Artykuł metodologiczny

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

56.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2796

⸱

7 września 2011

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Streszczenie

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest użytecznym narzędziem do zrozumienia pełnego obrazu termodynamicznego reakcji wiązania. W naukach biologicznych oddziaływania makromolekularne są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów działania komórki. Warunki eksperymentalne, takie jak bufor i temperatura, mogą być dostosowane do konkretnego badanego układu wiązania. Konieczne jest jednak staranne planowanie, ponieważ uzyskanie użytecznych danych wymaga zastosowania określonych zakresów stężeń ligandu i makromolekuły. W celu uzyskania wiarygodnych wyników stężenia makromolekuły i ligandu muszą być dokładnie określone. Należy również zachować ostrożność podczas przygotowywania próbek, ponieważ zanieczyszczenia mogą znacząco wpłynąć na przebieg eksperymentu. Gdy eksperymenty ITC, wraz z odpowiednimi kontrolami, są przeprowadzone prawidłowo, uzyskuje się istotne informacje o wiązaniu, takie jak stechiometria, powinowactwo i entalpia. Poprzez wykonanie dodatkowych doświadczeń w różnych warunkach buforowych lub temperaturowych można uzyskać bardziej szczegółowe informacje o badanym układzie. Przedstawiono protokół podstawowej konfiguracji eksperymentu ITC.

Protokół

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest uznaną techniką, która pozwala na określenie wszystkich parametrów termodynamicznych (powinowactwa, entalpii i stechiometrii) oddziaływania wiążącego w ramach jednego eksperymentu.1 Metoda ITC polega na miareczkowaniu jednego reagenta drugim w warunkach izotermicznych. Mierzonym sygnałem jest ciepło wydzielane lub pochłaniane podczas oddziaływania (wiązania) dwóch reagentów. Wykonuje się serię wtrysków, a sygnał cieplny dąży do zera w miarę nasycenia reagenta ograniczającego. Dopasowanie izotermy pozwala na wyznaczenie parametrów termodynamicznych. Dostępnych jest kilka opracowań przeglądowych opisujących zarówno instrumentarium, jak i matematyczne podstawy gromadzenia i analizy danych. 2,3 Choć dostępne są inne kalorymetry (w szczególności ITC200 do pracy z małymi objętościami), w niniejszym materiale opisujemy ogólny protokół dla urządzenia VP-ITC produkowanego przez MicroCal (obecnie część GE Healthcare).

