Międzytkankowe komórki Cajala (ICC) są komórkami rozrusznikowymi przewodu pokarmowego. Tworzą one złożone sieci pomiędzy komórkami mięśni gładkich a powypierścienicowymi włóknami neuronalnymi, aby regulować kurczliwość przewodu pokarmowego. W niniejszej pracy przedstawiamy metody immunofluorescencji do wizualizacji sieci ICC u myszy w przekrojach poprzecznych oraz w preparatach całych (whole-mount).
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja sieci komórek Cajala (ICC) u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Międzywszczepowe komórki Cajala (ICC) to pochodzące z mezenchymu „komórki rozrusznikowe” przewodu pokarmowego (GI), które generują spontaniczne fale wolne niezbędne dla perystaltyki i pośredniczą w sygnałach neuronalnych z jelitowego układu nerwowego1. Różne podtypy ICC tworzą odrębne sieci w mięśniówce przewodu pokarmowego 2,3. Utrata lub uszkodzenie tych sieci wiąże się z licznymi zaburzeniami motoryki4. Komórki ICC wykazują ekspresję receptorowej tyrozynowej kinazy KIT w błonie komórkowej, a barwienie immunohistochemiczne na KIT było stosowane przez ostatnie 15 lat do znakowania sieci ICC5,6. Co istotne, prawidłowa aktywność KIT jest niezbędna dla rozwoju ICC5,6. Neoplastyczna transformacja komórek ICC prowadzi do powstania guzów stromy przewodu pokarmowego (GIST), które często wykazują mutacje KIT typu gain-of-function7,8. Niedawno wykazaliśmy, że ETV1 jest specyficznym dla danej linii czynnikiem przeżycia ekspresowanym w linii ICC/GIST oraz głównym regulatorem transkrypcyjnym niezbędnym zarówno dla prawidłowego formowania się sieci ICC, jak i dla tumorigenzy GIST9. Wykazaliśmy ponadto, że współpracuje on z aktywującymi mutacjami KIT w procesie tumorigenzy. W niniejszej pracy opisujemy metody wizualizacji sieci ICC u myszy, w dużej mierze opierając się na wcześniej opublikowanych protokołach10,11. W ostatnim czasie kanał chlorkowy anoctamin 1 (ANO1) został również scharakteryzowany jako specyficzny marker błonowy ICC11,12. Ze względu na ich lokalizację w błonie komórkowej, immunofluorescencja obu białek może być wykorzystana do wizualizacji sieci ICC. Opisujemy tutaj wizualizację sieci ICC za pomocą utrwalonych mrożonych krioprzestrojów oraz preparatów typu whole mount.
Protokół
1. Disekcja przewodu pokarmowego myszy
- Eutanazja myszy zgodnie z lokalnymi wytycznymi IUCAC
- Przytwierdzenie każdej kończyny do powierzchni styropianowej i opłukanie brzucha 70% ethanolem. Otwarcie jamy brzusznej poprzez długie cięcie wzdłuż linii środkowej od przepony do spojenia łonowego. Wykonanie jednego cięcia w obrębie dystalnej części przełyku oraz drugiego cięcia w obrębie dystalnej części jelita grubego i usunięcie całego odcinka przewodu pokarmowego od żołądka do odbytu en bloc, uważnie przecinając więzadła w okolicy dwunastnicy i kątnicy za pomocą małych nożyczek. Umieszczenie przewodu pokarmowego w szalce Petriego z PBS. Usunięcie krezki za pomocą pęsety (Rysunek 1). W celu oddzielenia żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego, należy przeciąć je w obrębie odźwiernika oraz połączenia żołądkowo-kątniczego. Przepłukanie światła każdej części przewodu pokarmowego PBS przy użyciu strzykawki 5ml z przymocowaną igłą do karmienia (starsze myszy) lub igłą tępą (młodsze myszy).
- Otwarcie żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego wzdłuż krawędzi krezkowej. Wycięcie dwóch fragmentów z każdej części przewodu pokarmowego: jednego do wizualizacji całego preparatu (whole mount) i jednego do kriosekcji.
