$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Komórki dendrytyczne (DC) mogą być uważane za strażników układu odpornościowego, które odgrywają kluczową rolę w jego inicjacji i odpowiedzi na infekcję1. Wykrywanie patogennego antygenu przez naiwne DC odbywa się za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców (PRR), które są w stanie rozpoznawać określone konserwatywne struktury zwane wzorcami molekularnymi związanymi z patogenem (PAMPS). Wykrycie PAMP przez DC wyzwala wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, powodującą ich aktywację i transformację do dojrzałych DC. Proces ten zwykle charakteryzuje się wytwarzaniem interferonu typu 1 wraz z innymi cytokinami prozapalnymi, regulacją w górę markerów powierzchniowych komórek, takich jak MHCII i CD86 oraz migracją dojrzałego DC do drenujących węzłów chłonnych, gdzie interakcja z limfocytami T inicjuje adaptacyjną odpowiedź immunologiczną2,3. W ten sposób DC łączą wrodzony i adaptacyjny układ odpornościowy.
Zdolność do analizowania sieci molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi DC na różne patogeny jest kluczowa dla lepszego zrozumienia regulacji tych szlaków sygnałowych i ich indukowanych genów. Powinno to również ułatwić opracowanie szczepionek opartych na wirusie macierzystym przeciwko chorobom zakaźnym i nowotworom. Jednak ten kierunek badań został poważnie utrudniony przez trudności w transfekcji pierwotnychDC4.
Metody transdukcji wirusa, takie jak system lentiwirusowy, są zazwyczaj stosowane, ale niosą ze sobą wiele ograniczeń, takich jak złożoność i ryzyko zagrożenia biologicznego (wraz z powiązanymi kosztami)5,6,7,8. Dodatkowo, dostarczanie produktów genów wirusa zwiększa immunogenność transdukowanych DC9,10,11,12. Elektroporacja została użyta z mieszanymi wynikami13,14,15, ale jesteśmy pierwszymi, którzy donoszą o zastosowaniu protokołu transfekcji o wysokiej przepustowości i jednoznacznie demonstrują jego użyteczność.
W tym raporcie podsumowujemy zoptymalizowany protokół komercyjny do wysokoprzepustowej transfekcji ludzkich pierwotnych DC, z ograniczoną toksycznością komórkową i brakiem dojrzewania DC16. Skuteczność transfekcji (plazmidu GFP) i żywotność komórek wynosiły odpowiednio ponad 50% i 70%. Analiza FACS wykazała brak wzrostu ekspresji markerów dojrzewania CD86 i MHCII w transfekowanych komórkach, podczas gdy qRT-PCR nie wykazał regulacji w górę IFNβ. Korzystając z tego protokołu elektroporacji, dostarczamy dowodów na udaną transfekcję DC za pomocą siRNA i skuteczne powalenie docelowego genu RIG-I, kluczowego receptora rozpoznawania wirusa16,17, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.