Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak jajnika jest piątą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów u kobiet, a w Stanach Zjednoczonych wskaźnik śmiertelności wynosi 63%1. Typ komórek, z których wywodzą się raki jajnika, wciąż pozostaje kwestią sporną; mogą to być komórki nabłonka powierzchniowego jajnika (OSE) lub dystalnego nabłonka frędzlek jajowodów2,3. Hodowla prawidłowych komórek jako kultury pierwotnej in vitro umożliwi naukowcom modelowanie specyficznych zmian, które mogą prowadzić do raka jajnika w konkretnym nabłonku, co pozwoli na definitywne określenie typu komórek macierzystych nowotworu. Umożliwi to opracowanie dokładniejszych biomarkerów, modeli zwierzęcych z tkankowo specyficznymi zmianami genetycznymi oraz lepszych strategii zapobiegawczych skierowanych przeciwko tej chorobie.
Utrzymywanie prawidłowych komórek w hydrożelach alginianowych sprzyja krótkoterminowej kulturze in vitro komórek w ich trójwymiarowym kontekście i umożliwia wprowadzanie plazmidowego DNA, siRNA oraz małych cząsteczek. Poprzez hodowlę fragmentów organów uzyskanych dzięki strategicznym cięciom skalpelem, z jednego organu można wygenerować kilka kultur, co zwiększa liczbę eksperymentów możliwych do przeprowadzenia z jednego zwierzęcia. Cięcia te modelują aspekty owulacji prowadzące do proliferacji OSE, co jest powiązane z powstawaniem raka jajnika. Typy komórek takie jak OSE, które nie rosną dobrze na powierzchniach plastikowych, mogą być hodowane za pomocą tej metody, co ułatwia badanie prawidłowych procesów komórkowych lub najwcześniejszych zdarzeń w procesie powstawania nowotworu4.
Hydrożele alginianowe mogą być stosowane do wspomagania wzrostu wielu rodzajów tkanek5. Alginian jest liniowym polisacharydem składającym się z powtarzających się jednostek kwasu β-D-mannuronowego i kwasu α-L-guluronowego, który może być sieciowany jonami wapnia, co skutkuje łagodnym procesem żelowania, który nie uszkadza tkanek6,7. Podobnie jak inne trójwymiarowe macierze do hodowli komórkowych, takie jak Matrigel, alginian zapewnia wsparcie mechaniczne dla tkanek; jednak białka nie reagują z macierzą alginianową, w związku z czym alginian pełni funkcję syntetycznej macierzy pozakomórkowej, która nie inicjuje sygnalizacji komórkowej5. Hydrożel alginianowy unosi się w standardowej pożywce do hodowli komórkowej i wspiera architekturę wzrostu tkanek in vitro.
Przedstawiono metodę przygotowania, separacji i osadzania fragmentów jajników oraz jajowodów w hydrożelach alginianowych, które mogą być utrzymywane w kulturze do dwóch tygodni. Opisano również enzymatyczne uwalnianie komórek w celu analizy białek i próbek RNA z hodowli organów. Wreszcie, możliwe jest hodowanie pierwotnych typów komórek pochodzących od myszy bez konieczności ich nieśmiertelnienia genetycznego, co pozwala badaczom na wykorzystanie myszy z nokautem oraz myszy transgenicznych.
Protokół
1. Disekcja jajnika i izolacja tkanki
- Przygotować 0,5% (w/v) roztwór alginianu sodu, sporządzony według zmodyfikowanej wersji protokołu opisanego wcześniej5, stosując sterylny PBS i podgrzewając do 37°C. Mieszać przez odwracanie lub kołysanie, nie używać wirówki typu vortex. Nabrać alginian do strzykawki 1 ml z igłą 25 G i utrzymywać w temperaturze 37°C.
- Przygotować sterylny roztwór CaCl2 o stężeniu 10mM do sieciowania alginianu podczas enkapsulacji tkanki i ogrzać do 37°C.
- Przygotować 1mL pożywki hodowlanej (αMEM + 5 jednostek penicyliny i 5 μg/ml streptomycyny) na dołek w płytce 24-dołkowej dla każdego eksperymentu. Do pożywki hodowlanej dodać odpowiednie leki, peptydy lub wirusy. W przypadku transfekcji przed enkapsulacją organu, inkubować tkankę z Lipofectamine 2000 i plazmidowym DNA przez cztery godziny w temperaturze 37 °C.
