Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Podsumowanie

Opisujemy tutaj metodę pobierania biopsji błony śluzowej węchowej z jam nosowych szczura i człowieka. Biopsje te mogą być wykorzystane do identyfikacji anomalii molekularnych w chorobach mózgu lub do izolacji wielopotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą zostać użyte do transplantacji komórkowej w zwierzęcych modelach urazów i chorób mózgu.

Streszczenie

Błona śluzowa węchowa, znajdująca się w jamie nosowej, odpowiada za wykrywanie zapachów. Jest to również jedyna tkanka nerwowa wystawiona na działanie środowiska zewnętrznego i łatwo dostępna u każdej żywej jednostki. W związku z tym tkanka ta jest wyjątkowa dla każdego, kto dąży do zidentyfikowania anomalii molekularnych w patologicznym mózgu lub wyizolowania dorosłych komórek macierzystych do terapii komórkowej.

Nieprawidłowości molekularne w chorobach mózgu są często badane przy użyciu próbek tkanki nerwowej pobranych po śmierci. Materiał ten ma jednak liczne ograniczenia. W przeciwieństwie do niego, błona śluzowa powonienia jest łatwo dostępna i można ją bezpiecznie pobrać drogą biopsji bez utraty zmysłu węchu¹. W związku z tym błona śluzowa powonienia stanowi u dorosłego człowieka „otwarte okno”, przez które można badać choroby rozwojowe (np. autyzm, schizofrenię)^2-4 lub neurodegeneracyjne (np. chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera)^4,5. Błonę śluzową powonienia można wykorzystać zarówno do porównawczych badań molekularnych^4,6, jak i eksperymentów in vitro dotyczących neurogenezy^3,7.

Nabłonek węchowy jest również tkanką nerwową, która codziennie wytwarza nowe neurony w celu zastąpienia tych uszkodzonych przez zanieczyszczenia, infekcje bakteryjne lub wirusowe. Ta permanentna neurogeneza jest podtrzymywana przez komórki progenitorowe, a także komórki macierzyste znajdujące się w obu przedziałach błony śluzowej, mianowicie w neuroepithelium oraz w położonej pod nim warstwie właściwej (lamina propria)^8-10. Opracowaliśmy niedawno metodę oczyszczania dorosłych komórek macierzystych zlokalizowanych w warstwie właściwej i po wykazaniu, że są one ściśle powiązane z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi szpiku kostnego (BM-MSC), nazwaliśmy je olfaktorycznymi ektomezenchymalnymi komórkami macierzystymi (OE-MSC)¹¹.

Co ciekawe, w porównaniu z BM-MSCs, OE-MSCs wykazują wysoką szybkość proliferacji, zwiększoną klonogenność oraz tendencję do różnicowania się w komórki neuronalne. Wykorzystaliśmy te właściwości do przeprowadzenia badań mających na celu ujawnienie nowych genów kandydackich w schizofrenii i chorobie Parkinsona⁴. My oraz inni badacze wykazaliśmy również, że OE-MSCs są obiecującymi kandydatami do terapii komórkowej po urazie rdzenia kręgowego^12,13, uszkodzeniu ślimaka¹⁴ lub w modelach zwierzęcych choroby Parkinsona¹⁵ bądź amnezji¹⁶.

W niniejszym badaniu przedstawiamy metody pobierania biopsji błony śluzowej węchowej u szczurów i ludzi. Po pobraniu, blaszka właściwa jest oddzielana od nabłonka enzymatycznie, a komórki macierzyste są oczyszczane za pomocą metody enzymatycznej lub nieenzymatycznej. Oczyszczone komórki macierzyste węchu mogą być następnie namnażane w dużych ilościach i przechowywane w ciekłym azocie, indukowane do tworzenia sfer lub różnicowane w komórki neuronalne. Komórki macierzyste te mogą być również wykorzystane w porównawczych badaniach omicznych (genomicznych, transkryptomicznych, epigenomicznych, proteomicznych).