1. Przygotowanie próbek

  1. Aby przygotować makrocząsteczkę i ligand w buforze, należy rozwiązać kilka potencjalnych problemów. Precyzyjne dopasowanie danych wymaga odpowiednich stężeń makrocząsteczki (substancji, która zazwyczaj znajduje się w komórce pomiarowej ITC) oraz ligandu (substancji w strzykawce dozującej). Ponieważ niektóre białka ulegają agregacji przy wysokich stężeniach wymaganych dla substancji w strzykawce dozującej, białko najczęściej ładuje się do komórki pomiarowej. Optymalne stężenie makrocząsteczki wyznacza się na podstawie wartości „c”, będącej iloczynem przewidywanego powinowactwa układu (które można oszacować metodami ortogonalnymi przed zastosowaniem ITC) i całkowitego stężenia makrocząsteczki, gdzie c = Ka*[M]. Optymalne wartości c mieszczą się w zakresie 10-1000,1 choć w określonych warunkach eksperymentalnych możliwe jest uzyskanie dokładnych danych dla układów o słabym wiązaniu przy wartościach c poniżej dolnej granicy.4 Zatem stężenie makrocząsteczki musi zostać określone z uwzględnieniem tego zakresu wartości c (np. dla Ka wynoszącego 106 M-1 należy zastosować stężenia makrocząsteczki od 10 do 1000 μM). Wcześniejsza wiedza o powinowactwie wiązania w układzie może pomóc zminimalizować ilość białka zużytego do ITC dzięki lepszemu zaprojektowaniu eksperymentu. Stężenie ligandu powinno być wystarczająco wysokie (7-25 razy większe niż Kd dla najsłabiej wiążącego miejsca ligandu), aby nasycenie nastąpiło w obrębie pierwszej jednej trzeciej lub połowy miareczkowania. Precyzyjne dopasowanie danych wymaga również nasycenia sygnału. W przypadku układów o wyższym powinowactwie wiązania należy zastosować niższe stężenie ligandu, aby uniknąć zbyt wczesnego nasycenia podczas miareczkowania, co prowadziłoby do niedokładnego dopasowania. Po odjęciu od miareczkowania kontroli ciepła rozcieńczenia (tj. miareczkowania ligandu do buforu), entalpia przy nasyceniu powinna dążyć do zera.
  2. Ponieważ zanieczyszczenia małymi cząsteczkami mogą powodować sygnały artefaktowe w pomiarach ITC, najlepiej jest, jeśli to możliwe, przeprowadzić wyczerpującą dializę makrocząsteczki i ligandu przeciwko buforowi. Alternatywnie, w celu zmiany buforu makrocząsteczki można zastosować chromatografię kolumnową, odsolone kolumny spinowe lub wirówkowe filtry do wymiany buforu (na przykład Centricony). Jeśli ligandem jest mała cząsteczka, można go przygotować za pomocą buforu do dializy po tym, jak makrocząsteczka została zdializowana, lub poprzez dializę przeciwko membranom o odcięciu odpowiednim dla małych cząsteczek (np. 100-500 Da dla Spectra/Por Float-A-Lyzer). Różnice w składzie buforu pomiędzy roztworami ligandu i makrocząsteczki mogą prowadzić do artefaktów sygnału wynikających z ciepła rozcieńczenia zanieczyszczeń w próbkach. Po przygotowaniu należy sprawdzić, czy pH buforu, makrocząsteczki i ligandu są zgodne (± 0,05 jednostki pH), ponieważ efekty protonowania buforu mogą wywoływać artefakty w entalpii.5 Należy upewnić się, że przygotowano wystarczającą ilość każdej substancji. Dla eksperymentów w trzech powtórzeniach oraz kontroli rozcieńczenia ilość potrzebnego materiału będzie zależeć od użytego urządzenia ITC. Jednak dla większości instrumentów ITC, które posiadają komórki pomiarowe o objętości około 2 ml, konieczne będzie co najmniej 6-7 ml roztworu makrocząsteczki, który można wygodnie przygotować w probówkach typu falcon 15 ml. W przypadku strzykawek dozujących o objętości 300 μL wystarczające powinno być 1-2 ml roztworu, który można przygotować w probówkach typu falcon lub probówkach do mikrocentryfugi.
  3. Kurz i inne cząsteczki mogą powodować artefakty w linii bazowej termogramu ITC. Jest niezbędne, aby zostały one usunięte przed rozpoczęciem eksperymentu. Po przygotowaniu roztworów zapasowych próbek należy je wirować w probówkach do mikrocentryfugi przez pięć minut przy 8000 do 14 000 RPM, aby wytrącić cząsteczki w roztworze. Należy zebrać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu, i przelać go do nowej probówki typu falcon/mikrocentryfuga.
    Jeśli do utrzymania zredukowanych cystein niezbędne są reduktory, należy stosować niskie stężenia i świeże roztwory zapasowe β-merkaptoetanolu, TCEP (tris(2-karboksy)fosfiny) lub ditiotreitolu, aby zminimalizować artefakty wynikające z utleniania reduktora. Ponadto obecność rozpuszczalników organicznych w buforze (częsta w przypadku niektórych ligandów będących małymi cząsteczkami, które mogą wymagać metanolu lub DMSO w celu rozpuszczenia) może powodować artefakty sygnału. Jeśli do ligandu niezbędne są rozpuszczalniki organiczne, roztwór makrocząsteczki musi również zawierać takie samo stężenie, aby uniknąć sygnałów wynikających z ciepła rozcieńczenia rozpuszczalnika organicznego. Podczas przygotowania próbek możliwe są niewielkie różnice w składzie buforu między ligandem a makrocząsteczką ze względu na cosolwenty, sole lub pH. Najlepiej jest sprawdzić rozcieńczenie ligandu w buforze pomiarowym lub buforu pomiarowego w makrocząsteczce, aby upewnić się, że sygnały cieplne wynikające z różnic w zawartości buforu nie generują danych będących wyłącznie artefaktami.
  4. Należy dokładnie sprawdzić stężenia makrocząsteczki i ligandu, korzystając z technik odpowiednich dla danego układu (takich jak pomiary absorbancji, HPLC, testy kolorymetryczne, testy BCA dla białek itp.), aby odnotować ich dokładne wartości. Różnice między rzeczywistym stężeniem a stężeniem użytym do dopasowania izotermy spowodują błędy w stechiometrii, entalpii i powinowactwie wiązania wyznaczonym z eksperymentu. Powszechną praktyką jest odgazowanie próbek, aby uniknąć artefaktów sygnału spowodowanych pęcherzykami powietrza lub uwalnianiem rozpuszczonych gazów podczas miareczkowania, szczególnie w wyższych temperaturach.