- Wypreparować organy z organizmu zwierzęcia, usunąć tłuszcz lub pozostałości tkanki, delikatnie oderwać błonę kalekową otaczającą jajnik i przeciąć jajnik lub jajowód na cztery części poprzez dwukrotne przedzielenie organu. Zwierzęta zostały poddane eutanazji poprzez uduszenie CO2 z następującym zwichnięciem stawów obręczy szyjnej. W przypadku jajowodu, delikatnie rozwinąć tkankę, rozdzielając łączące ją błony i rozciągając końce rurki w przeciwnych kierunkach za pomocą pęsety przed przecięciem.
- Nanieść pojedynczą kroplę alginianu (~1-3 μL) na wysterylizowane włókno siatkowe.
- Za pomocą sterylnej pęsety przenieść fragment organu do kropli alginianu i wycentrować kroplę, używając pęsety lub sterylnej igły.
- Odwrócić kroplę zawierającą fragment organu (organoid), chwytając włókno siatkowe sterylną pęsetą i obracając je do góry nogami, aby grawitacja wymusiła uformowanie się wiszącej kropli alginianu.
- Stukać pęsetą o krawędź 10cm szalki Petriego zawierającej roztwór 10mM CaCl2, tak aby kropla wpadła do roztworu.
- Inkubować przez 2 minuty, usunąć za pomocą sterylnej łyżki z otworami, aby odprowadzić nadmiar 10mM CaCl2, i przenieść do pożywki hodowlanej. Do jednego dołka płytki 24-dołkowej zawierającego pożywkę hodowlaną można przenieść do czterech żeli alginianowych. Hodować przez określony czas.
2. Degradacja alginianu i zbieranie komórek
- W celu solubilizacji żelu alginianowego inkubować hodowle w liazie alginianowej (3,4 mg/ml) rozpuszczonej w pożywce Leibovitz's L-15 w temperaturze 37°C przez 30 minut lub do całkowitego rozpuszczenia żelu.
- Usunąć tkankę z lizy alginianowej.
- W celu wyizolowania OSE, inkubować organoid z 500 jednostkami kolagenazy w pożywce Leibovitz's L-15 przez 1 godzinę8. Wymieszać w vortexie w 2-sekundowych impulsach (2 sekundy mieszania i 2 sekundy przerwy) przy średniej mocy przez 1 minutę, a następnie w 1-sekundowych impulsach (1 sekunda mieszania i 1 sekunda przerwy) przez 1 minutę. Pozostawić fragmenty organu do opadnięcia na dno probówki do mikrocentryfugi i przenieść nadsącz pipetą do nowej, sterylnej probówki do mikrocentryfugi. Wirować przez 3 minuty przy 3000 rpm, aby uzyskać osad nabłonka powierzchni jajnika.
- W celu wyizolowania nabłonka jajowodu, przeciąć jajowód wzdłużnie i umieścić na plastiku do hodowli tkankowych w pożywce DMEM z dodatkiem 5 jednostek penicyliny, 5 μg/ml streptomycyny oraz 4% (v/v) FBS. W ciągu 3–5 dni komórki „wyjdą” z zrębu jajowodu i zaczną rosnąć na plastiku do hodowli tkankowych9.
3. Fixacja kultur narządowych enkapsulowanych w alginianie do przygotowania przekrojów parafinowych
- Pobrać kuleczki z enkapsulowanym alginianem z pożywki hodowlanej w wybranym punkcie czasowym.
- Ponownie sieciować alginian w celu utwardzenia żelu, przenosząc hodowlę do sterylnego 10mM roztworu CaCl2 na dwie minuty.
- Utrwalić organ enkapsulowany w alginianie w 2% paraformaldehydzie zawierającym 50 mM sacharozę, 10 mM CaCl2 oraz 50 mM kdakodylan sodu, aby zapewnić zachowanie stanu stałego żelu i pełną enkapsulację tkanki podczas utrwalania.
- Po obróbce tkanki zatopić cały fragment hodowli organu enkapsulowanego w alginianie w parafinie i wykonać przekroje za pomocą mikrotomu, aby uzyskać skrawki o grubości 5 μm.
