Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach

Podsumowanie

Zakażenie *Trichuris muris* jest jelitowym modelem odporności Th2, w którym myszy oporne generują ochronną odpowiedź Th2, natomiast myszy podatne generują patologiczną odpowiedź Th1.

Streszczenie

Trichuris muris jest naturalnym patogenem myszy, biologicznie i antygenowo podobnym do gatunków Trichuris zakażających ludzi oraz zwierzęta hodowlane¹. Jaja zakaźne podaje się drogą zgłębnika do przełyku; wykluwają się one w końcowym odcinku jelita cienkiego, naciekają komórki nabłonka jelitowego (IECs) wyściełające krypty kątnicy i proksymalnej części okrężnicy, a po osiągnięciu dojrzałości nicienie uwalniają jaja do środowiska¹. Model ten jest potężnym narzędziem do badania czynników kontrolujących aktywację limfocytów T pomocniczych (Th) CD4⁺ oraz zmian w nabłonku jelitowym. Odpowiedź immunologiczna występująca u opornych szczepów inbredowych, takich jak C57BL/6 i BALB/c, charakteryzuje się polaryzacją cytokin Th2 (IL-4, IL-5 i IL-13) oraz wydaleniem nicieni, podczas gdy cytokiny związane z Th1 (IL-12, IL-18, IFN-γ) sprzyjają przewlekłym infekcjom u genetycznie podatnych myszy AKR/J^2-6. Cytokiny Th2 promują zmiany fizjologiczne w mikrośrodowisku jelitowym, w tym szybką wymianę komórek IECs, różnicowanie komórek kubkowych, rekrutację oraz zmiany w przepuszczalności nabłonka i skurczach mięśni gładkich, co łącznie przyczynia się do wydalenia nicieni^7-15. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy protokół namnażania jaj Trichuris muris, które mogą być wykorzystane w kolejnych eksperymentach. Przedstawiamy również przykładowy pobór materiału eksperymentalnego wraz z sugestiami dotyczącymi analiz poinfekcyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten dostarczy badaczom podstawowych narzędzi do przeprowadzenia modelu infekcji myszy Trichuris muris, który może być wykorzystany do rozstrzygania kwestii dotyczących preferencji Th w przewodzie pokarmowym oraz funkcji efektorowych IECs.

