Zoptymalizowany protokół skutecznej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Summary

Prezentujemy nasz zoptymalizowany protokół wysokiej przepustowości nukleofekcji jako skuteczny sposób transfekcji pierwotnych komórek dendrytycznych pochodzących z ludzkich monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA bez powodowania dojrzewania komórek. Ponadto dostarczamy dowodów na skuteczne wyciszanie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Abstract

Komórki dendrytyczne (DC) mogą być uważane za strażników układu odpornościowego, które odgrywają kluczową rolę w jego inicjacji i odpowiedzi na infekcję¹. Wykrywanie patogennego antygenu przez naiwne DC odbywa się za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców (PRR), które są w stanie rozpoznawać określone konserwatywne struktury zwane wzorcami molekularnymi związanymi z patogenem (PAMPS). Wykrycie PAMP przez DC wyzwala wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, powodującą ich aktywację i transformację do dojrzałych DC. Proces ten zwykle charakteryzuje się wytwarzaniem interferonu typu 1 wraz z innymi cytokinami prozapalnymi, regulacją w górę markerów powierzchniowych komórek, takich jak MHCII i CD86 oraz migracją dojrzałego DC do drenujących węzłów chłonnych, gdzie interakcja z limfocytami T inicjuje adaptacyjną odpowiedź immunologiczną^2,3. W ten sposób DC łączą wrodzony i adaptacyjny układ odpornościowy.

Zdolność do analizowania sieci molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi DC na różne patogeny jest kluczowa dla lepszego zrozumienia regulacji tych szlaków sygnałowych i ich indukowanych genów. Powinno to również ułatwić opracowanie szczepionek opartych na wirusie macierzystym przeciwko chorobom zakaźnym i nowotworom. Jednak ten kierunek badań został poważnie utrudniony przez trudności w transfekcji pierwotnych^DC4.

Metody transdukcji wirusa, takie jak system lentiwirusowy, są zazwyczaj stosowane, ale niosą ze sobą wiele ograniczeń, takich jak złożoność i ryzyko zagrożenia biologicznego (wraz z powiązanymi kosztami)^5,6,7,8. Dodatkowo, dostarczanie produktów genów wirusa zwiększa immunogenność transdukowanych DC^9,10,11,12. Elektroporacja została użyta z mieszanymi wynikami^13,14,15, ale jesteśmy pierwszymi, którzy donoszą o zastosowaniu protokołu transfekcji o wysokiej przepustowości i jednoznacznie demonstrują jego użyteczność.

W tym raporcie podsumowujemy zoptymalizowany protokół komercyjny do wysokoprzepustowej transfekcji ludzkich pierwotnych DC, z ograniczoną toksycznością komórkową i brakiem dojrzewania DC¹⁶. Skuteczność transfekcji (plazmidu GFP) i żywotność komórek wynosiły odpowiednio ponad 50% i 70%. Analiza FACS wykazała brak wzrostu ekspresji markerów dojrzewania CD86 i MHCII w transfekowanych komórkach, podczas gdy qRT-PCR nie wykazał regulacji w górę IFNβ. Korzystając z tego protokołu elektroporacji, dostarczamy dowodów na udaną transfekcję DC za pomocą siRNA i skuteczne powalenie docelowego genu RIG-I, kluczowego receptora rozpoznawania wirusa^16,17, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Protocol

1. Zaprogramuj Nucleofector do odwiertów Amaxa 96

1. Otwórz nowy plik parametrów.
2. Wybierz liczbę studzienek, których będziesz używać do standardowej transfekcji, przeciągając kursor na schemat płytki 96-dołkowej. Użyj co najmniej 3 studzienek do puli dla każdej próbki eksperymentalnej.
3. Wprowadź kod programu: w części 1 wybierz "FF", a w części 2 wybierz "168" z menu rozwijanych
4. W polu Rozwiązanie wybierz "Monocyte, człowiek"
5. W obszarze Opcja sterowania wybierz opcję "standardowa".
6. Kliknij Zastosuj.
7. Aby uwzględnić kontrolę bez transfekcji, wybierz kolejne studzienki ze schematu zgodnie z wymaganiami, a następnie wybierz "Brak kontroli programu" z opcji sterowania i kliknij Zastosuj.
8. Zaznacz pozostałe niewykorzystane studzienki na schemacie płytowym i kliknij przycisk Cofnij definicję.