- W przypadku wykonywania immunohistochemii alginian zostanie rozpuszczony i usunięty z preparasułu ze względu na termiczną odsłonę antygenów. Podczas standardowego barwienia hematoksyliną i eozyną alginian pozostanie i zostanie zabarwiony eozyną.
4. Reprezentatywne wyniki:
Przykład trójwymiarowej hodowli organowej jajnika i jajowodu przedstawiono na Rysunku 1. Jajniki można pociąć na fragmenty o różnych rozmiarach, a OSE proliferują i migrują, aby naprawić powierzchnię uszkodzoną podczas nacięcia skalpelem. W trakcie tego procesu zachowana zostaje prawidłowa orientacja OSE względem leżącego poniżej zrębu, przy czym OSE otula jajnik. Jak pokazano na Rysunku 2, OSE jajników przeciętych na pół otulają jajnik bardziej całkowicie w porównaniu do jajników przeciętych na ćwiartki lub ósme części. Naprawa rany powierzchni jajnika może być badana w kontekście całego organu i może rzucić światło na to, w jaki sposób owulacja i naprawa powierzchni indukują transformację powierzchni jajnika.
Punkt końcowy eksperymentu zależy od wymaganych informacji. Architekturę tkanki, morfologię komórkową i specyficzne tempo wzrostu komórek można łatwo monitorować, wykorzystując skrawki parafinaowe. Na przykład, po 7 dniach hodowli w bezserwatkowym αMEM obserwuje się pojedynczą warstwę nabłonka powierzchniowego jajnika (Rycina 3A), podczas gdy dodanie 5 μg/ml insuliny przez 7 dni indukuje hiperproliferację nabłonka powierzchniowego jajnika i tworzenie wielu warstw komórek (Rycina 3B). Proliferację komórek można zmierzyć poprzez dodanie bromodeoksyurydyny do hodowli w końcowym stężeniu 10 μM na 24 h przed utrwaleniem (wstawki 3A i 3B). W przypadku hodowli utrzymywanych w bezserwatkowym αMEM, około 3-5% OSE ulega proliferacji podczas 24-godzinnego okresu znakowania (wstawka 3A), podczas gdy proliferuje większy odsetek komórek granulosa. Dodanie insuliny do pożywki zwiększa odsetek proliferujących OSE do około 30% całkowitej liczby OSE (wstawka 3B). Immunofluorescencję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) można wizualizować przez żel alginianowy za pomocą standardowej mikroskopii po transfekcji cDNA (Rycina 3C). Chociaż organokultura w alginianie umożliwia wzrost i analizę nabłonka powierzchniowego jajnika oraz pęcherzyków pierwotnych, należy zauważyć, że dojrzałe pęcherzyki wtórne nie przeżywają w tym systemie hodowlanym (Rycina 3D). Hodowla poszczególnych pęcherzyków do momentu dojrzewania w matrycy hydrożelu alginianowego została opisana w innym opracowaniu10.
Zmiany w białkach lub RNA można analizować z całego narządu lub z konkretnych typów komórek, wykorzystując degradację enzymatyczną (Ryc. 4). Traktowanie hodowanych organoidów jajnika kolagenazą pozostawia nienaruszone leżące u podstawy podścielisko (Ryc. 4C), umożliwiając jednocześnie wzbogacenie OSE w osad komórkowy uzyskany po zabiegu, choć izolowane są również niektóre komórki z podścieliska (Ryc. 4D).
Rycina 1. Trójwymiarowy system hodowli jajnika myszy stosowany do namnażania OSE po zranieniu. A) Pod mikroskopem usunięto kaletkę i otaczającą ją poduszkę tłuszczową. B) Nieuszkodzony jajnik (O) z jajowodem (T) i poduszką tłuszczową (F). C) Jajnik po usunięciu kaletki i poduszki tłuszczowej (lewo) oraz rozwinięty jajowód (prawo). D) Organoidy jajnika lub jajowodu umieszczono w kropelce alginianu. E) Organoidy zamknięte w alginianie naniesiono do roztworu CaCl2, co spowodowało sieciowanie alginianu i utworzenie żelu. F) Organoid jajnika zamknięty w alginianie. G) Organoid jajowodu zamknięty w alginianie. H) Organoidy zamknięte w alginianie inkubowane w pożywce hodowlanej.