Protokół

1. Pobieranie błony śluzowej węchowej u szczurów

1. Rozpocznij od przygotowania w czystym dygestorium trzech szalek Petriego o średnicy 35 mm wypełnionych pożywką DMEM/HAM F12.
2. Każda metoda eutanazji musi zostać wcześniej zatwierdzona przez instytucjonalną komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt oraz przeprowadzona przez wykwalifikowany personel. Po wprowadzeniu szczura w głęboką narkozę za pomocą pentobarbalsodu lub innych wstrzykiwalnych środków znieczulających, takich jak ketamina/ksylazyna, wykonaj dekapitację i usuń skórę. Należy unikać środków znieczulających wziewnych. Odpowiedniość znieczulenia zostanie oceniona poprzez ucisk palców stopy przed dekapitacją. Usuń żuchwę za pomocą nożyczek, a następnie kleszczykami kostnymi usuń mięśnie twarzy po obu stronach.
3. Zaczynając od tylnej części siekaczy, usuń kleszczykami kostnymi kość pokrywającą jamę nosową, wykonując to po jednej stronie. Przewijściski węchowe stają się widoczne jako pomarańczowe/brązowe organy znajdujące się w tylnej części nosa.
4. Ostrożnie usuń przewijściski za pomocą pęsety. Używając igły 26 G, wyizoluj błonę śluzową węchową znajdującą się na przegrodzie, przecinając tkankę wzdłuż trzech linii: łuku płytki prostopadłej, płytki sitowej oraz stropu jamy nosowej.
5. Pobierz biopsje z obu stron i przenieś je do szalki Petriego wypełnionej pożywką DMEM/HAM F12. Procedura ta nie powinna trwać dłużej niż 10 minut od rozpoczęcia eutanazji.
6. Następnie, w celu usunięcia śluzu, przenieś biopsje dwukrotnie do szalek Petriego wypełnionych pożywką.

2. Pobieranie błony śluzowej węchowej u ludzi

1. Procedurę tę powinien przeprowadzić chirurg laryngolog (ENT), zgodnie z wytycznymi właściwych lokalnych komisji etycznych; każdy pacjent ambulatoryjny powinien podpisać formularz świadomej zgody.
2. Używając sztywnego endoskopu 0° lub 30° (średnica 4 mm), należy zbadać obie jamy nosowe i ocenić domniemaną obecność polipów lub jakichkolwiek zmian zapalnych. Wybierz optymalną jamę nosową, biorąc pod uwagę ewentualne skrzywienie przegrody.
3. Za pomocą aplikatora bawełnianego należy zastosować znieczulenie miejscowe, np. lidokainę z epinefryną, na 10 minut.
4. Używając kleszczy etmoidalnych o przekroju poprzecznym, pobierz biopsjat o wielkości dwóch milimetrów kwadratowych z nasady przyśrodkowej części małżowiny nosowej środkowej lub z obszaru grzbietowo-przyśrodkowego przegrody.
5. Następnie, za pomocą sterylnej igły, przenieś biopsjat węchowy do sterylnej probówki o pojemności 2 ml wypełnionej 1 ml DMEM/HAM F12. Odwróć probówkę dnem do góry, aby upewnić się, że biopsjat jest zanurzony w pożywce hodowlanej.
6. Umieść probówkę w pojemniku chłodzącym i przetransportuj ją do laboratorium badawczego. Na tym etapie biopsjat może być wykorzystany bezpośrednio do komparatywnych badań molekularnych skoncentrowanych na konkretnych chorobach mózgu lub poddany obróbce w celu generowania komórek macierzystych.

