Artykuł metodologiczny

Generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących

DOI:

10.3791/2785

⸱

2 czerwca 2011

 ,  ,  , 
1Molecular and Cell Biology Program, Ohio University, 2Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, Ohio University, 3Department of Biomedical Engineering, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w stronę organów odpornościowych, aby zaprezentować przetworzone antygeny limfocytom T. Markowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych organach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DCs) są profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen (APCs), które występują w tkankach obwodowych oraz w narządach immunologicznych, takich jak grasica, szpik kostny, śledziona, węzły chłonne i kępki Peyera 1-3. Komórki dendrytyczne obecne w tkankach obwodowych monitorują organizm pod kątem obecności antygenów, które następnie pochłaniają, przetwarzają i prezentują na swojej powierzchni w kontekście cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej (MHC). Następnie obciążone antygenem komórki dendrytyczne migrują do narządów immunologicznych, gdzie prezentują przetworzony antygen limfocytom T, wywołując specyficzne odpowiedzi immunologiczne. Jednym ze sposobów oceny zdolności migracyjnych komórek dendrytycznych jest ich znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi 4.

W niniejszym opracowaniu demonstrujemy zastosowanie fluorescencyjnych nanokryształów Qdot do znakowania komórek dendrytycznych (DC) pochodzących z szpiku kostnego myszy. Zaletą takiego znakowania jest fakt, że nanokryształy Qdot charakteryzują się stabilną i trwałą fluorescencją, co czyni je idealnymi do wykrywania znakowanych komórek w odzyskanym materiale tkankowym. Aby to osiągnąć, w pierwszej kolejności komórki zostaną wyizolowane ze szpiku kostnego myszy i hodowane przez 8 dni w obecności czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów w celu indukcji różnicowania DC. Następnie komórki te zostaną znakowane fluorescencyjnymi kropkami Qdot poprzez krótką inkubację in vitro. Zbarwione komórki można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na tym etapie komórki można wstrzyknąć zwierzętom doświadczalnym lub pozostawić do pełnego dojrzewania. in vitro inkubacja ze stymulatorami stanu zapalnego. W naszych badaniach dojrzewanie komórek DC nie determinowało utraty sygnału fluorescencyjnego, a barwienie kropkami kwantowymi (Qdot) nie wpływa na właściwości biologiczne komórek DC. Po wstrzyknięciu komórki te można zidentyfikować w organach odpornościowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po zastosowaniu standardowych procedur sekcji i fiksacji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Disekcja kości udowych i piszczeli myszy oraz hodowla komórek szpiku kostnego

  1. Uśmierć 2 myszy poprzez uduszenie CO2 i ostrożnie wypreparuj kości piszczelowe i udowe, nie przecinając końców kości.
  2. Oczyść kości z wszystkich przylegających tkanek, używając ręcznika papierowego. Zachowaj ostrożność, aby nie złamać kości.
  3. Zsterylizuj kości, zanurzając je w 70% etanolu na 10 min w 35 mm płytce Petriego. Od tego momentu pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium), aby uniknąć kontaminacji hodowli komórkowych.
  4. Wyjmij kości z etanolu i pozostaw do wyschnięcia przez 5 min w płytce Petriego wewnątrz komory bezpiecznej.
  5. Przetnij kości udowe na pół, a piszczel w jego najcieńszej części. Wprowadź do wnętrza kości 1 ml pożywki RPMI (bez serum, ale z antybiotykami), używając sterylnej strzykawki na sterylnej płytce Petriego.
  6. Zebierz zawiesinę komórkową i przemyj 2X w pożywce RPMI poprzez wirowanie przez 10 min w 15 ml probówce wirnikowej przy 1 100 RPM w wirówce chłodzącej (4°C) z rotorem z koszykami wahadłowymi.
  7. Po ostatnim przemyciu resuspenduj komórki w 2 ml buforu lizującego ACK i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu eliminacji erytrocytów.
  8. Dodaj 13 ml RPMI z 10% FBS, resuspenduj i przemyj 2X w tej pożywce, stosując te same parametry, które opisano w punkcie 1.6.
  9. Policz komórki, dostosuj stężenie do 2 x 105 komórek/ml za pomocą RPMI 10% FBS i dodaj rm-GM-CSF (stężenie końcowe 20 ng/ml) 5.
  10. Przenieś 10 ml tej zawiesiny do sterylnej 10 cm płytki Petriego jakości mikrobiologicznej i hoduj w inkubatorze CO2 (37°C, 5% CO2).

Proces ekstrakcji i hodowli szpiku kostnego myszy; schemat przedstawia wycięcie piszczeli i hodowlę komórek z GM-CSF.

Schemat procesu hodowli komórkowej z barwieniem i oceną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący czerwone kropki służące do liczenia komórek w eksperymencie mikroskopowym.

Jądra komórkowe zabarwione markerami fluorescencyjnymi, obraz mikroskopowy, podkreślający analizę zawartości DNA.

