnia w terminalach presynaptycznych w preparacie neuron-bouton poddanym vibrodysocjacji. Rysunek 2 przedstawia ładowanie komórki estryfikowanym AM Fluo-4 oraz następujące po nim rozcieńczenie barwnika postsynaptycznego w neuronie piramidowym obszaru CA1 hipokampa. Spontaniczne przejściowe zmiany poziomu wapnia obserwuje się w niektórych wypełnionych barwnikiem boutonach, wskazanych jako obszary zainteresowania (ROIs) na Rysunku 6B. Aplikacja 1 μM tetrodotoksyny (TTX) eliminuje te spontaniczne zmiany, co wskazuje, że są one pośredniczone przez aktywację napięciozależnych prądów sodowych, które aktywują się spontanicznie w boutonach, prowadząc do następnych wzrostów poziomu wapnia. Zwiększenie stężenia KCl w środowisku zewnętrznym z 10 mM do 40 mM poprzez szybką wymianę roztworu powoduje wzrost fluorescencji, mierzonej w ROI odpowiadających terminalom presynaptycznym (Rysunek 7A). Równoczesna rejestracja z neuronu postsynaptycznego służy do monitorowania sIPSCs i ustalenia, czy częstotliwość zdarzeń wzrasta pod wpływem depolaryzacji indukowanej wysokim stężeniem K⁺ (Rysunek 7B).

Aby zwizualizować fuzję pęcherzyków w kolbach przedsynaptycznych, zastosowano myszy wykazujące ekspresję konstruktu synaptopHluorin pod kontrolą promotora Thy1 (oznaczone jako myszy spH21). SynaptopHluorin jest konstruktem molekularnym, w którym ecliptic pHluorin (mutant GFP o zwiększonej wrażliwości na pH)¹² jest połączony z białkiem błony związanym z pęcherzykami (VAMP2)¹³. Taka konfiguracja umieszcza motyw pHluorin w świetle pęcherzyka, gdzie względnie kwasowe środowisko tłumi fluorescencję. Podczas fuzji pęcherzyka motyw ten zostaje wystawiony na działanie bardziej neutralnego środowiska zewnętrznego, co skutkuje wzrostem fluorescencji w punktach odpowiadających pęcherzykom/terminalom przedsynaptycznym. Vibrodysocjacja neuronów hipokampa od myszy spH21 pozwala na wizualizację fluorescencyjnych punktów o wielkości i lokalizacji oczekiwanej dla terminali GABAergicznych (Ryc. 8A). Zastosowanie zewnętrznego roztworu zawierającego wysokie stężenie K⁺ zwiększa fluorescencję w tych terminalach, a efekt ten jest blokowany w obecności zewnętrznego roztworu, w którym stężenie wapnia zewnątrzkomórkowego zostało zredukowane do 0,2 mM (Ryc. 8B). Zatem wzrost fluorescencji indukowany depolaryzacją wydaje się odzwierciedlać sprzężenie pobudzenia i sekrecji w synapsach GABAergicznych w preparacie neuron-kolba.

Możliwość pomiaru presynaptycznych przejść wapniowych oraz fuzji pęcherzyków w zakończeniach aksonów w preparacie neuron-bouton pozwala nam badać wpływ neuromodulatorów, substancji psychoaktywnych i plastyczności synaptycznej na mechanizmy presynaptyczne zaangażowane w sprzęganie pobudzenia z wydzielaniem oraz egocytozę/endocytozę. Techniki te mogą być również łączone z innymi narzędziami molekularnymi i myszami modyfikowanymi genetycznie w celu zbadania roli konkretnych białek w funkcji presynaptycznej oraz modulacji i plastyczności.

Rysunek 1. Neurony poddane wibrodysocjacji z obszaru CA1 hipokampa (A) Nałożony obraz DIC i obraz z fluorescencją zieloną od myszy GAD65. Obraz DIC został nałożony, aby wyraźnie wskazać lokalizację zielonych zakończeń (B) Obraz fluorescencyjny od myszy synaptophluorin (spH21). Pasek skali = 10 μm

Rysunek 2. Procedura obciążania wskaźnikiem wapnia: (A) cała komórka jest obciążana barwnikiem estryfikowanym AM; (B) rejestracja z całej komórki rozcieńcza barwnik; (C) terminale są wizualizowane jako obszary zainteresowania (groty strzałek).

Rysunek 3. Schematyczny rysunek ustawienia doświadczalnego do jednoczesnej rejestracji całokomórkowej i obrazowania wapnia w terminalach presynaptycznych w neuronach poddanych wibrodysocjacji. EMCCD = urządzenie ładunkowo-sprzężone z mnożeniem elektronów.

Rysunek 4. Reprezentatywne przebiegi fal pokazujące (A) spontaniczne potencjały czynnościowe neuronu obszaru CA1 po vibrodysocjacji oraz (B) odpowiedzi napięcia błonowego na wstrzyknięcia prądu hiperpolaryzującego i depolarzyzującego w rejestracjach w konfiguracji current-clamp z neuronu obszaru CA1.