2. Przygotowanie eksperymentu

  1. Upewnij się, że ogniwo z próbką i strzykawka do iniekcji zostały oczyszczone zgodnie z protokołem producenta przed załadowaniem makrocząsteczki i liganda. Przepłucz ogniwo z próbką dwa lub trzy razy 1,8 ml wody destylowanej za pomocą strzykawki Hamiltona (zachowaj ostrożność przy obsłudze strzykawki Hamiltona, ponieważ tłok jest łatwo łamliwy, a igła podatna na wygięcie). Następnie kilkukrotnie przepłucz ogniwo z próbką 1,8 ml buforu. Napełnij ogniwo z próbką 1,8 ml roztworu makrocząsteczki, uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.
  2. Napełnij ogniwo referencyjne wodą destylowaną. W przypadku większości buforów woda destylowana nadaje się jako roztwór referencyjny. Jednak w przypadku buforów o szczególnie wysokiej sile jonowej lub osmolalności lepiej jest zastosować bufor jako referencję.
  3. Usuń pęcherzyki powietrza z ogniw referencyjnego i z próbką za pomocą strzykawki Hamiltona. Delikatnie przesuwaj igłę strzykawki w górę i w dół wzdłuż ścianek ogniwa, spychając wszelkie pęcherzyki, które mogą znajdować się na dnie ogniwa i przylegać do wgłębienia, ku górze ogniwa. Usuń nadmiar objętości z ogniwa z próbką i ogniwa referencyjnego.
  4. Podłącz plastikową strzykawkę do portu napełniania strzykawki do iniekcji za pomocą drenu. Przepłucz strzykawkę do iniekcji wodą destylowaną, a następnie buforem. Upewnij się, że strzykawka do iniekcji jest całkowicie opróżniona poprzez zassanie powietrza przez system. Umieść igłę strzykawki do iniekcji w roztworze liganda i pobierz go do strzykawki, aż zostanie ona całkowicie wypełniona. Pobierz niewielką nadmiarową objętość (około 50 μl lub więcej) do portu i podłączonego drenu. Natychmiast zamknij port napełniania strzykawki i odłącz dren oraz plastikową strzykawkę. Opróżnij i ponownie napełnij strzykawkę do iniekcji jeszcze dwa razy, aby usunąć z niej wszelkie pęcherzyki powietrza. Wyjmij strzykawkę z roztworu liganda i przetrzyj jej bok chusteczką kimwipe, aby usunąć krople, uważając, by nie dotknąć końcówki strzykawki chusteczką, ponieważ może to spowodować utratę objętości ze strzykawki. Należy również uważać, aby nie uderzyć ani nie potrząsnąć strzykawką, gdyż może to również spowodować utratę objętości z końcówki strzykawki. Umieść strzykawkę do iniekcji w ogniwie z próbką.
  5. Ustaw parametry prowadzenia pomiaru ITC. Dla układów wiązania z silnymi sygnałami cieplnymi duża liczba iniekcji małych objętości dostarczy więcej punktów danych do dopasowania (np. 75 iniekcji po 3 μl). Dla układów o słabych sygnałach cieplnych preferowana jest mała liczba iniekcji dużych objętości (np. 33 iniekcje po 8 μl). Najczęściej stosuje się mniejszą liczbę iniekcji o większych objętościach. Optymalizacja warunków najlepiej dopasowanych do danego układu może wymagać przeprowadzenia kilku miarek. Ważne jest, aby zauważyć, że entalpia wiązania może być egzotermiczna lub endotermiczna, w zależności od badanego układu. Niestety niektóre układy wykazują słabe sygnały cieplne, co utrudnia określenie ciepła reakcji. Problemy w takich układach można potencjalnie rozwiązać poprzez zwiększenie stężenia makrocząsteczki, zmianę temperatury eksperymentu (w zależności od pojemności cieplnej układu wiązania) i/lub zmianę pH lub siły jonowej buforu.