Protokół

1. Propagacja jaj Trichuris muris

1. Aby uzyskać nowe partie jaj Trichuris muris, należy zainfekować 20-30 myszy z niedoborem odporności (np. NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) lub 129S6/SvEvTac-Rag2^tm1Fwa (RAG2^-/-)) lub myszy podatne genetycznie (np. AKR/J) w wieku 6-8 tygodni, podając drogą zgłębnika doustnie około 300 jaj Trichuris muris.
2. Po 32–35 dniach myszy należy uśmiercić poprzez uduszenie CO₂.
3. Odsłonić stronę brzuszną myszy i zwilżyć brzuch 70% etanolem.
4. Za pomocą pęsety chwycić skórę brzucha i wykonać niewielkie nacięcie nożyczkami. Rozciąć skórę, aby odsłonić zawartość jamy brzusznej.
5. Zidentyfikować kątnicę oraz proksymalną część jelita grubego, a następnie je usunąć.
6. Umieścić kątnicę i proksymalną część jelita grubego w szalce Petri o średnicy 10 cm zawierającej DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 500 U/ml penicyliny i 500 μg/ml streptomycyny (P/S). Rozciąć kątnicę, aby odsłonić światło jelita i nicienie. Za pomocą pęsety przenieść kątnicę do zlewki z solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS) i delikatnie wstrząsać w celu usunięcia kału.
7. Przenieść kątnicę z powrotem do szalki Petri i za pomocą gładkiej, zakrzywionej pęsety (Roboz RS-5047) delikatnie wyciągnąć nicienie i umieścić je w dołku płytki 6-dołkowej zawierającej 5 ml DMEM + P/S.
8. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich myszy.
9. Umieścić płytkę 6-dołkową w pojemniku typu Tupperware z wilgotnym ręcznikiem papierowym w celu utrzymania wilgotności i inkubować w 37°C przez 4 h.
10. Po 4 h usunąć nicienie za pomocą gładkiej, zakrzywionej pęsety i rozdzielić je do 2 nowych dołków płytki 6-dołkowej zawierającej 5 mL DMEM + P/S. Zebrać zawartość oryginalnego dołka i przenieść do probówki typu Falcon o pojemności 15 ml. Wirować probówkę przy 3000 rpm, a następnie usunąć i zachować nadsącz jako antygen 4-godzinny (może być stosowany do restymulacji komórek po dializie przeciwko PBS, gdzie typowa wydajność białka wynosi 10-20 mg na 20 myszy) i resuspender osad zawierający jaja w autoklawowanej wodzie z kranu.
11. Ponownie umieścić płytkę 6-dołkową w 37°C na noc. Usunąć i zutylizować nicienie. Zebrać zawartość dołków do probówki typu Falcon i wirować przy 3000 rpm przez 5 min. Usunąć nadsącz i zachować go jako antygen nocny (może być stosowany do testów ELISA dla izotypów przeciwciał specyficznych dla Ag Trichuris po dializie przeciwko PBS, gdzie typowa wydajność białka wynosi 10-20 mg na 20 myszy) i resuspender osad zawierający jaja w autoklawowanej wodzie z kranu.
12. Połączyć jaja zebrane po 4 h oraz po nocy i przefiltrować je przez sito 70 μm, aby usunąć pozostałości nicieni, a następnie przenieść do kolby o powierzchni 75 cm². Przechowywać kolbę w ciemnym miejscu, owiniętą folią aluminiową, przez 6 tygodni w temperaturze pokojowej (RT).
13. Przepłukać jaja autoklawowaną wodą z kranu i resuspender do stężenia 50 żywych jaj w 50 μl. W tym celu wirować jaja przy 3000 rpm przez 5 min i resuspender w ˜50 ml sterylnej wody z kranu. Pobrać 50 μl zawiesiny jaj i nanieść na szkiełko przedmiotowe. Przy powiększeniu 40x policzyć liczbę żywych jaj zembrionowanych w 50 μl. Rozcieńczyć zawiesinę tak, aby uzyskać 50 żywych jaj w 50 μl. Obrazy żywych jaj można znaleźć w badaniu Koppera i Mansfielda¹⁶.

2. Ostra infekcja myszy eksperymentalnych jajami Trichuris muris (200 jaj/mysz)

1. Dokładnie resuspender jaja i pobrać objętość wystarczającą do podania zwierzętom w ilości X 2 (np. dla 10 myszy: 200 μl x 10 myszy x 2 = 4 ml zawiesiny jaj) i umieścić je w probówce typu snap cap o pojemności 14 ml.
2. Odwrócić probówkę 14 ml, aby wymieszać zawartość. Nabrać 200 μl zawiesiny jaj do strzykawki 1 ml z odpowiednio dobraną igłą do podawania (dla myszy o masie 25 g zastosowano igły 18G o długości 1 1/2"). Jedną ręką ująć mysz za kark, a drugą podać jaja drogą zgłębnika przełykowego.
3. Odczekać 21 dni.