Cytometria przepływowa i wykresy słupkowe analizujące markery odpornościowe CD40, CD86, IL-6, ilościowe określenie azotanów.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej prezentujące niebieskie barwienie przekrojów tkanek z czerwonymi markerami fluorescencyjnymi.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysie komórki dendrytyczne (DCs) linii mieloidalnej były szeroko wykorzystywane w celu określenia skuteczności i ulepszenia szczepionek opartych na DCs, badania oddziaływań między DCs a limfocytami T lub rozwoju DCs, a także określenia ich roli w różnych chorobach 9-11. W niniejszym materiale pokazujemy, jak generować DCs z prekursorów odzyskanych z szpiku kostnego piszczeli i kości udowych. Odzyskujemy kości bez odcinania końców, co pozwala nam na ich sterylizację poprzez zanurzenie w 70% etanolu, zmniejszając tym samym prawdopodobieństwo kontaminacji. Aby zróżnicować DCs z komórek szpiku kostnego, stosujemy wyłącznie GM-CSF, zgodnie z wcześniejszym opisem 5. Chociaż niektóre protokoły wykorzystują również IL-4, zgłaszano, że cytokina ta nie jest konieczna przy pracy z wysokimi stężeniami GM-CSF 12. Rzeczywiście, wykazaliśmy wcześniej, że DCs te są zdolne do indukowania odpowiedzi immunologicznych 13. Należy również pamiętać, aby z 8-dniowych kultur odzyskiwać wyłącznie słabo przylegające komórki, przepłukując szalki Petriego medium, ponieważ komórki przytwierdzone wykazują fenotyp bardziej zbliżony do monocytów. Przedstawiamy tutaj znakowanie DCs fluorescencyjnymi cząsteczkami Qdot. Znakowanie to posiada pewne zalety w stosunku do innych metod. Po pierwsze, cząsteczki Qdot są łatwo wbudowywane do komórek. Po drugie, sygnał fluorescencyjny jest bardzo silny i nie ulega zmianie podczas dojrzewania DCs. Po trzecie, fluorescencja nie zanika, gdy komórki lub tkanki są utrwalane rozpuszczalnikami takimi jak aceton, w przeciwieństwie do sytuacji, gdy do znakowania DCs używa się GFP 14, co daje większą elastyczność przy wyborze protokołów barwienia. Wreszcie, silny sygnał fluorescencyjny generowany przez te cząsteczki umożliwia wizualizację komórek mimo autofluorescencji tkanek. Jak opisano wcześniej 6, barwienie Qdot nie wpłynęło na zdolność tych komórek do dojrzewania. Wykazujemy tutaj, że DCs zabarwione Qdot zachowują się podobnie jak DCs niezabarwione, zwiększając ekspresję cząsteczek kostymulujących oraz produkując IL-6 i tlenek azotu w odpowiedzi na bodźce zapalne. Choć DCs są komórkami wyspecjalizowanymi w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznych, wykazano, że biorą one udział w stanach patologicznych, takich jak nowotwory i miażdżyca 4, 15, 16. Twierdzono również, że uczestniczą one w procesie angiogenezy 17, 18, a nawet sugerowano ich strukturalny udział w tworzeniu nowych naczyń 19, 20. Zatem metody pozwalające na śledzenie DCs in vivo i określanie ich lokalizacji geograficznej w różnych tkankach 4, 21, 22 są bardzo cenne.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta została częściowo sfinansowana przez NIH w ramach grantu R15 CA137499-01 (F.B.) oraz z funduszy startowych Ohio University (F.B.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy C57BL/6Jackson LaboratorySamice, wiek 6-8 tygodni
RPMIInvitrogen11875-119
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowanaInvitrogen10437-028
Antybiotyk-antymykotykInvitrogen15240-096
PBSInvitrogen10010-049
Bufor do lizy ACKLonza Inc.10-548E
Rekombinowany mysi GM-CSFPeproTech Inc315-03
Zestaw do znakowania komórek Qtracker 655InvitrogenQ25021MP
LipopolisacharydInvitrogentlrl-eblps
Rekombinowany mysi TNF alphaPeproTech Inc315-01A
Przeciwciało CD86BD Biosciences553691
Przeciwciało CD40BD Biosciences553791
System odczynników GriessaPromega Corp.G2930
Przeciwciało wychwytujące IL-6eBioscience13-7061-81
Przeciwciało detekcyjne IL-6eBioscience13-7062-81

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  2. Bonasio, R., von Andrian, U. H. Generation, migration and function of circulating dendritic cells. Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).
  3. Lanzavecchia, A., Sallusto, F. The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics. Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).
  4. Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med. 10, 950-958 (2004).
  5. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).
  6. Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals. Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).
  7. Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer. Mol Ther. 12, 789-802 (2005).
  8. Gilboa, E., Vieweg, J. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).
  9. Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging. Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).
  10. Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).
  11. Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
  12. Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells. J Transl Med. 6, 21-21 (2008).
  13. Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells. Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).
  14. Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis. Faseb J. 22, 522-529 (2008).
  15. Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. Vascular dendritic cells and atherosclerosis. Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).
  16. Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. Dendritic cells augment choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).
  17. Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity. Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).
  18. Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells. Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).
  19. Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis. Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).
  20. Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions. Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).
  21. Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques. J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki dendrytyczne szpiku kostnegoznakowanie nanokryszta ami Qdotmikroskopia fluorescencyjnacytometria przep ywowar nicowanie indukowane GM CSFizolacja kom reksekcja tkanekprezentacja antygenumigracja kom rekledzenie fluorescencyjne

Powiązane artykuły