2. Przygotowanie próbek do całego preparatu oraz immunobarwienie
- Każdy fragment przewodu pokarmowego umieścić w probówce mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml wypełnionej 1,0 ml lodowatego acetonu i utrwalać próbki przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4°C. Próbki można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze -20 °C. Zazwyczaj przechowujemy próbki w acetonie i przystępujemy do przygotowania skrawków mrożonych.
- Próbkę przemyć 2X w PBS. Umieścić próbkę w szalce Petriego z PBS. Pod mikroskopem stereotypowym ostrożnie zeskrobać warstwę śluzówki skalpelem, trzymając jeden koniec pęsetą, pozostawiając warstwę mięśniową.
- Mięsień można pociąć na 5mm fragmenty w celu barwienia różnymi przeciwciałami. Nie przechowywać w PBS dłużej niż 2 dni przed barwieniem.
- Etapy blokowania i inkubacji można przeprowadzić w jednej studience płytki 24-dołkowej lub w probówce mikrocentryfugi 1,5ml. Blokować za pomocą 0,5 ml buforu blokującego (5% surowicy koziej, 0,1% Triton X-100 w PBS przez 1 godzinę w 4 °C).
- Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w buforze blokującym i rotować przez noc w 4 °C. Do immunobarwienia całych preparatów (whole mount) pomyślnie zastosowaliśmy przeciwciała: szczurze przeciwko Kit (ACK-2), królicze przeciwko Ano1 oraz królicze przeciwko Pgp9.5.
- Przemywać przez 5 min 2X w PBS na rotatorze w temperaturze pokojowej.
- Inkubować z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze. Zazwyczaj stosujemy przeciwciała Alexa Fluor 488 anty-królicze oraz Alexa Fluor 594 anty-szczurze.
- Przemywać przez 15 min 3X w PBS na rotatorze w temperaturze pokojowej.
- Zamontować na szkiełku, stroną surowiczą do góry, aby zapewnić odpowiednią orientację tkanki podczas mikroskopii. Taka orientacja sprawi, że strona surowicza będzie przylegać do szkiełka nakrywkowego i zostanie napotkana jako pierwsza podczas ustawiania ostrości preparatu pod mikroskopem. Czynność tę wykonujemy pod mikroskopem stereotypowym. Czasami krótko badamy tkankę pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu prawidłowej orientacji. Podczas wizualizacji Kit lub Ano1 pod mikroskopem fluorescencyjnym, sieć ICC-MY powinna być widoczna jako pierwsza od strony szkiełka nakrywkowego. Następnie odessać jak najwięcej PBS, nie doprowadzając do całkowitego wyschnięcia. Dodać 50 μl utwardzającego medium montażowego (stosujemy Prolong Gold) i delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na tkankę. Pozostawić medium do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej i przechowywać szkiełka w -80 °C.
- Do badania mikroskopowego wykorzystaliśmy mikroskop szerokopolowy z napędem Z (Z-drive). Użyliśmy obiektywu powietrznego 20X (NA 0,75, plan apochromat) lub obiektywu olejowego 60X (NA 1,4, plan apochromat) i wykonaliśmy sekcje Z o grubości 2 μm lub 1 μm obejmujące całą warstwę mięśniową. Obrazy zostały następnie poddane dekonwolucji przy użyciu oprogramowania Autoquant. Alternatywnie, wielu innych badaczy stosowało mikroskopię konfokalną, uzyskując podobne wyniki.
3. Przygotowanie kryptostyków i immunostainig
- Każdy odcinek przewodu pokarmowego należy położyć płasko na papierze filtracyjnym, stroną sierozy do dołu. Wyciąć papier filtracyjny wokół tkanki. Tkankę na papierze filtracyjnym umieścić w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS (32% paraformaldehyd z zamkniętej fiolki rozcieńczamy w PBS bezpośrednio przed użyciem) na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Fixację można przeprowadzić w płytce 6- lub 12-dołkowej, zależnie od wielkości tkanki, lub w probówce do mikrocentrifugowania o pojemności 1,5 ml. W przypadku użycia płytki, należy zastosować parafilm, aby zminimalizować ekspozycję na PFA. Dłuższy czas fixacji może prowadzić do maskowania antygenów, w szczególności w przypadku przeciwciała ACK-2 anty-Kit.
- Wyjąć tkankę z PFA i umieścić w 30% sacharozie w PBS. Pozostawić tkankę do całkowitego zatonięcia przez noc w temperaturze 4 °C.