3. Izolacja komórek macierzystych węchu z błony śluzowej człowieka i szczura

1. Przemyj biopsaty w DMEM/HAM F12. Inkubuj biopsaty w szalce Petri wypełnionej 1 ml roztworu dispazy II (2,4 IU/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
2. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym z dyfrakcyjnym światłem odwróconym, oddziel nabłonek węchowy od leżącej poniżej blaszki właściwej (lamina propria) za pomocą mikrospatułki.
3. Nabłonek węchowy jest cieńszy i wydaje się półprzezroczysty na czarnym tle w porównaniu do blaszki właściwej, która ma pomarańczowo-brązowe prążki. Na białym tle nabłonek wygląda na szary, a blaszka właściwa na brązową.
4. Po oczyszczeniu przenieś blaszkę właściwą do szalki Petri wypełnionej DMEM/HAM F12.
5. Jeśli tkanka pochodzi od gryzonia, potnij blaszkę właściwą na małe kawałki za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 25 G. Następnie przenieś kawałki do probówki 15 ml wypełnionej 1 ml kolagenazy IA.
6. W probówce, używając sterylnej plastikowej pipety, zdysocjuj tkankę. Następnie inkubuj probówkę przez 10 minut w temperaturze 37°C.
7. Aby przerwać dysocjację, delikatnie potrząśnij probówką, dodaj 9 ml PBS wolnego od Ca i Mg i odwiruj przy 200 g przez 5 minut.
8. Resuspenduj osad komórkowy w pożywce DMEM/HAM F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotyki i wysiej na plastikowe naczynia hodowlane.
9. W przypadku tkanki ludzkiej, potnij blaszkę właściwą na 3 do 4 kawałków o grubości od 200 do 500 μm.
10. Umieść każdy pasek w osobnej naczyniach hodowlanych o średnicy 2 cm i przykryj tkankę sterylnymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 1,3 cm.
11. Następnie dodaj 500 μl pożywki hodowlanej (DMEM/HAM F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotyki) do każdego naczynia hodowlanego.
12. Dla obu typów tkanek wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2 do 3 dni.
13. Po pięciu do siedmiu dniach komórki macierzyste zaczną naciekać naczynie hodowlane, a po dwóch tygodniach powinny osiągnąć konfluencję. Po osiągnięciu konfluencji pasażuj i przenieś komórki do kolb hodowlanych.

4. Tworzenie sfer i różnicowanie neuronalne komórek macierzystych węchowych

1. Aby wygenerować sfery komórek macierzystych, inkubować kolby przez dwie godziny w temperaturze 37°C z poli-L-lizyną (TEXT: 5 g/cm2).
2. Wysiać komórki w opracowanych kolbach z gęstością 16 000 komórek na centymetr kwadratowy.
3. Co dwa dni dokarmiać komórki 0,2 ml na centymetr kwadratowy suplementowanego pożywki (DMEM/HAM F12 suplementowane insuliną, transferryną, selenem (ITS-X, 1%), EGF (50 ng/ml) oraz FGF2 (50 ng/ml)).
4. Po dwóch do pięciu dniach zebrać pływające sfery komórkowe, a następnie ponownie je wysiać lub zdysocjować przed przeszczepieniem w zwierzęcych modelach terapii komórkowej.
5. Aby zróżnicować obwąchowe komórki macierzyste w komórki neuronopodobne, hodować je przez 21 dni w pożywce Neurobasal zawierającej B-27, penicylinę, streptomycynę, glutaminę i glutaminian.
6. Następnie wymieniać pożywkę co 3 dni. Komórki neuronopodobne powinny pojawić się po dwóch do trzech tygodniach.

5. Reprezentatywne wyniki:

Komórki macierzyste wyrosłe z ludzkich eksplantów nosowych (Rycina 2A) dzielą się szybko, a konfluencję można osiągnąć w ciągu jednego do dwóch tygodni. Oceńiono jedną z kluczowych cech macierzystości – ekspresję nestyny (Rycina 2B). Podczas hodowli na poli-L-lizynie w bezserwatkowym medium hodowlanym uzupełnionym o EGF (50 ng/ml) i FGF2 (50 ng/ml), olfaktoryczne komórki macierzyste tworzą sfery (rycina 2C). W przypadku hodowli w medium zawierającym surowicę, nowo wysiane sfery dają początek komórkom wykazującym ekspresję GFAP (˜50%), tubuliny (˜10-15%) oraz O4 (˜2-5%)⁹ (Ryciny 2D-F). Los komórek pochodzących ze sfer może jednak zostać zmodyfikowany. Na przykład, podczas hodowli w medium Neurobasal uzupełnionym o B27 i glutaminian, większość nosowych olfaktorycznych komórek macierzystych przekształca się w komórki neuronopodobne wykazujące ekspresję β-III tubuliny (Rycina 2G) i MAP2 (Rycina 2H).