Rycina 2. Powierzchnia zregenerowana przez nabłonek powierzchni jajnika mierzona za pomocą cytokeratyny 8. Enkapsulacja organoidów jajnika przez OSE po pocięciu na ósemki, ćwiartki i połowy, hodowli w medium BSA oraz pomiarze za pomocą analizy immunohistochemicznej z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko cytokeratynie 8 (CK8).
Rycina 3. System hodowlany alginianowy umożliwia przenikanie czynników wzrostu oraz transfekcję cDNA do OSE, lecz nie wspiera szybkiego wzrostu i dojrzewania pęcherzyków. A) Organoid jajnika hodowany przez 7 dni w pożywce podstawowej, analizowany pod kątem ekspresji CK8, która znakuje OSE. Wstawka: sekcje seryjne barwione na wbudowanie BrdU. B) Dodanie insuliny do pożywek hodowlanych indukuje hiperplazję OSE. Wstawka: sekcje seryjne barwione na wbudowanie BrdU. C) Organoid jajnika transfekowany cDNA w celu ekspresji GFP. D) System hodowlany alginianowy wspiera wzrost pęcherzyków pierwotnych (czerwona grot strzałki), ale nie dojrzałych pęcherzyków wtórnych (czarna strzałka).
Rycina 4. OSE można wyizolować do analizy po hodowli. A) Organoid hodowany w medium przez okres do 2 tygodni. B) Inkapsulowany organoid traktowany alginianiazą w celu pozostawienia organoidu w stanie nienaruszonym. Jajnik zabarwiono CK8, aby zaznaczyć OSE. C) Organoid traktowany kolagenazą w celu oddzielenia OSE od leżącego pod nim zrębu. Pozostały fragment tkanki zabarwiono CK8, aby uwidocznić usunięcie powierzchni jajnika. D) Zebrane po obróbce komórki są wzbogacone o OSE, co wykazuje barwienie CK8 (czerwone). Komórki poddano przeciwbarwieniu DAPI w celu zaznaczenia jąder.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowanie trójwymiarowego systemu hodowli organów z wykorzystaniem hydrożeli alginianowych stanowi wszechstronną metodę analizy wielu różnych typów tkanek pochodzących z szerokiej gamy organizmów. Zastosowanie hodowli 3D można rozszerzyć na dziedziny inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, ponieważ zapewnia ono rusztowanie, na którym mogą rozwijać się komórki11. Obecnie w naszym laboratorium prowadzone są wstępne badania z wykorzystaniem ludzkiej tkanki jajnika i jajowodu; opisano jednak hodowlę mies...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak informacji do ujawnienia.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez Ovarian Cancer Research Fund [grant LT/UIC/01.2011], UIC Center for Clinical and Translational Science, UIC Cancer Center oraz National Institutes of Health w ramach grantu C06RR15482.
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez AAALAC, zgodnie z protokołami opieki nad zwierzętami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na UIC. Zwierzęta biorące udział w projekcie są utrzymywane w pomieszczeniach barierowych w Laboratorium Zasobów Biologicznych (BRL) na Uniwersytecie Illinois w Chicago. BRL dysponuje pełnym personelem weterynaryjnym, który monitoruje zwierzęta co najmniej dwa razy dziennie i udziela porad w zakresie opieki nad nimi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka Leibovitz L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Pożywka αMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Alginian sodu | NovaMatrix | ||
| Kakodylan sodu | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Włókno z siatki polipropylenowej | McMaster-Carr | rolka o szerokości 45"; oczka 0.0041" | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicylina/streptomycyna | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Liazą alginianowa | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | Z Clostridium histolyticum |
| Seryjna albumina wołowa | MP Biomedicals | 103700 | |
| Płodowa surowica wołowa | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| Roztwór ITS | Roche Group | 11074547001 | Insulina/transferyna/selenic sodu |
| Przeciwciało przeciwko cytokerytynie 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Stosować w rozcieńczeniu 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoksyurydyna | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Stężenie końcowe 10 μM |
Bibliografia
- Jemal, A. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as biomaterials. Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. Gonadotropins and ovarian cancer. Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