- Równoważyć tkankę w stosunku 1:1 sacharozy 30% i O.C.T. przez 1 godzinę. Następnie zamontować tkankę pionowo w formie do kriostatu wypełnionej O.C.T. Oś podłużna przewodu pokarmowego powinna być równoległa do płaszczyzn cięcia krioszek. Przy badaniu myszy o różnych genotypach lub poddanych różnym zabiegom, pomocne może być umieszczenie tkanek od różnych zwierząt w tej samej formie, aby zapewnić równoległe przetwarzanie. Zamrozić na suchem lodzie i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
- Przygotować krioskrawki o grubości 10 μm na szkiełkach i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Zazwyczaj wykonujemy dwa skrawki na jedno szkiełko. Zazwyczaj wykonujemy również barwienie H&E jednego skrawka.
- W przypadku immunofluorescencji, najpierw doprowadzić szkiełko do temperatury pokojowej przez 15 minut. Następnie obrysować tkankę kółkiem za pomocą pisaka PAP.
- Blokować 150 μl buforu blokującego (takiego samego, jak do immunobarwienia całych preparatów) przez 1 godzinę.
- Odssać bufor blokujący, dodać 150 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w buforze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnej.
- Przemywać PBS przez 5 min (2X).
- Inkubować z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Typowo stosujemy przeciwciała Alexa 488 anty-rabbit i Alexa 594 anty-rat.
- Przemywać PBS przez 15 min (3X).
- Odssać nadmiar cieczy ze szkiełka, nie wysuszając całkowicie tkanki. Dodać kroplę twardniejącego medium montażowego z DAPI (stosujemy Prolong Gold) i nałożyć szkiełko zakrywające #1.5. Pozostawić szkiełko w temperaturze pokojowej na noc do utwardzenia, a następnie przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
- Pozyskać obrazy potrójnej fluorescencji, korzystając z zestawów filtrów DAPI, FITC i Texas Red.
4. Reprezentatywne wyniki:
W niniejszym przypadku jako przykład wykorzystano jelito grube. Barwienie H&E zamrożonego przekroju utrwalonego z ochroną sacharozą, użytego do immunofluorescencji, wykazuje pewne artefakty w porównaniu z referencyjnym przekrojem parafinowym (Rycina 2), gdzie żółta linia wyznacza sploty mienteryczne między okrężną a podłużną warstwą mięśniową, a zielona linia wyznacza granicę między błoną śluzową a warstwą mięśniową. Analizując krioprzekrój, od błony surowiczej do błony śluzowej, najpierw napotykamy cieńszą warstwę mięśni podłużnych (LM), a następnie grubszą warstwę mięśni okrężnych (CM). Przekrój powinien być równoległy do mięśni podłużnych, zatem jądra LM powinny być nieco wydłużone, podczas gdy jądra CM powinny być małe i okrągłe. Pomiędzy LM a CM znajdują się sploty mienteryczne złożone z neuronów barwionych markerem Pgp9.5. Pgp9.5 barwi również wypustki neuronalne w obrębie CM. Sieć komórek ICC mienterycznych (ICC-MY) otacza splot mienteryczny i składa się z komórek multipolarnych. W warstwie mięśni podłużnych występują rzadkie ICC domięśniowe (ICC-IMs), które są komórkami bipolarnymi biegnącymi równolegle do mięśnia. W warstwie mięśni okrężnych występuje liczne ICC-IM, które również są komórkami bipolarnymi biegnącymi równolegle do mięśni okrężnych i są przekrojone w poprzek w tym preparacie. Na połączeniu warstwy mięśniowej i błony podśluzowej znajduje się podśluzowa sieć ICC składająca się z ICC-SMP, która jest płaską siecią multipolarnych ICC. Analizując immunostaining Kit w preparatach całych fragmentów (whole mount) jelita grubego, należy spodziewać się, że w miarę ustawiania ostrości od szkiełka podstawowego (Rycina 3), najpierw napotka się sieć ICC-MY, a następnie ICC-IM warstwy CM oraz sieci ICC-SMP. Opisano pomiary wolumetryczne sieci ICC z wykorzystaniem rekonstrukcji 3D obrazów whole-mount10. Przy użyciu mikroskopu szerokopolowego w surowych obrazach występuje znaczna fluorescencja poza płaszczyzną ostrości, którą można usunąć po dekonwolucji (Rycina 3). Niepełne usunięcie błony śluzowej spowoduje wysoką fluorescencję tła. ANO1 jest innym markerem ICC, a wspólne barwienie immunochemiczne KIT i ANO1 wykazuje całkowitą zgodność barwienia ICC (Rycina 4).