  6. Należy również rozważyć odstępy czasowe między poszczególnymi iniekcjami. Jest niezbędne, aby po każdej iniekcji liganda system miał czas na wyrównanie, a sygnał cieplny powrócił do linii bazowej przed kolejną iniekcją. Dla większości układów od trzech do pięciu minut powinno być wystarczające. Czas między iniekcjami należy zwiększyć w przypadku układów, w których wyrównanie nie następuje w ciągu pięciu minut.
  7. Ponieważ po włożeniu strzykawki do iniekcji do ogniwa z próbką nastąpi pewne mieszanie roztworów makrocząsteczki i liganda w strzykawce, pierwsza iniekcja da błędne wyniki. Najlepiej jest zastosować małe objętości (np. 2 μl) dla pierwszej lub drugiej iniekcji (aby można było je później odrzucić), a kolejne iniekcje utrzymać na pożądanych wartościach.
  8. Wybierz temperaturę eksperymentu (najczęściej jest to 25 °C, choć można stosować temperatury od 2 do 80 °C). Najlepiej wybrać temperaturę zgodną z innymi eksperymentami (wiązania, kinetyki itp.) przeprowadzonymi dla układu ligand-makrocząsteczka. ITC można ustawić tak, aby wyrównywało się w temperaturze innej niż temperatura eksperymentu. Jeśli eksperyment ma być przeprowadzony w temperaturze oddalonej od temperatury pokojowej o więcej niż 10 °C, najlepiej ustawić temperaturę wyrównywania instrumentu w granicach 5 °C od temperatury eksperymentalnej. Skróci to czas potrzebny instrumentowi na osiągnięcie temperatury eksperymentu.
    Należy również rozważyć prędkość mieszania strzykawki. Mieszanie jest niezbędne do odpowiedniego zmieszania liganda i makrocząsteczki podczas miareczkowania, ale niektóre białka ulegają destabilizacji przy szybkim mieszaniu. W takich przypadkach prędkość mieszania powinna być ustawiona na stosunkowo niskim poziomie. Po ustawieniu wszystkich parametrów eksperymentalnych można rozpocząć pomiar.
  9. Po zakończeniu eksperymentu ITC można oczyścić zgodnie z protokołem producenta. Roztwór w ogniwie z próbką po zakończeniu pomiaru można zachować, jeśli planowane są dodatkowe eksperymenty na mieszaninie kompleksu makrocząsteczka-ligand.
  10. Powtórz miareczkowania co najmniej jeden lub dwa razy, aby uzyskać powtarzalne dane. Przeprowadź pomiar kontrolny, w którym ligand jest miareczkowany do buforu w ogniwie z próbką, aby określić ciepło rozcieńczenia liganda. Dla niektórych układów, w których występuje wiązanie kooperatywne, dodatkowych informacji o procesie wiązania można uzyskać poprzez iniekcję makrocząsteczki do liganda. Różne orientacje iniekcji mogą dostarczyć dodatkowych informacji, które mogą być pomocne przy dopasowaniu globalnym.6