3. Pozyskiwanie materiału eksperymentalnego

1. W 21. dniu uśmierć myszy za pomocą CO₂.
2. Pobierz krew od myszy poprzez nakłucie serca do strzykawki nieheparynowanej i przechowuj w temperaturze 4°C. Następnego dnia wyizoluj surowicę i zamroź w temperaturze -20°C. Surowicę można wykorzystać do wykrywania specyficznych dla Trichuris przeciwciał IgG i IgE metodą ELISA.
3. Odsłoń stronę brzuszną myszy i zwilż brzuch 70% etanolem.
4. Za pomocą pincety chwyć skórę brzucha i wykonaj niewielkie nacięcie nożyczkami. Przetnij skórę i leżącą pod nią błonę, aby odsłonić treść jamy brzusznej.
5. Zidentyfikuj jelito cienkie, kątnicę i jelito grube. Chwyć kątnicę pincetą i wyciągnij z jamy brzusznej. Drugą pincetą odsuń jelito cienkie w prawą stronę, odsłaniając węzły chłonne krezkowe (mLNs). Usuń mLNs, uważając, aby nie przeciąć jelit, i umieść je w probówce typu Falcon 15 ml zawierającej 2 ml pożywki. Jeśli jest to wymagane, można je przetworzyć i restymulować in vitro (4x10⁶/ml w 1 ml na płytkach 24-dołkowych z 1 μg/ml αCD3/CD28 lub z 50μg/ml 4h Ag Trichuris) przez 72 h w celu analizy cytokin metodą ELISA i cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej.
6. Wytnij kątnicę i jelito grube.
7. Za pomocą pincety usuń grudki kału z dystalnej części jelita grubego i umieść je w probówce Axygen 2 ml. Zamroź w temperaturze -20°C. Grudki kału można analizować metodą western blot w celu oznaczenia ekspresji cząsteczki podobnej do rezystyny-β (RELM-β).
8. Usuń koniec kątnicy (˜0.5 cm). Aby usunąć kał, przytrzymaj koniec kątnicy pincetą i przepłucz PBS za pomocą strzykawki 3 ml z igłą 22G w szalce Petriego. Umieść w świeżym 4% paraformaldehydzie w probówce Falcon 5 ml z zatrzaskową zakrętką. Przechowuj w temperaturze 4°C. Próbki te można zalać parafiną, pociąć i nanieść na szkiełka do analizy histologicznej.
9. Usuń fragment proksymalnej części jelita grubego (˜ 1 cm) do analizy RNA. Umieść próbkę w probówce Axygen 2 ml z 500 μl RNAlater. Przechowuj w temperaturze 4°C. Próbki te można analizować pod kątem ekspresji mRNA metodą qPCR.
10. Umieść resztę kątnicy w opisanej szalce Petriego i zamroź w temperaturze -20°C.

4. Wyliczanie nicieni Trichuris muris w kątnicy

1. Wyjmij kątnicę z zamrażarki i umieść ją w szalce Petri zawierającej ˜5 ml wody.
2. Za pomocą nożyczek rozetnij kątnicę, aby odsłonić światło jelita.
3. Przytrzymaj kątnicę pęsetą i energicznie nią potrząśnij, aby usunąć większość mas kałowych.
4. Przenieś kątnicę do drugiej szalki Petri z wodą i za pomocą gładkiej zakrzywionej pęsety delikatnie zeskrob IEC z tkanki podścielistej.
5. Przenieś kątnicę do nowej szalki Petri z wodą i energicznie zeskrob pozostałą tkankę pęsetą, rozrywając ją na małe kawałki.
6. Użyj mikroskopu dissectingowego, aby policzyć wszystkie nicienie we wszystkich 3 szalkach Petri. Po znalezieniu nicienia usuń go z szalki, aby uniknąć podwójnego liczenia tego samego osobnika. Jeśli nicienie są uszkodzone (np. przełamane na pół), licz tylko grube lub cienkie końce, aby uzyskać dokładny wynik.

5. Reprezentatywne wyniki

Model infekcji Trichuris muris pozwala badaczom na ilościowe określenie obciążenia pasożytami i systemowych odpowiedzi immunologicznych, a także na histologiczne zbadanie odpowiedzi zapalnej w obrębie dystalnej części kątnicy. Po odsłonięciu światła pobranej kątnicy można policzyć nicienie Trichuris przy użyciu mikroskopu stereoskopowego (Rycina 1A-B). Parametry odporności na Trichuris obejmują również przełączanie izotypów przeciwciał na IgG1 (związane z odpornością typu Th2) u zwierząt opornych oraz na IgG2a (związane z odpornością typu Th1) u zwierząt podatnych (Rycina 1C). Ekspresja białka specyficznego dla komórek kubkowych, cząsteczki przypominającej rezystynę-β (RELM-β), wiąże się z eliminacją Trichuris i jest wykrywalna za pomocą analizy Western blot (Rycina 2). Dystalna część kątnicy może być barwiona metodą Periodic Acid-Schiff (PAS) w celu oceny odpowiedzi komórek kubkowych oraz stopnia stanu zapalnego jelit w odpowiedzi na infekcję (Rycina 3).

