Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach

16K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2774

⸱

24 maja 2011

 ,  ,  , 
1The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zakażenie *Trichuris muris* jest jelitowym modelem odporności Th2, w którym myszy oporne generują ochronną odpowiedź Th2, natomiast myszy podatne generują patologiczną odpowiedź Th1.

Streszczenie

Trichuris muris jest naturalnym patogenem myszy, biologicznie i antygenowo podobnym do gatunków Trichuris zakażających ludzi oraz zwierzęta hodowlane1. Jaja zakaźne podaje się drogą zgłębnika do przełyku; wykluwają się one w końcowym odcinku jelita cienkiego, naciekają komórki nabłonka jelitowego (IECs) wyściełające krypty kątnicy i proksymalnej części okrężnicy, a po osiągnięciu dojrzałości nicienie uwalniają jaja do środowiska1. Model ten jest potężnym narzędziem do badania czynników kontrolujących aktywację limfocytów T pomocniczych (Th) CD4+ oraz zmian w nabłonku jelitowym. Odpowiedź immunologiczna występująca u opornych szczepów inbredowych, takich jak C57BL/6 i BALB/c, charakteryzuje się polaryzacją cytokin Th2 (IL-4, IL-5 i IL-13) oraz wydaleniem nicieni, podczas gdy cytokiny związane z Th1 (IL-12, IL-18, IFN-γ) sprzyjają przewlekłym infekcjom u genetycznie podatnych myszy AKR/J2-6. Cytokiny Th2 promują zmiany fizjologiczne w mikrośrodowisku jelitowym, w tym szybką wymianę komórek IECs, różnicowanie komórek kubkowych, rekrutację oraz zmiany w przepuszczalności nabłonka i skurczach mięśni gładkich, co łącznie przyczynia się do wydalenia nicieni7-15. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy protokół namnażania jaj Trichuris muris, które mogą być wykorzystane w kolejnych eksperymentach. Przedstawiamy również przykładowy pobór materiału eksperymentalnego wraz z sugestiami dotyczącymi analiz poinfekcyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten dostarczy badaczom podstawowych narzędzi do przeprowadzenia modelu infekcji myszy Trichuris muris, który może być wykorzystany do rozstrzygania kwestii dotyczących preferencji Th w przewodzie pokarmowym oraz funkcji efektorowych IECs.

Protokół

1. Propagowanie jaj Trichuris muris

  1. Aby uzyskać nowe partie jaj Trichuris muris, zakaź 20-30 myszy z niedoborem odporności (np. NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) lub 129S6/SvEvTac-Rag2tm1Fwa (RAG2-/-)) lub myszy podatne genetycznie (np. AKR/J) w wieku 6-8 tygodni, podając doustnie za pomocą zgłębnika około 30 jaj Trichuris muris.
  2. Po 32–35 dniach uśmierć myszy poprzez uduszenie CO2.
  3. Odsłoń stronę brzuszną myszy i zwilż brzuch 70% etanolem.
  4. Używając pęsety, chwyć skórę brzucha i wykonaj niewielkie nacięcie nożyczkami. Rozetnij skórę, aby odsłonić zawartość jamy brzusznej.
  5. Zidentyfikuj kątnicę oraz proksymalną część jelita grubego, a następnie usuń je.
  6. Umieść kątnicę i proksymalną część jelita grubego w 10 cm szalce Petri zawierającej DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (P/S). Rozetnij kątnicę, aby odsłonić światło jelita i nicienie. Używając pęsety, przełóż kątnicę do zlewki z solą fizjologiczną (PBS) i delikatnie wstrząśnij, aby usunąć kał.
  7. Przełóż kątnicę z powrotem do szalki Petri i za pomocą gładkiej zakrzywionej pęsety (Roboz RS-5047) delikatnie wyciągnij nicienie, umieszczając je w studni płytki 6-dołkowej zawierającej 5 ml DMEM + P/S.
  8. Powtórz ten proces dla wszystkich myszy.
  9. Włóż płytkę 6-dołkową do pojemnika Tupperware z wilgotnym ręcznikiem papierowym w celu utrzymania wilgotności i inkubuj w temperaturze 37°C przez 4 h.
  10. Po 4 h usuń nicienie za pomocą gładkiej zakrzywionej pęsety i rozdziel je do 2 nowych studni płytki 6-dołkowej zawierającej 5 mL DMEM + P/S. Zbierz zawartość oryginalnej studni i przelej do probówki Falcon 15 ml. Wirować probówkę przy 30 rpm; odseparuj i zachowaj supernatant jako antygen 4-godzinny (może być użyty do restymulacji komórek po dializie przeciwko PBS; typowa wydajność białka wynosi 10-20 mg na 20 myszy), a osad zawierający jaja resuspenderuj w autoklawowanej wodzie z kranu.
  11. Włóż płytkę 6-dołkową ponownie do temperatury 37°C na noc. Usuń i zutylizuj nicienie. Zbierz zawartość studni do probówki Falcon i wiruj przy 30 rpm przez 5 min. Usuń supernatant i zachowaj go jako antygen nocny (może być użyty do testów ELISA izotypów przeciwciał specyficznych dla Ag Trichuris po dializie przeciwko PBS; typowa wydajność białka wynosi 10-20 mg na 20 myszy), a osad zawierający jaja resuspenderuj w autoklawowanej wodzie z kranu.
  12. Połącz jaja zebrane po 4 h i po nocy, a następnie przefiltruj je przez sito 70 μm w celu usunięcia pozostałości nicieni i przenieś do kolby o powierzchni 75 cm2. Przechowuj kolbę w ciemnym miejscu, owiniętą folią, przez 6 tygodni w temperaturze pokojowej (RT).
  13. Przemyj jaja autoklawowaną wodą z kranu i resuspenderuj w stężeniu 50 żywych jaj w 50 μl. Aby to osiągnąć, wirować jaja przy 30 rpm przez 5 min i resuspenderuj w ˜50 ml sterylnej wody z kranu. Pobierz 50 μl zawiesiny jaj i umieść na szkiełku przedmiotowym. Przy powiększeniu 40x policz liczbę żywych jaj zembrionowanych w 50 μl. Rozcieńcz zawiesinę, aby uzyskać 50 żywych jaj w 50 μl. Obrazy żywych jaj znajdują się w badaniu Kopper i Mansfield16.