3. Analiza danych

  1. Dopasowanie danych można łatwo przeprowadzić za pomocą makr w dowolnym programie do dopasowywania danych (zazwyczaj dostarczanym przez producenta wraz z instrumentem). Wczytaj pierwszy plik danych. Sprawdź surowy termogram pod kątem pęcherzyków powietrza lub innych artefaktów w sygnale. Jeśli występują jakiekolwiek artefakty (takie jak skoki linii bazowej lub piki w momentach, w których nie nastąpił wtrysk), należy odnotować te punkty danych, ponieważ powinny one zostać usunięte. Następnie wczytaj dane kontrolne dla rozcieńczenia ligandu i odejmij dane rozcieńczenia ligandu od izotermy wiązania. W tym momencie usuń wszystkie błędne punkty danych, w tym jeden lub dwa pierwsze punkty miareczkowania, w których występują artefakty rozcieńczenia (patrz krok 7).
  2. Wybierz model dopasowania danych (jedno miejsce wiązania, dwa/wiele miejsc wiązania, wiązanie kooperacyjne itp.), który zostanie użyty do dopasowania danych. Dane można dopasować, wprowadzając wartości początkowe parametrów dopasowania: stechiometrię (n), entalpię (ΔH) oraz powinowactwo wiązania (Ka). Jeśli z eksperymentów ortogonalnych znane jest uprzednio powinowactwo wiązania lub inne parametry, można wprowadzić te wartości. Pomaga to uniknąć utknięcia procesu dopasowania w minimach lokalnych. Po dopasowaniu danych dla pierwszego miareczkowania powtórz kroki 15 i 16 dla pozostałych izoterm. Alternatywnie dane można dopasować globalnie, korzystając z programów takich jak SEDPHAT.6 SEDPHAT może być szczególnie pomocny przy globalnym dopasowywaniu zestawów danych kompleksów binarnych (tj. cząsteczek A+B) w połączeniu z zestawami danych kompleksów ternarnych (cząsteczki A+B+C). Na przykład w przypadku wiązania cząsteczki C do kompleksu A-B nie zawsze jest jasne, czy może wystąpić sygnał wynikający z wiązania C do A lub B do A (jeśli A nie jest w pełni nasycone).
  3. Aby upewnić się, że dane ITC nie są artefaktami, powinowactwo wiązania i stechiometrie uzyskane z ITC należy porównać z metodą ortogonalną.7,8 Dodatkowo wartość entalpii z ITC można porównać z entalpią z wykresu van't Hoffa.9 Pomocne może być również zastosowanie różnych stężeń ligandu lub makrocząsteczki, ponieważ bezwzględna wartość sygnału cieplnego powinna wzrastać wraz ze wzrostem stężenia makrocząsteczki. Artefakty najczęściej pojawiają się, gdy bufory w celi i strzykawce nie są identyczne. Innym źródłem artefaktów mogą być nieczyste próbki.
  4. Zalecamy, aby użytkownik rozpoczął od prostych miareczkowań kompleksów binarnych, dla których dostępne są wcześniejsze informacje na temat Kd i stechiometrii. Następnie, jeśli wiążą się dodatkowe ligandy, użytkownik może spróbować bardziej skomplikowanych miareczkowań kompleksów ternarnych, zmieniając stężenia ligandów i ewentualnie zamieniając składniki w strzykawce i celi. Porównanie entalpii dla obu ścieżek tworzenia kompleksu ternarnego powinno być addytywne, ponieważ entalpia jest funkcją stanu.10 Tutaj również program SEDPHAT6 może okazać się bardzo użyteczny.

4. Reprezentatywne wyniki:

Dane z izotermicznej kalorymetrii miareczkowej; wykresy ΔP w funkcji czasu oraz ΔH w funkcji [NADPH]/[EcDHFR] wraz z rezyduami.
Rycina 1. Reprezentatywny przykład prawidłowego miareczkowania dla wiązania kofaktora NADPH z chromosomalną reduktazą dihydrofolianową E. coli (ecDHFR). Panel (A) przedstawia surowy termogram; (B) izotermę wiązania uzyskaną z dopasowania zintegrowanego termogramu z wykorzystaniem modelu jednego miejsca w oprogramowaniu Origin; oraz (C) dopasowanie izotermy z wykorzystaniem modelu jednego miejsca wiązania z programu SEDPHAT wraz z rezyduami dopasowania. Z oprogramowania Origin, przy użyciu modelu wiązania jednego miejsca, uzyskano: n = 1.09 ± 0.02, Kd = 0.194 ± 0.001 μM, ΔH = -22.7 ± 0.4 kcal/mol, TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal/mol oraz ΔG = -9.16 ± 0.01 kcal/mol. Dopasowania danych za pomocą programu Sedphat dały wartości: n = 0.94 ± 0.01, Kd = 0.195 ± 0.013 ΔM, ΔH = -22.5 ± 0.2 kcal/mol, TΔS = -13.39 kcal / mol oraz ΔG = -9.15 kcal/mol.