Rycina 5. (A) Reprezentatywne przebiegi fal spontanicznych prądów postsynaptycznych hamujących (IPSC) z neuronu piramidowego obszaru CA1. (B-C) Prądy IPSC zostały zablokowane przez gabazynę (10 μM; B) lub bikukuliny (20 μM; C).

Rysunek 6. TTX hamuje spontaniczną transmisję synaptyczną GABAergiczną i eliminuje presynaptyczne przejściowe wzrosty stężenia wapnia w preparacie hipokampa poddanym wibrodysocjacji. (A) Rejestracja z neuronu wibrodysocjowanego przed i w trakcie aplikacji TTX. Zauważalny jest spadek częstotliwości i amplitudy sIPSC. (B) Przejściowe wzrosty stężenia wapnia obserwowane w obciążonym Fluo-4 terminalu presynaptycznym neuronu wibrodysocjowanego przed i w trakcie aplikacji TTX. Zauważalny jest całkowity zanik tych wzrostów.

Rysunek 7. Jednoczesny obrazowanie wskaźnika wapnia i rejestracja całokomórkowa sIPSC wykazująca efekty wysokiego stężenia K+⁺ stymulacja. (A) Fluorescencja mierzona w czasie w presynaptycznym kolbiku załadowanym barwnikiem Fluo-4AM. (B) Jednoczesny wzrost częstotliwości i amplitudy sIPSC podczas wysokiego stężenia K+⁺ zastosowanie

Rysunek 8. Ca²⁺zależny wysokiej przenikalności K⁺ odpowiedź w kolbach presynaptycznych neuronu piramidowego spH21 z obszaru CA1 hipokampa. (A) Obraz fluorescencyjny neuronu poddanego wibrodysocjacji. (B) Wysokie stężenie K+⁺ aplikacja (oznaczona czarnym paskiem) spowodowała trwały wzrost fluorescencji w obecności naszego normalnego stężenia pozakomórkowego Ca²⁺roztwór zawierający (2 mM Ca2+⁺). Nie zaobserwowano wzrostu fluorescencji przy niskim stężeniu zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ (0,2 mM Ca2+)²⁺). Dane na wykresie zostały znormalizowane względem wartości przed podaniem wysokiego stężenia potasu (pre-high-K)⁺ poziomy fluorescencji oraz średnią odpowiedź z 3 zakończeń presynaptycznych.

Dyskusja

Skuteczna wibrodysocjacja wymaga, aby skrawki zawierały zdrowe neurony, a przestrzenie śródmiąższowe były wystarczająco elastyczne, by umożliwić neuronom opuszczenie skrawka bez uszkodzeń toksycznych. Zatem technika ta działa optymalnie w wczesnym okresie postnatalnym (P1-21), kiedy można przygotować zdrowe skrawki zawierające mniej materiału glejowego/śródmiąższowego niż w skrawkach mózgu dorosłych osobników. W naszym doświadczeniu optymalizacja przygotowania skrawka pod kątem przeżywalności neuronów w samym skrawku może być jednak przeciwskuteczna dla techniki wibrodysocjacji. Podczas gdy rutynowo przygotowujemy skrawki do rejestracji in situ przy użyciu zimnego zmodyfikowanego aCSF, w którym sacharoza zastąpiła znaczną część pozakomórkowego Na⁺ i Ca²⁺, skrawki do wibrodysocjacji mogą być przygotowywane (np. cięte) w naszym standardowym aCSF do rejestracji. Przygotowując skrawki do rejestracji z pojedynczych neuronów w samych skrawkach, umieszczamy je również w standardowym aCSF w temperaturze 35°C bezpośrednio po cięciu i pozostawiamy w tej temperaturze przez 30-60 min przed powrotem do temperatury pokojowej. Natomiast skrawki przygotowywane do wibrodysocjacji są przenoszone do temperatury pokojowej natychmiast po pocięciu. Procedury te zapewniają wyższą wydajność zdrowych neuronów po wibrodysocjacji, co prawdopodobnie wynika z braku sztywnej tkanki śródmiąższowej, co pozwala na łatwiejsze „wytrząśnięcie” neuronów ze skrawka. Nie zbadaliśmy wyczerpująco warunków przygotowania skrawków, ponieważ rutynowo otrzymujemy wystarczającą liczbę neuronów do naszych eksperymentów z rejestracją i obrazowaniem w danym dniu. Możliwe jest, że dodatkowe modyfikacje, takie jak zmiany grubości skrawka lub procedury preinkubacji, mogłyby zwiększyć wydajność zdrowych neuronów. W celu zwiększenia uzysków komórkowych i próby zastosowania tej techniki u starszych zwierząt testowano bardzo łagodne traktowanie proteazami. Jednakże, nawet łagodne traktowanie proteazami niezmiennie wydaje się zaburzać funkcję synaps. Zatem, choć kombinacja proteaz i dysocjacji mechanicznej może wciąż okazać się skuteczna, do tej pory nie okazała się ona niezawodna w przypadku neuronów przedmózgowia.

