Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Podsumowanie

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Streszczenie

Komórki dendrytyczne (DCs) można uznać za strażników układu odpornościowego, które odgrywają kluczową rolę w jego inicjacji i odpowiedzi na infekcję¹. Wykrywanie antygenów patogennych przez naiwne DCs odbywa się za pośrednictwem receptorów rozpoznających wzorce (PRRs), które są zdolne do rozpoznawania specyficznych konserwowanych struktur określanych jako patogenowe wzorce molekularne (PAMPS). Wykrycie PAMPs przez DCs wywołuje wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, prowadzącą do ich aktywacji i przekształcenia w dojrzałe DCs. Proces ten charakteryzuje się zazwyczaj produkcją interferonu typu 1 wraz z innymi cytokinami prozapalnymi, zwiększeniem ekspresji markerów powierzchni komórki, takich jak MHCII i CD86, oraz migracją dojrzałych DCs do drenujących węzłów chłonnych, gdzie interakcja z limfocytami T inicjuje adaptacyjną odpowiedź immunologiczną^2,3. W ten sposób DCs łączą wrodzony i adaptacyjny układ odpornościowy.

Zdolność do analizy sieci molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi komórek DC na różne patogeny jest kluczowa dla lepszego zrozumienia regulacji tych szlaków sygnałowych i indukowanych przez nie genów. Powinno to również pomóc w opracowaniu szczepionek opartych na komórkach DC przeciwko chorobom zakaźnym i nowotworom. Jednakże ten kierunek badań był poważnie utrudniony ze względu na trudności w transfekcji pierwotnych komórek DC⁴.

Zazwyczaj stosuje się metody transdukcji wirusowej, takie jak system lentiwirusowy, jednak wiążą się one z wieloma ograniczeniami, m.in. z wysoką złożonością i ryzykiem biologicznym (wraz z powiązanymi kosztami)^5,6,7,8. Ponadto dostarczanie wirusowych produktów genowych zwiększa immunogenność tych przetransdukowanych komórek DC^9,10,11,12. Elektroporacja była stosowana z mieszanymi rezultatami^13,14,15, jednak jesteśmy pierwszymi, którzy zgłaszają użycie wysokoprzepustowego protokołu transfekcji i jednoznacznie wykazują jego użyteczność.

W niniejszym raporcie podsumowujemy zoptymalizowany komercyjny protokół wysokoprzepustowej transfekcji ludzkich pierwotnych komórek dendrytycznych (DC), charakteryzujący się ograniczoną toksycznością komórkową i brakiem dojrzewania DC¹⁶. Wydajność transfekcji (plazmidu GFP) oraz żywotność komórek wyniosły odpowiednio ponad 50% i 70%. Analiza FACS potwierdziła brak wzrostu ekspresji markerów dojrzewania CD86 i MHCII w transfekowanych komórkach, natomiast qRT-PCR nie wykazał nadekspresji IFNβ. Wykorzystując ten protokół elektroporacji, dostarczamy dowodów na skuteczną transfekcję DC za pomocą siRNA oraz efektywny knockdown docelowego genu RIG-I, kluczowego receptora rozpoznawania wirusów^16,17, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Protokół

1. Zaprogramowanie Nucleofektora Amaxa 96 well shuttle

1. Otwórz nowy plik parametrów.
2. Wybierz liczbę studzienek, których będziesz używać do standardowej transfekcji, przeciągając kursor po schemacie płytki 96-dołkowej. Użyj minimum 3 studzienek do złączenia dla każdej próbki eksperymentalnej.
3. Wprowadź kod programu: w części part1 wybierz „FF”, a w części part2 wybierz „168” z menu rozwijanych.
4. Z pola Solution wybierz „Monocyte, human”.
5. W sekcji Control Option wybierz „standard”.
6. Kliknij Apply.
7. Aby uwzględnić kontrolę bez transfekcji, zaznacz na schemacie dodatkowe studzienki zgodnie z potrzebami, następnie w sekcji Control Option wybierz „No Program Control” i kliknij Apply.
8. Zaznacz pozostałe nieużywane studzienki na schemacie płytki i kliknij Undefine.