Rycina 1. Ogólny schemat eksperymentu. Biopsje błony śluzowej węchowej są pobierane z jamy nosowej szczura lub człowieka. Eksplantaty mogą być wykorzystywane bezpośrednio do porównawczych badań molekularnych mających na celu identyfikację biomarkerów w chorobach mózgu. W celu izolacji komórek macierzystych węchu, interakcje między blaszka właściwa a neuroepithelium są rozrywane przy użyciu enzymu dispase II, a po 45 minutach nabłonek jest usuwany za pomocą mikrospatułki. Komórki macierzyste węchu gryzoni są następnie selekcjonowane poprzez dysocjację blaszki właściwej za pomocą kollagenazy IA. W przypadku tkanki ludzkiej, fragmenty blaszki właściwej błony węchowej są hodowane pod szkiełkiem podstawowym do czasu, aż wyrastające komórki macierzyste zajmą całą studzienkę. Po proliferacji, z zastosowaniem odpowiedniego pożywki hodowlanej, komórki macierzyste węchu mogą generować sfery lub różnicować się w komórki neuronopodobne. Komórki macierzyste węchu mogą być wykorzystywane do i) leczenia chorób mózgu lub urazów lub ii) identyfikacji markerów molekularnych chorób ośrodkowego układu nerwowego. Ilustracje zostały wykonane przy pomocy Servier Medical Art.

Rycina 2. Hodowla i różnicowanie ludzkich komórek macierzystych węcha z nosa. Ludzkie komórki macierzyste wyrastające z eksplantu błony właściwej (A) dzielą się szybko podczas hodowli w medium zawierającym surowicę. Komórki macierzyste wykazują ekspresję markera macierzystości nestin (B). Po wysianiu na plastik pokryty poli-L-lizyną i hodowli w bezsurowiczym medium hodowlanym uzupełnionym o EGF i FGF2, komórki macierzyste węcha tworzą sfery (C). Komórki pochodzące ze sfer, po wysianiu w medium hodowlanym z surowicą, dają początek komórkom wykazującym ekspresję GFAP (˜50%), tubuliny (˜10-15%) oraz O4 (˜2-5%)⁹ (D-F). W przypadku hodowli w medium Neurobasal uzupełnionym o B27 i glutaminian, różnicują się one w komórki neuronopodobne wykazujące ekspresję β-III tubuliny (G) oraz MAP2 (H).

Dyskusja

Przedstawione tutaj techniki sprawiają, że błona śluzowa węchowa gryzoni i ludzi stanowi użyteczny model w badaniach klinicznych nad przyczynami chorób neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych, a także narzędzie do regeneracji patologicznie zmienionego lub urazowego mózgu. Protokół jest stosunkowo prosty i może zostać z łatwością przeprowadzony przez doświadczonego biologa komórkowego. Skuteczność technik biopsji i hodowli jest wysoka.

Kluczowe etapy

• W przypadku pobierania błony śluzowej węchowej gryzoni zaleca się, aby czas między eutanazją a końcowym wycięciem tkanki węchowej nie przekraczał 10 minut.
• Dysocjację blaszki właściwej błony śluzowej węchowej gryzoni zazwyczaj uzyskuje się po 10 min. inkubacji w kolagenazie IA. Jeśli tak się nie stanie, zalecamy, aby następnego dnia zebrać nadpływ, w którym unoszą się niedysocjowane fragmenty blaszki właściwej, odwirować go przy 200 g i mechanicznie dysocjować pływającą tkankę za pomocą pipety Pasteura przed ponownym wysianiem komórek do nowej studzienki. Pierwszą studzienkę zawierającą już przytwierdzone komórki należy wypełnić świeżą pożywką hodowlaną.
• W przypadku ludzkiej blaszki właściwej, która jest bardziej zwarta niż tkanka gryzoni, nie zalecamy dysocjacji enzymatycznej. Tkankę należy pokroić, a każdy eksplant umieścić pomiędzy dnem plastikowej szalki a szkiełkiem nakrywkowym. Udane hodowle obejmują eksplanty o grubości od 200 do 500 μm.