2. Ostra infekcja myszy eksperymentalnych jajami Trichuris muris (20 jaj/mysz)

  1. Dokładnie resuspendować jaja i pobrać objętość wystarczającą do podania liczbie myszy pomnożonej przez 2 (np. dla 10 myszy: 20 μl x 10 myszy x 2 = 4 ml zawiesiny jaj) i umieścić je w probówce z nakrętką typu snap cap o pojemności 14 ml.
  2. Odwrócić probówkę 14 ml, aby wymieszać zawartość. Nabrać 20 μl zawiesiny jaj do strzykawki 1 ml z igłą do karmienia o odpowiednim rozmiarze (dla myszy o masie 25 g zastosowano igły 18G o długości 1 1/2"). Jedną ręką unieruchomić mysz za kark, a drugą podać jaja poprzez zgłębnik dożylny.
  3. Odczekać 21 dni.

3. Zbiór materiału eksperymentalnego

  1. W 21. dniu należy poddać myszy eutanazji za pomocą CO2.
  2. Pobrać krew od myszy poprzez punkcję serca do strzykawki bez heparyny i przechowywać w temperaturze 4°C. Następnego dnia wyizolować surowicę i zamrozić w temperaturze -20°C. Surowica może zostać wykorzystana do wykrywania przeciwciał IgG i IgE specyficznych dla Trichuris metodą ELISA.
  3. Odsłonić stronę brzuszną myszy i zwilżyć brzuch 70% etanolem.
  4. Za pomocą pęsety chwycić skórę brzucha i wykonać niewielkie nacięcie nożyczkami. Przeciąć skórę oraz leżącą pod nią błonę, aby odsłonić zawartość jamy brzusznej.
  5. Zidentyfikować jelito cienkie, ślepa kiszka i jelito grube. Chwycić ślepą kiszkę pęsetą i wyciągnąć z jamy brzusznej. Drugą pęsetą odsunąć jelito cienkie w prawo, odsłaniając węzły chłonne krezkowe (mLNs). Usunąć mLNs, uważając, aby nie przeciąć jelit, i umieścić w probówce Falcon 15 ml zawierającej 2 ml pożywki. Jeśli jest to wymagane, można je przetworzyć i restymulować in vitro (4x106/ml w 1 ml na płytkach 24-dołkowych z 1 μg/ml αCD3/CD28 lub z 50μg/ml 4h Ag Trichuris) przez 72 h w celu analizy cytokin metodą ELISA i przepływowej cytometrii wewnątrzkomórkowej.
  6. Wyciąć ślepą kiszkę i jelito grube.
  7. Za pomocą pęsety usunąć grudki kału z dystalnej części jelita grubego i umieścić w probówce Axygen 2 ml. Zamrozić w temperaturze -20°C. Grudki kału można analizować metodą western blot pod kątem ekspresji cząsteczki podobnej do rezystyny-β (RELM-β).
  8. Usunąć końcówkę ślepej kiszki (˜0.5 cm). Aby usunąć treści kałowe, przytrzymać końcówkę ślepej kiszki pęsetą i wypłukać PBS-em za pomocą strzykawki 3 ml i igły 2G w szalce Petriego. Umieścić w świeżym 4% paraformaldehydzie w probówce Falcon 5 ml z nakrętką typu snap cap. Przechowywać w temperaturze 4°C. Próbki te można zalać parafiną, pociąć na skrawki i zamontować na szkiełkach do analizy histologicznej.
  9. Wyciąć fragment proksymalnej części jelita grubego (˜ 1 cm) do analizy RNA. Umieścić próbkę w probówce Axygen 2 ml z 50 μl RNAlater. Przechowywać w temperaturze 4°C. Próbki te można analizować pod kątem ekspresji mRNA metodą qPCR.
  10. Umieścić resztę ślepej kiszki w opisanej szalce Petriego i zamrozić w temperaturze -20°C.