2. Przygotowanie komórek DC do transfekcji

1. Wszystkie prace należy w miarę możliwości prowadzić w warunkach sterylnych, w komorze do hodowli komórek. Przygotować roztwór do nukleofekcji, dodając suplement do płytek 96-dołkowych do roztworu Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution w stosunku 450 do 2025. Wymieszać i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej. Na każdy dołek wymagane będzie 20μl roztworu do nukleofekcji. Przygotować nadwyżkę w ilości 10%, aby zrekompensować błędy pipetowania.
2. Umieścić wymaganą liczbę modułów nukleokuwet w płytce do nukleokuwet w odpowiedniej orientacji, np. wkładając pierwszy moduł do rzędów 1 i 2.
3. Określić liczbę komórek DC potrzebną do eksperymentu, przyjmując 50,0 komórek na dołek, a następnie osadzić je poprzez wirowanie przy 400g przez 10min. Ostrożnie usunąć nadsącz.
4. Resuspendować komórki w roztworze do nukleofekcji, delikatnie pipetując w górę i w dół kilka razy.
5. Podzielić odpowiednią objętość resuspendowanych komórek do probówek typu eppendorf oznakowanych dla konkretnejy obróbki, np. GLO i RIG-I.
6. Dodać 0.25μg siRNA na 500,0 komórek i wymieszać za pomocą pipety. W próbce kontrolnej bez transfekcji należy zastosować niecelowane siRNA.
7. Nanieść pipetą 20μl powyższych mieszanin do modułów nukleokuwet zgodnie z układem doświadczalnym, upewniając się, że ciecz dotarła do dna dołka.
8. Przykryć płytkę do nukleokuwet pokrywą i kilka razy stuknąć płytką o twardą powierzchnię, aby pomóc w usunięciu pęcherzyków powietrza.

3. Transfekcja komórek DC

1. Włóż płytkę do tacy transportowej Nucleofector 96-well, kliknij Upload, a następnie start.
2. Śledź postępy procesu transfekcji na wyświetlaczu laptopa; czarny krzyżyk na zielonym tle oznacza udaną transfekcję w danej studzce, natomiast czarny pasek na czerwonym tle oznacza niepowodzenie.
3. Po zakończeniu procesu transfekcji wyjmij płytkę i dodaj 80μl pożywki wzrostowej DC do każdej studzki za pomocą pipety wielokanałowej.
4. Inkubuj płytkę przez 10 min w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
5. Przenieś objętość 10μl z nukleokuwet do probówek matrycowych zawierających 10μl uprzednio ogrzanej pożywki wzrostowej DC, zachowując prawidłową orientację.
6. Usuń i zutylizuj probówki, w których nie doszło do transfekcji.
7. Inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 24h lub inny wybrany odstęp czasu.

4. Zakażanie komórek wirusem NDV

1. Przenieść probówki matrycowe z inkubatora do dygestorium do hodowli komórkowych i połączyć probówki dla każdej próbki eksperymentalnej w probówkach typu Eppendorf
2. Gently odwirować komórki w wirówce laboratoryjnej przez 5 min, a następnie usunąć supernatant.
3. Resuspendować komórki w bezzbełkowym medium wzrostowym zawierającym NDV przy MOI wynoszącym 1 i inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 45 min, przy lekko przykrytych w sposób sterylny probówkach Eppendorf.
4. Dodać 90μl medium wzrostowego DC i ponownie inkubować przez 8-10 h.

5. Zbiór komórek

1. Odwirować komórki w wirówce stołowej, aby uzyskać osad, a następnie usunąć nadsącz.
2. Zebrać komórki do ekstrakcji RNA lub białka zgodnie z zastosowanym protokołem.

6. Reprezentatywne wyniki:

Korzystając z naszego zoptymalizowanego protokołu, przeprowadziliśmy transfekcję komórek DC siRNA celującym w RIGI przez 24 h, a następnie zainfekowaliśmy komórki wirusem NDV (paramyksowirusem wykrywanym przez RIG-I), aby pobudzić szlak odpowiedzi interferonowej. Za pomocą analizy qRT-PCR wykazaliśmy obniżenie ekspresji genu o 75% na poziomie transkrypcji. Zaobserwowaliśmy również podobną redukcję ekspresji IFNβ, który jest efektorem downstream RIG-I w kaskadzie sygnalizacyjnej IFN. Ponadto stwierdzono, że ekspresja IFNβ w niezinfekowanych komórkach z transfekcją kontrolną była niewykrywalna, natomiast ekspresja MxA, genu odpowiedzi downstream IFNβ, była minimalna (Rysunek 1A).