Możliwe modyfikacje

• Obecny protokół można nieco zmodyfikować w celu generowania neuronów węchowych in vitro. W tym celu nie usuwa się neuroepitelium, a całą błonę śluzową nosa tnie się za pomocą siekacza McIlwaina (grubość 200 μm). Każdy eksplant wysiewa się do szalki, częściowo wysusza przez jedną godzinę, a następnie nawilża pożywką hodowlaną zawierającą FCS. W ciągu pierwszych dni po wysianiu z eksplantu wyrastają komórki nabłonkowe i mezenchymalne. Następnie progenitory neuronów migrują na powierzchnię tej warstwy komórkowej i różnicują się w neurony.
• Oczyszczanie komórek macierzystych węchu można przeprowadzić za pomocą cytometrii przepływowej. Specyficzne markery powierzchniowe można znaleźć na liście opublikowanej w pracy dotyczącej charakterystyki¹¹.
• Do eksperymentów z transplantacją można wykorzystać szczep szczurów, którego komórki macierzyste węchu są GFP-dodatnie. Ten szczep szczurów (Sprague Dawley, eGFP sterowane przez promotor PGK) jest dostępny w ITERT (Nantes, Francja). Do wprowadzenia genu GFP do ludzkich komórek macierzystych węchu stosujemy metodę opartą na infekcji lentiwirusowej.
• Niniejsza praca koncentruje się na ektomezenchymalnych komórkach macierzystych węchu. Jednakże inny interesujący typ komórek, komórki otaczające włókna węchowe, może zostać oczyszczony z tej samej tkanki. Opisaliśmy metodę ich pozyskiwania i oczyszczania^1,17, a ludzkie komórki otaczające włókna węchowe wykorzystaliśmy w badaniu klinicznym fazy I/IIa u pacjentów z paraplegią¹⁸.
• Jako członek superrodziny mezenchymalnych komórek macierzystych, OE-MSCs są w stanie, w odpowiednich warunkach hodowli, różnicować się w adipocyty, osteocyty i miocyty¹¹.

Przyszłe zastosowania

• Wykorzystaliśmy już biopsje błony śluzowej nosa ludzi do badania anomalii komórkowych i molekularnych u pacjentów z autyzmem, zaburzeniami afektywnymi dwubiegunowymi, rodzinną dysautonomią, chorobą Parkinsona, chorobą Alzheimera oraz schizofrenią^2-7. Teoretycznie wszystkie choroby mózgu mogą być badane z wykorzystaniem biopsji nosa lub obwodowych komórek macierzystych węcha.
• Gryzoniowe i ludzkie komórki macierzyste węcha nosa były już przeszczepiane w zwierzęcych modelach amnezji, choroby Parkinsona, uszkodzeń ślimaka oraz urazów rdzenia kręgowego^12-16. Możliwe jest transplantowanie tych komórek do zwierzęcych modeli choroby Alzheimera, niedokrwienia mózgu oraz stwardnienia rozsianego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
		Pobieranie błony śluzowej węchowej u szczurów
DMEM/HAM F12	Invitrogen	31331-028
Pentobarbital sodu
Kleszczyki kostne	Fine Science Tools
Igła G 26	Terumo Medical Corp.	NN-2613R
Pinceta
		Pobieranie błony śluzowej węchowej u ludzi
Sztywny endoskop	Karl Storz lub Richard Wolf Medical
Lidokaina
Epinefryna
Kleszczyki do kości sitowej	Karl Storz lub Richard Wolf Medical
		Izolacja komórek macierzystych węchu
Dispase II	Roche Group	10 295 825 001
Mikroskop stereotypowy
Mikroszpatułka	Fine Science Tools
Kolagenaza IA	Sigma-Aldrich	C9891
PBS bez Ca/Mg	Invitrogen	14190-250
Płodowa surowica cielęca	Invitrogen	10270098
Szklane szkiełko nakrywkowe	Knittel Glaser	001/35
		Tworzenie sfer i różnicowanie neuronalne
Poli-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P-1274
Insulina, transferyna, selen (ITS)	Invitrogen	51500056
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF2	R&D Systems	233-FB
Pożywka Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Suplement B-27 bezsurowiczy	Invitrogen	17504-044
Penicylina/streptomycyna	Invitrogen	15140122
Glutamina	Invitrogen	25030024
Glutaminian	Sigma-Aldrich