Rysunek 1. Ilościowe określenie odporności na Trichuris muris. (A) Myszy odporne (B6) usuwają Trichuris muris do 21 dnia po zakażeniu. W przeciwieństwie do nich, myszy podatne (AKR/J) ulegają przewlekłemu zakażeniu Trichuris, co prowadzi do utrwalenia się pasożyta. Każdy słupek przedstawia średnią ± SEM dla 4-8 zwierząt na grupę. (B) Robaki są liczone przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Górny panel pokazuje robaki w izolacji, dolny panel pokazuje robaki w obecności komórek nabłonka jelitowego (IECs) i kału. (C) Miana swoistych dla Trichuris przeciwciał IgG2a są oznaczane metodą ELISA z rozcieńczonego surowicy (rozcieńczenie 1:2, zaczynając od 1:20 i kończąc na 1:2560) na płytkach pokrytych antygenem wydzielniczym Trichuris (O/N Ag, 5 μg/ml). Podatne myszy AKR/J mają wyraźnie wyższe poziomy swoistych dla Trichuris przeciwciał IgG2a w surowicy niż odporne myszy B6.

Rysunek 2. Eliminacja Trichuris muris wiąże się z ekspresją białka RELM-β specyficznego dla komórek kubkowych⁷. Produkcję RELM-β można wykryć w pelletach kału z myszy odpornych (B6) zakażonych Trichuris, ale nie u myszy podatnych (AKR/J), za pomocą analizy western blot. Każda ścieżka reprezentuje pojedyncze zwierzę; (N)=naiwne, (Tm)=myszy zakażone Trichuris 21 dni wcześniej.

Rycina 3. Badanie histologiczne dystalnej części kątnicy po zakażeniu Trichuris. Przekroje dystalnej części kątnicy o grubości 5-7 μm barwione metodą PAS. Hiperplazja komórek kubkowych oraz produkcja śluzu są widoczne u myszy odpornych (B6), ale nie u myszy podatnych (AKR/J) po zakażeniu Trichuris.

Dyskusja

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje standardową ostrą infekcję Trichuris muris wysoką dawką, którą badacz może zmodyfikować zgodnie z potrzebami. Na przykład myszy mogą zostać uśmiercone, a tkanki pobrane w innych dniach. Aby stwierdzić, czy u myszy prawidłowo rozwinęła się pełna liczba pasożytów, można je uśmiercić w 14. dniu, kiedy wszystkie myszy powinny nosić obciążenie wynoszące około 200 nicieni. Myszy mogą być również zainfekowane przez 32 dni, w których każdy wykryty nicień osiągnie dojrzałość i pozos...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igły do karmienia zwierząt (18 x 1)½")	Popper & Sons, Inc.	7912
Gładkie pęsety zakrzywione	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5047
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11965
NOD.Cg-PrkdcSCID (ciężki złożony niedobór odporności) Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)	Jackson Laboratory	005557	Wykorzystano powyższe myszy, jednak odpowiednie będą wszelkie myszy niedoborowe lub szczepy podatne.
RNAlater	Qiagen	76104
probówki 2 ml	Axygen Scientific	MCT-200-C
probówki 15 ml	Falcon BD	352096
płytki 6-dołkowe	Falcon BD	353046
Paraformaldehyd	Nauki o mikroskopii elektronowej	15710
α-RELMβ przeciwciało	PeproTech Inc	0694270Rb