Artykuł metodologiczny

Generowanie i znakowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą nanokryształów Qdot do badań śledzenia

DOI:

10.3791/2785

⸱

2 czerwca 2011

 ,  ,  , 
1Molecular and Cell Biology Program, Ohio University, 2Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, Ohio University, 3Department of Biomedical Engineering, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w kierunku organów odpornościowych, aby przedstawić przetworzone antygeny limfocytom T. Znakowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych narządach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) to profesjonalne komórki prezentujące antygen (APC) znajdujące się w tkankach obwodowych i narządach immunologicznych, takich jak grasica, szpik kostny, śledziona, węzły chłonne i łaty Peyera 1-3. DC obecne w tkankach obwodowych pobierają próbki z organizmu pod kątem obecności antygenów, które pobierają, przetwarzają i prezentują na swojej powierzchni w kontekście głównych cząsteczek zgodności tkankowej (MHC). Następnie DC obciążone antygenem migrują do narządów immunologicznych, gdzie prezentują przetworzony antygen limfocytom T, wywołując specyficzne odpowiedzi immunologiczne. Jednym ze sposobów oceny zdolności migracyjnych DC jest znakowanie ich barwnikami fluorescencyjnymi 4.

Niniejszym demonstrujemy użycie fluorescencyjnych nanokryształów Qdot do oznaczania mysiego szpiku kostnego pochodzącego z DC. Zaletą tego znakowania jest to, że nanokryształy Qdot posiadają stabilną i długotrwałą fluorescencję, co czyni je idealnymi do wykrywania znakowanych komórek w odzyskanych tkankach. Aby to osiągnąć, pierwsze komórki zostaną odzyskane z mysiego szpiku kostnego i hodowane przez 8 dni w obecności czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów w celu wywołania różnicowania DC. Komórki te zostaną następnie znakowane fluorescencyjnymi Qdot przez krótką inkubację in vitro. Wybarwione komórki można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki mogą być wstrzykiwane zwierzętom doświadczalnym w tym momencie lub mogą być wstrzykiwane do dojrzałych komórek po inkubacji in vitro z bodźcami zapalnymi. W naszych rękach dojrzewanie DC nie determinowało utraty sygnału fluorescencyjnego, a barwienie Qdot nie wpływa na właściwości biologiczne DC. Po wstrzyknięciu komórki te można zidentyfikować w narządach odpornościowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po typowych procedurach preparacji i utrwalania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekcja kości udowych i piszczelowych myszy oraz hodowla komórek szpiku kostnego

  1. Poświęć 2 myszy przez uduszenie CO2 i ostrożnie wypreparuj piszczele i kości udowe bez przecinania końców kości.
  2. Oczyść kości ze wszystkich przyczepionych tkanek za pomocą bibuły. Uważaj, aby nie złamać kości.
  3. Wysterylizuj kości przez zanurzenie w 70% etanolu na 10 minut na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Od tego momentu należy pracować wewnątrz okapu bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia kultur komórkowych.
  4. Odzyskaj kości z etanolu i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut na szalce Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  5. Przetnij kości udowe na pół, a kość piszczelową za najcieńszą końcówkę. Wprowadzić do wnętrza kości 1 ml pożywki RPMI (bez surowicy, ale z antybiotykami) za pomocą sterylnej strzykawki umieszczonej na sterylnej szalce Petriego.
  6. Zawiesinę komórek zbiera się i myje 2X w pożywce RPMI przez 10 minut, wirując w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przy 1 100 obr./min w wirówce z chłodzeniem (4°C) z wahliwym wirnikiem kubełkowym.
  7. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 2 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.
  8. Dodać 13 ml RPMI z 10% FBS, ponownie zawiesić i umyć 2X w tym podłożu z tymi samymi ustawieniami, jak opisano w 1.6.
  9. Policz komórki, dostosuj do 2 x 105 komórek/ml z RPMI 10% FBS i dodaj rm-GM-CSF (końcowe stężenie 20 ng / ml) 5.
  10. Dodać 10 ml tej zawiesiny do sterylnej, mikrobiologicznej płytki Petriego o średnicy 10 cm i umieścić ją w inkubatorze z stężeniem CO2 (37°C, 5% CO2 ).