Rysunek 1. Reprezentatywny preparat rozsektowanego przewodu pokarmowego myszy, przedrukowany za zgodą13.
Rysunek 2. A) Reprezentatywne barwienie H&E jelita grubego myszy w mrożonych przekrojach przygotowanych zgodnie z opisem oraz referencyjny przekrój zatopiony w parafinie, wykazujący pewne artefakty kurczenia się w przypadku mrożonych przekrojów. Żółta linia wyznacza splot mięśniowy, a niebieska linia oddziela błonę śluzową od warstwy mięśniowej. B) Reprezentacyjna podwójna immunofluorescencja Kit (czerwony, ACK-2) i Pgp9.5 (zielony) z przeciwbarwieniem DAPI (niebieski) w jelicie grubym myszy. LM: mięsień podłużny, CM: mięsień okrężny. Pasek skali 20 μm.
Rysunek 3. Reprezentatywna immunofluorescencja całego preparatu (whole-mount) z użyciem przeciwciał przeciwko Kit (czerwony, ACK-2) tego samego pola w trzech płaszczyznach ogniskowych: płaszczyzna ICC-MY na granicy LM/CM, płaszczyzna ICC-IM w obrębie CM oraz płaszczyzna ICC-SMP na granicy CM/podśluzówki. Przedstawiono obrazy surowe oraz obrazy po dekonwolucji. Pasek skali 20 μm.
Rysunek 4. Reprezentatywna podwójna immunofluorescencja białek Ano1 (zielony) i Kit (czerwony, ACK-2) w jelicie grubym. Pasek skali 20 μm.
Dyskusja
Międzytkankowe komórki Cajala zostały po raz pierwszy scharakteryzowane przez Santiago Ramóón y Cajal dokładnie wiek temu, z wykorzystaniem barwień błękitem metylenowym i chromianem srebra błony mięśniowej przewodu pokarmowego. Cajal początkowo uważał ICC za neurony ze względu na ich wypustki, które przypominają aksony i dendryty. Przez wiele następnych lat badania biologii ICC były ograniczone przez brak specyficznych markerów, aż do odkrycia, że KIT jest nie tylko ekspresjonowany w ICC, ale jest również niezbędny dla ich rozwoju6. Od tego czasu immunofluorescencja KIT jest szeroko stosowana w badaniach nad biologią ICC i doprowadziła również do uznania obecności ICC w innych organach kurczliwych, takich jak pęcherz moczowy. Niedawno jako drugi wiarygodny marker ICC zidentyfikowano ANO1.
W ciągu ostatnich 15 lat ukazało się wiele publikacji wykorzystujących immunofluorescencję do identyfikacji ICC z zastosowaniem różnych technik fiksacji i montowania. W naszych doświadczeniach najlepiej sprawdzają się krioprzekroje „utrwalone i zamrożone”, które zostały uprzednio poddane prefiksacji paraformaldehydem i zabezpieczone sacharozą, w porównaniu z utrwalaniem acetonem lub paraformaldehydem po wykonaniu krioprzekrojów. W przypadku preparatów całych tkanek ustaliliśmy, że fiksacja acetonem, a następnie wycięcie błony śluzowej, daje najbardziej wiarygodne wyniki.