4. Wyliczanie nicieni Trichuris muris w kątnicy

  1. Wyjmij kątnicę z zamrażarki i umieść ją w szalce Petri zawierającej ˜5 ml wody.
  2. Używając nożyczek, rozetnij kątnicę, aby odsłonić światło jelita.
  3. Przytrzymaj kątnicę pęsetą i energicznie nią potrząśnij, aby usunąć większość treści kałowej.
  4. Przenieś kątnicę do drugiej szalki Petri z wodą i za pomocą gładkiej zakrzywionej pęsety delikatnie zeskrob IEC z tkanki podścielistej.
  5. Przenieś kątnicę do nowej szalki Petri z wodą i energicznie zeskrob pozostałą tkankę pęsetą, rozrywając ją na małe kawałki.
  6. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby policzyć wszystkie nicienie we wszystkich 3 szalkach Petri. Po znalezieniu nicienia usuń go z szalki, aby uniknąć podwójnego przeliczenia tego samego osobnika. W przypadku uszkodzenia nicieni (np. przerwanie na pół), licz tylko grube lub cienkie końce, aby uzyskać dokładną liczbę.

5. Reprezentatywne wyniki

Model infekcji Trichuris muris pozwala badaczom na ilościowe określenie obciążenia pasożytami i systemowych odpowiedzi immunologicznych, a także na histologiczne zbadanie odpowiedzi zapalnej w obrębie dystalnej części kątnicy. Po odsłonięciu światła pobranej kątnicy, liczbę nicieni Trichuris można określić przy użyciu mikroskopu stereoskopowego (Rycina 1A-B). Parametry odporności na Trichuris obejmują również przełączenie izotypu przeciwciał na IgG1 (związane z odpornością typu Th2) u zwierząt opornych oraz na IgG2a (związane z odpornością typu Th1) u zwierząt podatnych (Rycina 1C). Ekspresja specyficznego dla komórek kubkowych białka RELM-β (resistin-like molecule-β) jest związana z eliminacją Trichuris i może być wykryta za pomocą analizy Western blot (Rycina 2). Dystalna część kątnicy może zostać zabarwiona metodą Periodic Acid-Schiff (PAS) w celu oceny odpowiedzi komórek kubkowych oraz stopnia zapalenia jelit w odpowiedzi na infekcję (Rycina 3).

Porównanie obciążenia pasożytniczego, analiza danych wykresów, obrazy mikroskopowe nicieni, eksperyment z rozcieńczeniami.
Rycina 1. Ilościowe określanie odporności na Trichuris muris(A) Myszy oporne (B6) wydalają *Trichuris muris* do 21. dnia po zakażeniu. W przeciwieństwie do nich, myszy podatne (AKR/J) ulegają chronicznemu zakażeniu Trichurisco skutkuje kolonizacją organizmu przez pasożyty. Każdy słupek przedstawia średnią ± SEM dla 4–8 zwierząt w grupie. (B) Liczenie nicieni przeprowadzono przy użyciu mikroskopu stereotypowego. Górny panel przedstawia nicienie w izolacji, dolny panel przedstawia nicienie w obecności IEC i kału. (C) Trichurismiana swoistych przeciwciał IgG2a określa się za pomocą testu ELISA z użyciem rozcieńczonej surowicy (rozcieńczenie 1:2, zaczynając od rozcieńczenia 1:20 i kończąc na 1:2560) na płytkach pokrytych produktami wydzielniczymi Trichuris antygen (antygen O/N, 5 μg/ml). Podatne myszy szczepu AKR/J wykazują znacznie wyższe poziomy Trichuris-specyficzne IgG2a w surowicy niż odporne myszy B6.