2. Przygotuj DC do transfekcji

1. Tam, gdzie to możliwe, wszystkie prace powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli komórkowych. Przygotuj roztwór nukleofekcji, dodając 96-dołkowy suplement do ludzkiego monocytu 96-dołkowego roztworu nukleofektora w stosunku 450 do 2025. Wymieszaj i pozostaw do ogrzania do temperatury pokojowej. Będziesz potrzebował 20 μl roztworu nukleofekcji na dołek. Zwiększ ilość wody o 10%, aby uniknąć błędu pipetowania.
2. Umieść potrzebną liczbę modułów nukleokuwetowych na płytce nukleokuwety we właściwej orientacji, tj. wkładając pierwszy z nich do rzędów 1 i 2.
3. Określ liczbę DC potrzebnych do eksperymentu, obliczając na 500 000 komórek na studzienkę i osadzanie, wirując przy 400 g przez 10 minut. Ostrożnie usuń supernatant.
4. Ponownie zawiesić komórki w roztworze nukleofekcji, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół.
5. Podziel odpowiednią objętość zawieszonych komórek na eppendorfy oznaczone dla konkretnego zabiegu, np. GLO i RIG-I.
6. Dodać 0,25 μg siRNA na 500 000 komórek i wymieszać przez pipetowanie. Użyj siRNA niedocelowego w próbce kontrolnej bez transfekcji.
7. Odpipetuj 20 μl powyższych mieszanin do modułów nukleokulowych, zgodnie z układem eksperymentalnym, upewniając się, że ciecz jest dostarczana na dno studzienki.
8. Przykryj płytkę nukleokuwetu pokrywką i kilkakrotnie postukaj płytką o twardą powierzchnię, aby zapewnić usunięcie pęcherzyków powietrza.

3. Transfekcyjne centra dystrybucji

1. Włóż płytkę do 96-dołkowej tacki wahadłowej Nucleofector , kliknij Prześlij, a następnie uruchom.
2. Śledź postęp procesu transfekcji na górnym wyświetlaczu; krzyżyk na zielonym tle oznacza udaną transfekcję w tej studni, podczas gdy pasek na czerwonym tle oznacza, że transfekcja się nie powiodła.
3. Po zakończeniu procesu transfekcji wyjmij płytkę i dodaj 80 μl pożywki wzrostowej DC do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
4. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
5. Przenieś objętość 100 μl z nukleokowit do probówek matrycowych zawierających 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej DC, zachowując prawidłową orientację.
6. Usuń i wyrzuć te rurki, w których transfekcja nie nastąpiła.
7. Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 24 godziny lub w innym żądanym odstępie czasu.

4. Infekuj komórki NDV

1. Wyjąć probówki matrycowe z inkubatora do okapu do hodowli komórkowych i probówek basenowych dla każdej próbki doświadczalnej do eppendorfów
2. Delikatnie obrabiać komórki, wirując w wirówce biurkowej przez 5 minut i usunąć supernatant.
3. Zawiesić komórki w pożywce wzrostowej bez surowicy zawierającej NDV przy MOI 1 i inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 45 minut, z eppendorfami luźno pokrytymi w sterylny sposób.
4. Dodaj 900 μl pożywki wzrostowej DC i ponownie inkubuj przez 8-10 godzin.

5. Zbieraj komórki

1. Komórki osadkowe poprzez wirowanie eppendorfów w blacie biurkowym odwirować i usunąć supernatant.
2. Zbieraj komórki do ekstrakcji RNA lub białka zgodnie z protokołem.

6. Reprezentatywne wyniki:

Korzystając z naszego zoptymalizowanego protokołu, transfekowaliśmy DC siRNA ukierunkowanym na RIGI przez 24 godziny, a następnie zainfekowaliśmy komórki NDV (paramyksowirusem wykrytym przez RIG-I), aby stymulować szlak odpowiedzi interferonu. Za pomocą analizy qRT-PCR wykazaliśmy obniżenie genu o 75% na poziomie transkrypcji. Zaobserwowaliśmy również podobne zmniejszenie ekspresji IFNβ, który jest efektorem RIG-I w kaskadzie sygnalizacyjnej IFN. Ponadto zaobserwowaliśmy, że ekspresja IFNβ w niezakażonych, transfekowanych komórkach kontrolnych nie była wykrywalna, podczas gdy ekspresja MxA, genu odpowiedzi IFNβ, była minimalna (Figura 1A).