Historycznie przeciwciało ACK-2 było preferowanym wyborem w badaniach ICC do identyfikacji komórek w tkankach mysich. Jest to monoklonalne przeciwciało szczurze, które rozpoznaje domenę zewnątrzkomórkową i pełni również rolę przeciwciała blokującego, wywołującego niedrożność jelit po podaniu żywym myszom. Jednak epitop ACK-2 ulega powolnej destrukcji podczas utrwalania paraformaldehydem i nie zostaje odzyskany za pomocą standardowych metod odzyskiwania antygenu. Stwierdziliśmy, że epitop ACK-4 jest bardziej odporny na utrwalanie paraformaldehydem. W porównaniu z blokami i skrawkami utrwalonymi w mrożeniu, bloki i skrawki zatopione w parafinie lepiej zachowują morfologię i są bardziej odpowiednie do długoterminowego archiwizowania (Rysunek 4). Żadne z przeciwciał, ani ACK-2, ani ACK-4, nie zostało z sukcesem zastosowane w skrawkach parafiniowych. Wykazaliśmy, że D13A2, nowe monoklonalne przeciwciało królicze, działa wyjątkowo dobrze zarówno w skrawkach utrwalonych w mrożeniu, jak i w parafiniowych skrawkach z przewodu pokarmowego.
Kit jest ekspresowany w kilku innych typach komórek, w tym w melanocytach, komórkach krwiotwórczych, komórkach zarodkowych, a w szczególności w komórkach tucznych, które występują również w przewodzie pokarmowym. Na szczęście większość komórek tucznych znajduje się w błonie śluzowej, a nie w warstwie mięśniowej. Podwójne barwienie z użyciem przeciwciał króliczych anty-Ano1 i szczurzych anty-Kit pozwala wyeliminować nieswoiste barwienie każdego z przeciwciał (Rysunek 4). Warto również zauważyć, że względna ekspresja Kit i Ano1 różni się pomiędzy podtypami ICC. Na przykład w jelicie cienkim barwienie Kit jest znacznie intensywniejsze w ICC splotu mięśniowego w porównaniu do ICC głębokiego splotu mięśniowego, podczas gdy barwienie Ano1 jest porównywalne.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Cancer Institute (K08CA140946 dla Y.C.), (5F32CA130372 dla P.C.), (R01CA102774 oraz R01HL055748 dla P.B.), Department of Defense (PC094302 dla Y.C.), Shuman Family Fund for GIST Research (dla P.C.) oraz Starr Cancer Consortium (dla P.C., Y.C., C.L.S. i P.B.). Chcielibyśmy podziękować Kati Manovzie, Ning Fan i Mesurh Turkekul z placówki MSKCC Molecular Cytology core facility za pomoc w przygotowaniu krioprzekrojów i barwieniu immunologicznym.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| przeciwciało szczurze anty-Kit (klon ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Stosować w stężeniu 2μg/ml. Epitop ulega zniszczeniu przy nadmiernej fiksacji. |
| przeciwciało szczurze anty-Kit (klon ACK-4) | Cedarlane Labs | CL8936AP | Stosować w stężeniu 2μg/ml. |
| przeciwciało królicze anty-KIT (klon D13A2) | Cell Signaling Technology | 3074 | Stosować w rozcieńczeniu 1:100. Jedyne wymienione tutaj przeciwciało, które działa skutecznie w sekcjach parafinowych. |
| przeciwciało królicze anty-Pgp9.5 | Abcam | ab10404 | Barwi cytoplazmę komórek neuronalnych. Przydatne do znakowania neuronów splotu mienterycznego. Stosować w rozcieńczeniu 1:1000. |
| przeciwciało królicze anty-Ano1 | Abcam | ab53212 | Stosować w stężeniu 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 kozie anty-szczurze IgG | Invitrogen | A-11007 | Stosować w stężeniu 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 kozie anty-królicze IgG | Invitrogen | A-11008 | Stosować w stężeniu 2μg/ml |
| igła do karmienia zwierząt | Fisher Scientific | 01-208-87 | Igła z silikonowym zakończeniem, przydatna do płukania przewodu pokarmowego dorosłych myszy |
| igła tępokrawędziowa | BD Biosciences | 305180 | Igła tępokrawędziowa, przydatna do płukania przewodu pokarmowego młodych myszy przed odsadzeniem |
| odczyn antywyblakający ProLong Gold z DAPI | Invitrogen | P-36931 | Można stosować alternatywne, twardniejące podłoża montażowe z DAPI |
| forma do mrożenia Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyd (zamknięta ampułka 10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Otworzyć zamkniętą ampułkę i rozcieńczyć do 4% bezpośrednio przed użyciem |
| bufor blokujący | 5% surowica kozia, 0,1% Triton X-100 w PBS |
Bibliografia
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , Forthcoming (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
Przedruki i uprawnienia