Dyskusja

Metoda ITC była szeroko stosowana w badaniach oddziaływań ligand-makromolekuła,11 w tym w badaniach nad układami białko-ligand,12 DNA-ligand13 oraz RNA-makromolekuła.14 ITC można przeprowadzić nawet z materiałami stałymi, takimi jak nanocząstki tworzące jednorodne zawiesiny.15 Ponadto układy trójskładnikowe, w których jeden ligand jest już związany z makromolekułą, a drugi jest miareczkowany, mogą być wykorzystywane do wyznaczania termodynamiki m.in. wiązania substratu z układem enzym-kofaktor.7 Badania można również prowadzić dla cząsteczek o bardzo wysokim powinowactwie wiązania, które normalnie przekracza granicę detekcji ITC, poprzez zastosowanie testów wiązania konkurencyjnego z ligandami o słabszym wiązaniu.16 Informacje na temat słabo wiążących się ligandów można również uzyskać za pomocą analiz konkurencyjnych.17 Za pomocą ITC można badać rolę wody w wiązaniu,18 a także zależność entalpii od reorganizacji rozpuszczalnika.19 Niedawno zmierzono termodynamikę zmian konformacyjnych wariantów DNAK po związaniu ADP i ATP.20 Za pomocą ITC można badać asocjację białko-białko, uzyskując informacje na temat kompleksów hetero- 21 oraz homoasocjacji.22 Wpływ temperatury na entalpię wiązania pozwala wyznaczyć pojemność cieplną procesu wiązania.2 Liczbę protonów pochłoniętych lub wydzielonych podczas wiązania można również określić na podstawie eksperymentów przeprowadzonych w buforach o różnych entalpiach jonizacji.5 Jeśli dodatkowe badania ITC zostaną wykonane przy różnych wartościach pH, można potencjalnie wyznaczyć pKa grupy biorącej udział w procesie.23

Podsumowując, dla prawidłowego przeprowadzenia eksperymentu ITC niezbędne są dokładne pomiary stężeń makromolekuły oraz liganda. Stężenia próbek muszą być również w odpowiednim zakresie, aby uzyskać wiarygodne dane. Należy zwrócić szczególną uwagę na bufor, ponieważ zanieczyszczenia małymi cząsteczkami oraz niedopasowanie pH będą powodować artefakty na termogramie.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant NSF nr MCB-0817827.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
probówki do mikrocentryfugi 1,7 mLFisher Scientific02-681-282
probówki typu Falcon 15 mLFisher Scientific14-959-49B
strzykawka Hamiltona 2,5 mLMicroCalSYN161714

Bibliografia

  1. Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).
  2. Jelesarov, I., Bosshard, H. R. Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition. J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).
  3. Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).
  4. Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).
  5. Fukada, H., Takahashi, K. Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride. Proteins. 33, 159-166 (1998).
  6. Houtman, J. C. Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling. Protein Sci. 16, 30-42 (2007).
  7. Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein. Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).
  8. Shenoy, S. R. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).
  9. Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis. Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).
  10. Norris, A. L., Serpersu, E. Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System. Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).
  11. Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry. J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).
  12. Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).
  13. Buurma, N. J., Haq, I. Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions. Methods. 42, 162-172 (2007).
  14. Salim, N. N., Feig, A. L. Isothermal titration calorimetry of RNA. Methods. 47, 198-205 (2009).
  15. De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study. J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).
  16. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).
  17. Velazquez Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).
  18. Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane. J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).
  19. Chervenak, M. C., Toone, E. J. A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding. J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).
  20. Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states. Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).
  21. Jelesarov, I., Bosshard, H. R. Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface. Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).
  22. Burrows, S. D. Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration. Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).
  23. Baker, B. M., Murphy, K. P. Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry. Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wi zanie ligand w z makrocz steczkamiparametry termodynamiczneprzygotowanie pr bekwirowaniespektroskopia UVodgazowanie pr bekstrzykawka wstrzykuj cadopasowanie danycheksperyment kontrolny
Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.