figure-protocol-1

figure-protocol-2

figure-protocol-3

figure-protocol-4

figure-protocol-5

figure-protocol-6

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysie mieloidy) DC są szeroko stosowane w celu określenia skuteczności i poprawy szczepionek opartych na DC; zbadanie interakcji między komórkami DC:T lub rozwoju DC; i określić ich rolę w różnych chorobach 9-11. Poniżej pokazujemy, jak wygenerować DC z prekursorów odzyskanych ze szpiku kostnego kości piszczelowych i udowych. Odzyskujemy kości bez nacinania końcówek, co pozwala nam je wysterylizować poprzez zanurzenie w etanolu 70%, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo zanieczyszczenia. Aby odróżnić DC od komórek szpiku kostnego, używamy wyłącznie GM-CSF, jak opisano wcześniej 5. Chociaż niektóre protokoły również wykorzystują IL-4, doniesiono, że cytokina ta nie jest konieczna podczas pracy z wysokimi poziomami GM-CSF 12. Rzeczywiście, wcześniej wykazaliśmy, że te DC są w stanie indukować odpowiedzi immunologiczne 13. Należy również zadbać o to, aby odzyskać tylko luźno przylegające komórki z 8-dniowych hodowli, myjąc szalki Petriego pożywką, ponieważ przyłączone komórki wykazują fenotyp bardziej podobny do monocytów. Tutaj pokazujemy etykietowanie DC za pomocą fluorescencyjnych cząstek Qdot. To etykietowanie ma pewne zalety w porównaniu z innymi metodami. Po pierwsze, cząsteczki Qdots są łatwo włączane do komórek. Po drugie, sygnał fluorescencyjny jest bardzo wysoki i nie jest zmieniany przez dojrzewanie prądu stałego. Po trzecie, fluorescencja nie jest tracona, gdy komórki lub tkanki są utrwalane rozpuszczalnikami, takimi jak aceton, w przeciwieństwie do tego, co dzieje się, gdy GFP jest używany do oznaczania DCs 14, co daje obecnie większą elastyczność w wyborze protokołów barwienia. Wreszcie, wysoki sygnał fluorescencyjny wysyłany przez te cząstki pozwala na wizualizację komórek pomimo autofluorescencji tkanek. Jak opisano wcześniej 6, barwienie Qdot nie wpłynęło na zdolność dojrzewania tych komórek. W ten sposób pokazujemy, że DC barwione Qdot zachowują się w podobny sposób jak niebarwione DC, zwiększając cząsteczki kostymulujące i wytwarzając IL-6 i tlenek azotu w odpowiedzi na bodźce zapalne. Chociaż DC są komórkami wyspecjalizowanymi w wyzwalaniu odpowiedzi immunologicznej, wykazano, że uczestniczą w stanach patologicznych, takich jak rak i miażdżyca 4, 15, 16. Twierdzono również, że uczestniczą one w procesie angiogennym 17, 18, a nawet sugerowano, że strukturalnie uczestniczą w rozwoju nowych naczyń 19, 20. Dlatego bardzo cenne są metody, które pozwalają na śledzenie DC in vivo i określanie ich lokalizacji geograficznej w różnych tkankach 4, 21, 22 .

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częściowo wspierana przez NIH w ramach grantu R15 CA137499-01 (F.B.) oraz fundusz startowy z Uniwersytetu Ohio (F.B.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL/6 myszyJackson LaboratorySamice, 6-8 tygodni
RPMIInvitrogen11875-119
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowanaInvitrogen10437-028
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczaInvitrogen15240-096
PBSInvitrogen10010-049
ACK Bufordo lizowaniaLonza Inc.10-548E
Rekombinowany mysi GM-CSFPeproTech Inc315-03
Qtracker 655 Zestaw do etykietowania komórekInvitrogenQ25021MP
LipopolisacharydInvitrogentlrl-eblps
Rekombinowany mysi TNF alfaPeproTech Inc315-01A Przeciwciało
CD86BD Biosciences553691
Przeciwciało CD40BD Biosciences553791
Griess system odczynnikówPromega Corp.G2930
Przeciwciało wychwytujące IL-6eBioscience13-7061-81
Przeciwciało wykrywające IL-6eBioscience13-7062-81

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).">Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  2. Generation, migration and function of circulating dendritic cells. Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).">Bonasio, R., von Andrian, U. H. Generation, migration and function of circulating dendritic cells. Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).
  3. The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics. Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).">Lanzavecchia, A., Sallusto, F. The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics. Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).
  4. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med. 10, 950-958 (2004).">Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med. 10, 950-958 (2004).
  5. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).">Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).
  6. Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals. Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).">Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals. Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).
  7. HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer. Mol Ther. 12, 789-802 (2005).">Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer. Mol Ther. 12, 789-802 (2005).
  8. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).">Gilboa, E., Vieweg, J. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).
  9. Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging. Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).">Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging. Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).
  10. Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).">Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).
  11. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).">Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
  12. Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells. J Transl Med. 6, 21-21 (2008).">Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells. J Transl Med. 6, 21-21 (2008).
  13. Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells. Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).">Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells. Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).
  14. Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis. Faseb J. 22, 522-529 (2008).">Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis. Faseb J. 22, 522-529 (2008).
  15. Vascular dendritic cells and atherosclerosis. Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).">Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. Vascular dendritic cells and atherosclerosis. Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).
  16. Dendritic cells augment choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).">Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. Dendritic cells augment choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).
  17. Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity. Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).">Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity. Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).
  18. Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells. Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).">Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells. Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).
  19. Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis. Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).">Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis. Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).
  20. Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions. Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).">Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions. Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).
  21. Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques. J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).">Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques. J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki dendrytyczne szpiku kostnegoznakowanie nanokryszta ami Qdotmikroskopia fluorescencyjnacytometria przep ywowar nicowanie indukowane GM CSFizolacja kom reksekcja tkanekprezentacja antygenumigracja kom rekledzenie fluorescencyjne

Powiązane artykuły