Western blot; porównanie ekspresji białek; B6 vs AKR; traktowanie N vs Tm; biologia molekularna.
Rysunek 2. Klirens Trichuris muris jest powiązane z ekspresją specyficznego dla komórek kubkowych białka RELM-β7Produkcję RELM-β można wykryć w odchodach z Trichuris-zakażonych myszy opornych (B6), ale nie podatnych (AKR/J) za pomocą analizy western blot. Każda ścieżka reprezentuje jedno zwierzę, (N)=naiwne, (Tm)=21-dniowe Trichuris zakażone myszy.

Analiza histologiczna jelita grubego myszy B6 i AKR; grupa naiwna i zakażona Trichuris; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 3. Badanie histologiczne dystalnej części kątnicy po Trichuris zakażenie. 5-7 μm przekroje dystalnej części kątnicy barwione metodą PAS. Hiperplazja komórek kubkowych oraz produkcja śluzu są widoczne u myszy opornych (B6), ale nie u myszy podatnych (AKR/J) po Trichuris zakażenie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje standardową ostrą infekcję Trichuris muris wysoką dawką, którą badacz może zmodyfikować zgodnie z potrzebami. Na przykład myszy mogą zostać uśmiercone, a tkanki pobrane w innych dniach. Aby stwierdzić, czy u myszy prawidłowo rozwinęła się pełna liczba pasożytów, można je uśmiercić w 14. dniu, kiedy wszystkie myszy powinny nosić obciążenie wynoszące około 200 nicieni. Myszy mogą być również zainfekowane przez 32 dni, w których każdy wykryty nicień osiągnie dojrzałość i pozos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez The University of British Columbia.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Canadian Institutes of Health Research (MSH-95368, MOP-89773 oraz MOP-106623 dla C.Z.) i Canada Foundation for Innovation. S.C.M. jest laureatem stypendium podoktorskiego CIHR/Canadian Association of Gastroenterology. C.Z. jest nowym badaczem (New Investigator) w CIHR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły do karmienia zwierząt (18 x 1)½")Popper & Sons, Inc.7912
Gładkie pęsety zakrzywioneRoboz Surgical Instruments Co.RS-5047
DMEMGIBCO, by Life Technologies11965
NOD.Cg-PrkdcSCID (ciężki złożony niedobór odporności) Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Jackson Laboratory005557Wykorzystano powyższe myszy, jednak odpowiednie będą wszelkie myszy niedoborowe lub szczepy podatne.
RNAlaterQiagen76104
probówki 2 mlAxygen ScientificMCT-200-C
probówki 15 mlFalcon BD352096
płytki 6-dołkoweFalcon BD353046
ParaformaldehydNauki o mikroskopii elektronowej15710
α-RELMβ przeciwciałoPeproTech Inc0694270Rb

Bibliografia

  1. Cliffe, L. J., Grencis, R. K. The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection. Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).
  2. Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection. J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).
  3. Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Th1 and Th2 cells and immunity to intestinal helminths. Chem. Immunol. 71, 192-208 (1998).
  4. Bancroft, A. J., McKenzie, A. N., Grencis, R. K. A critical role for IL-13 in resistance to intestinal nematode infection. J. Immunol. 160, 3453-3461 (1998).
  5. Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13. J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).
  6. Owyang, A. M. Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract. J. Exp. Med. 203, 843-849 (2006).
  7. Artis, D. RELMβ/FIZZ2 is a goblet cell-specific immune-effector molecule in the gastrointestinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13596-13600 (2004).
  8. Datta, R. Identification of novel genes in intestinal tissue that are regulated after infection with an intestinal nematode parasite. Infect. Immun. 73, 4025-4033 (2005).
  9. Cliffe, L. J. Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion. Science. 308, 1463-1465 (2005).
  10. Artis, D. New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes. Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).
  11. Finkelman, F. D. Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models. Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).
  12. Grencis, R. K. Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection. Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).
  13. Khan, W. I. Modulation of intestinal muscle contraction by interleukin-9 (IL-9) or IL-9 neutralization: correlation with worm expulsion in murine nematode infections. Infect. Immun. 71, 2430-2438 (2003).
  14. Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection. Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).
  15. Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).
  16. Kopper, J. J., Mansfield, L. S. Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse. Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).
  17. Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response. Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

podanie doustne przez zg bnikliczba paso yt ww z y ch onne krezkowetkanka lepego jelitakom rka kubkowaWestern blotanaliza qPCRanaliza histologiczna
Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.