Należy również zauważyć, że stosunkowo niska wydajność zdrowych neuronów po wibrodysocjacji sprawia, iż technika ta jest przydatna głównie do badania licznych podtypów neuronów, przede wszystkim neuronów projekcyjnych. Dostępność myszy wykazujących ekspresję GFP, w których można łatwo zidentyfikować niewielkie subpopulacje neuronów, zwiększa szansę na zbadanie tych rzadszych neuronów. Jednakże, dopóki wydajność neuronów nie zostanie znacząco poprawiona, gromadzenie danych na temat tych neuronów prawdopodobnie będzie przebiegać stosunkowo powolnie.

Kilka etapów okazało się kluczowych dla skutecznego obciążania neuronów barwnikami wykrywającymi wapń. Ekspozycję na barwnik estryfikowany AM przeprowadza się w temperaturze 37°C; próby obciążania barwnikiem w niższych temperaturach nie przyniosły sukcesu. Stężenie barwników powinno zostać zoptymalizowane z uwzględnieniem zarówno czasu obciążania, jak i temperatury, ponieważ wydaje się, że wyższe stężenie barwnika obniża stężenie wapnia w boutonach presynaptycznych. Zaobserwowano, że obciążanie wyższymi stężeniami zmniejsza częstotliwość i amplitudę sIPSCs. Podczas wprowadzania barwników wykrywających wapń do zakończeń presynaptycznych neuronów dysocjowanych metodą wibracyjną należy zachować ostrożność, ponieważ pojemność buforowa małych boutonów presynaptycznych może różnić się od pojemności w somie, a rozmiary boutonów nie są jednorodne. Po obciążeniu barwnikiem naczynia zawierające neurony przemywa się zewnętrznym roztworem buforowanym HEPES; czas regeneracji po płukaniu jest kluczowy. Ponadto, aby uzyskać szczelną membranę (seal) do rejestracji whole-cell, komórki muszą zostać dokładnie przemyte w celu usunięcia niezinternalizowanych cząsteczek barwnika z zewnętrznej błony komórkowej.

Oprócz wykorzystania neuronów poddanych wibrodysocjacji do elektrofizjologii i obrazowania żywych komórek, do tych komórek można zastosować również techniki immunocytochemiczne^11,12. Komórki można łatwo utrwalić i barwić za pomocą różnych przeciwciał oraz innych markerów komórkowych. Wykorzystanie tych komórek zapewnia czysty preparat do wizualizacji ekspresji białek w presynaptycznych zakończeniach GABAergicznych. Użycie myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych pod kontrolą promotorów specyficznych dla neuronów GABAergicznych pozwala badaczowi na identyfikację poszczególnych zakończeń synaptycznych w preparacie poddanym wibrodysocjacji (Rysunek 1). Obrazowanie markerów fluorescencyjnych tego typu może umożliwić pomiary morfologiczne zakończeń przy użyciu mikroskopii laserowej oraz nowszych technik, takich jak STED (mikroskopia stymulowanej emisji z wygaszaniem). W tym preparacie możliwa jest również wizualizacja przy użyciu barwników raportujących cykl pęcherzyków synaptycznych. Akaike i współpracownicy oznakowali zakończenia GABAergiczne barwnikiem styrylowym FM1-43 w celu wizualizacji zakończeń w żywych komórkach⁴.

Możliwe powinno być również przeprowadzenie jednokomórkowej odwrotnej transkrypcji i PCR w celu profilowania ekspresji RNA w neuronach rozdzielonych metodą wibrodysocjacji. Technika ta jest rutynowo stosowana w przypadku neuronów rozdzielonych enzymatycznie oraz neuronów hodowanych in vitro.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wibrujący tomograf tkankowy (mikrotom)	Leica Microsystems	VT1200S
Naczynie do hodowli komórkowych (35 mm)	BD Biosciences	353001
Naczynia z dnem szklanym	Willco-dish	GWSB-5040 lub GWSB-3522	Grubość szkła 0,16-0,19 mm do obrazowania
Manipulator piez–elektryczny	EXFO	LSS-3000	Można również użyć przekaźnika itp.
Stymulator impulsów prostokątnych SD9	Grass Technologies	SD9K	Do wyzwalania manipulatora piez–elektrycznego
Stereomikroskop do sekcji	Wild Heerbrugg	TYP 374590	Można również użyć dowolnego stereomikroskopu
Wytwarzarka mikropipet (wyciągacz płomieniowy/Brówna)	Sutter Instrument Co.	P-97
Cienkościenne kapilary szklane	World Precision Instruments, Inc.	TW-150F-4	Do mikropipet szklanych uszczelnianych płomieniem i mikropipet do patch-clampu
Sześciokanałowe systemy sterowania zaworami perfuzyjnymi	Warner Instruments	VC-6 lub VC-6M
Szybki sterownik krokowy perfuzji	Warner Instruments	SF-77B
Mikroskop odwrócony z obiektywami 20-63x	Nikon Instruments	TS200 Diaphot
Kamera EMCCD	Andor	iXonEM+ DU-888
Źródło światła do wzbudzenia fluorescencji	EXFO	X-Cite 120PC
Wskaźnik wapnia Fluo-4, AM	Molecular Probes, Life Technologies	F14201