Przeprowadzono drugą transfekcję DC za pomocą siRNA ukierunkowanego na RIGI, używając wystarczającej liczby komórek, aby uwzględnić analizę Western blot. Tam, gdzie wyniki RT-PCR były podobne do tego, co widzieliśmy wcześniej (62% i 66% zmniejszenie ekspresji RIG-I i IFNβ odpowiednio) (Figura 1B), Western blot badany pod kątem RIG-I ujawnił, że ekspresja tego genu została całkowicie zablokowana (Figura 1C).

Rysunek 1. (A) MoDC transfekowano siRNA ukierunkowanym na RIG-I lub niespecyficznym siRNA GLO, a wpływ na ekspresję RIG-I, IFNβ i MxA określono za pomocą qRT-PCR. W protokole transfekcji wykorzystano specyficzny dla monocytów bufor i program nukleoporacji FF168 (Lonza Walkersville, Inc.) Po inkubacji przez 24 godziny, transfekowane komórki zostały albo zakażone NDV (+), albo pozostawione niezakażone (-). Po kolejnej inkubacji przez 10 godzin pobrano komórki i wyekstrahowano RNA Poziomy transkryptów reprezentują wyniki dwóch powtórzonych eksperymentów. Zaczerpnięte z Bowles et al ¹⁶. (B) MoDC uzyskane z innego kożucha pokrytego, jak użyto na rysunku 1A, zostały ponownie transfekowane siRNA ukierunkowanym na RIG-I lub niespecyficznym siRNA GLO przy użyciu tego samego protokołu transfekcji, co powyżej. Do eksperymentu włączono dodatkową kontrolę przy użyciu nietransfekowanych MoDC. Po 24-godzinnej inkubacji wszystkie komórki zostały zakażone NDV i inkubowane przez kolejne 10 godzin, zanim zostały pobrane zarówno w celu ekstrakcji RNA, jak i białka. Poziomy transkryptów RIG-I, IFNβ i MxA określone za pomocą qRT-PCR reprezentują wyniki dwóch powtórzonych eksperymentów. Zaczerpnięte z Bowles et al ¹⁶. (C) Lizaty z komórek opisanych na rysunku 1B powyżej analizowano za pomocą Western blot. Pasy 1 i 2, lizaty z komórek nietransfekowanych; pasy 3 i 4, lizaty z komórek transfekowanych GLO siRNA; pasy 5 i 6, lizaty z komórek transfekowanych siRNA ukierunkowanym na RIG-I. Próbki zostały zbadane pod kątem RIG-I, a także GAPDH (jako kontrola obciążenia) i zostały uruchomione w dwóch egzemplarzach. Zaczerpnięte z Bowles et al ¹⁶.

Discussion

Wydajna transfekcja naiwnych pierwotnych komórek dendrytycznych jest ważna dla wysokoprzepustowej analizy i inżynierii wstecznej komórkowych szlaków zapalnych w tej kluczowej komórce pośredniczącej w wrodzonym adaptacyjnym przejściu immunologicznym. Jednak większość badaczy uważa, że komórki te są trudne do transfekcji zarówno skutecznie, jak i bez procedury transfekcji wywołującej dojrzewanie komórek przy użyciu standardowych technik transfekcji. Zbadaliśmy, czy te ograniczenia można przezwyciężyć poprzez optymalizację ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa Nucleofector 96-dołkowy wahadłowiec	Lonza Inc.	108S0109	Numer seryjny
Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit	Lonza Inc.	VHPA-2007	zawiera ludzki monocyt 96-dołkowy roztwór nukleofektora, 96-dołkowy suplement oraz nukleokuwety i płytki
RIG-I siRNA	Dharmacon	L-012511-00
GLO siRNA	Dharmacon	D-001600-01-20
RPMI 1640	Invitrogen	11875	Uzupełniony 10% FCS, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μ g / ml streptomycyny do produkcji pożywki wzrostowej DC
DMEM	Invitrogen	11965
L-glutamina	Invitrogen	25030081
Penicylina/streptomycyna	Invitrogen	15070063
Surowica cielęca płodu	Hyklon	3070.03
Komórki dendrytyczne	Nowym Jorku		są oczyszczane z kożuchów za pomocą Procedura standardowa