Drugą transfekcję komórek DC za pomocą siRNA celującego w RIGI przeprowadzono przy użyciu wystarczającej liczby komórek, aby umożliwić analizę Western blot. Podczas gdy wyniki RT-PCR były zbliżone do wcześniej zaobserwowanych (odpowiednio 62% i 6% wyciszenia ekspresji RIG-I oraz IFNβ) (Rycina 1B), analiza Western blot w kierunku RIG-I wykazała, że ekspresja tego genu została całkowicie zablokowana (Rycina 1C).

Rysunek 1. (A) mMoDC poddano transfekcji albo siRNA celującym w RIG-I, albo nieswoistym siRNA GLO, a następnie zbadano wpływ tych zabiegów na ekspresję RIG-I, IFNβ i MxA wyznaczono za pomocą qRT-PCR. Protokół transfekcji wykorzystywał bufor specyficzny dla monocytów oraz program nukleoporacji FF168 (Lonza Walkersville Inc.). Po 24-godzinnej inkubacji transfektowane komórki zostały zainfekowane NDV (+) lub pozostawiono niezinfekowane (-). Po kolejnej 10-godzinnej inkubacji komórki zebrano i wyekstrahowano RNA. Poziomy transkrypcji stanowią wyniki dwóch powtórzonych eksperymentów. Źródło: Bowles i in. ¹⁶. (B) MoDCs uzyskane z innego buffy coat niż ten użyty do ryciny 1A ponownie poddano transfekcji za pomocą siRNA skierowanego przeciwko RIG-I lub niespecyficznego siRNA GLO, stosując ten sam protokół transfekcji co powyżej. Do eksperymentu włączono dodatkową kontrolę z użyciem nietransfekowanych MoDCs. Po 24-godzinnej inkubacji wszystkie komórki zainfekowano wirusem NDV i inkubowano przez kolejne 10 godzin przed ich zebraniem w celu ekstrakcji RNA i białek. Poziomy transkrypcji RIG-I, IFNβ i MxA wyznaczone za pomocą qRT-PCR przedstawiają wyniki dwóch powtórzonych eksperymentów. Zaczerpnięto z Bowles i wsp. ¹⁶. (C) Lizaty komórek opisanych powyżej na rysunku 1B przeanalizowano metodą Western blot. Ścieżki 1 i 2: lizaty z komórek nieprzetransfekowanych; ścieżki 3 i 4: lizaty z komórek przetransfekowanych siRNA przeciwko GLO; ścieżki 5 i 6: lizaty z komórek przetransfekowanych siRNA skierowanym przeciwko RIG-I. Próbki poddano detekcji w kierunku RIG-I oraz GAPDH (jako kontroli ładowania); analizę przeprowadzono w duplikacie. Źródło: Bowles i wsp. ¹⁶.

Dyskusja

Wydajna transfekcja naiwnych pierwotnych komórek dendrytycznych jest istotna dla analiz wysokoprzepustowych oraz inżynierii wstecznej komórkowych szlaków zapalnych w tych kluczowych komórkach pośredniczących w przejściu między odpornością wrodzoną a adaptacyjną. Jednak większość badaczy stwierdza, że komórki te są trudne do efektywnej transfekcji przy użyciu standardowych technik, a sama procedura często indukuje dojrzewanie komórek. Zbadaliśmy, czy ograniczenia te można przezwyciężyć poprzez wysokoprzepustową optymaliza...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle	Lonza Inc.	108S0109	Numer seryjny
Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit	Lonza Inc.	VHPA-2007	Zawiera roztwór do nukleofekcji monocytów ludzkich do płytek 96-dołkowych, suplement do płytek 96-dołkowych oraz nukleokuwety i płytki
RIG-I siRNA	Dharmacon	L-012511-00
GLO siRNA	Dharmacon	D-001600-01-20
RPMI 1640	Invitrogen	11875	Uzupełnione o 10% FCS, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w celu przygotowania pożywki wzrostowej dla komórek dendrytycznych
DMEM	Invitrogen	11965
L-glutamina	Invitrogen	25030081
Penicylina/streptomycyna	Invitrogen	15070063
Płodowa surowica bydlęca	Hyclone	3070.03
Komórki dendrytyczne	New York Blood center		Komórki DC są oczyszczane z warstwy leukocytarnej zgodnie ze standardową procedurą