Opisano wydajną metodę oceny ekspozycji powierzchniowej białek leptospir. Metoda ta została zaprojektowana specjalnie w celu uniknięcia uszkodzenia delikatnej błony zewnętrznej komórek leptospir. Technika ta wymaga zastosowania kilku kontroli negatywnych w celu oceny integralności błony zewnętrznej oraz specyficzności reakcji przeciwciał.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza immunofluorescencyjna białek powierzchniowych leptospir**
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białka powierzchniowe bakterii biorą udział w bezpośrednim kontakcie z komórkami gospodarza oraz w pobieraniu składników odżywczych ze środowiska 1. Z tego powodu lokalizacja komórkowa może dostarczyć informacji na temat funkcjonalnej roli białek bakteryjnych. Lokalizacja powierzchniowa białek bakteryjnych jest kluczowym krokiem w kierunku identyfikacji czynników wirulencji zaangażowanych w mechanizmy patogenności.
Metody frakcjonowania błon leptospiralnych 2-5 mogą być selektywne dla określonej klasy białek błony zewnętrznej (OMPs), takich jak lipoproteiny w przeciwieństwie do transbłonowych OMPs, co może prowadzić do błędnej klasyfikacji. Jest to prawdopodobnie spowodowane różnicami strukturalnymi oraz sposobem ich powiązania z błoną zewnętrzną. Lipoproteiny wiążą się z błonami poprzez oddziaływanie hydrofobowe między lipidową częścią N-końcową (trzema kwasami tłuszczowymi) a fosfolipidami dwuwarstwy lipidowej 6, 7. Z kolei transbłonowe OMPs są zazwyczaj wbudowane w dwuwarstwę lipidową za pomocą amfipatycznych beta-harmonijek (β-sheets) ułożonych w strukturę beczułkowatą 8, 9. Ponadto obecność białka w błonie zewnętrznej nie gwarantuje koniecznie, że białko to lub jego domeny są eksponowane na powierzchni. Błony zewnętrzne krętków są znane z tego, że są kruche, co wymaga stosowania metod obejmujących delikatne manipulowanie komórkami oraz uwzględnienia kontroli białek podpowierzchniowych w celu oceny integralności błony zewnętrznej.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę testu immunofluorescencji (IFA) do bezpośredniej oceny ekspozycji powierzchniowej białek na nienaruszonych leptospirach. Metoda ta opiera się na rozpoznawaniu białek powierzchniowych leptospir przez przeciwciała swoiste względem antygenu. W opisanym badaniu wykrywane są przeciwciała swoiste dla OmpL5410 po ich związaniu z natywnymi, eksponowanymi na powierzchni epitopami. Porównanie reaktywności przeciwciał względem komórek nienaruszonych i permeabilizowanych umożliwia ocenę dystrybucji komórkowej oraz ustalenie, czy dane białko znajduje się selektywnie na powierzchni leptospir. Integralność błony zewnętrznej należy ocenić przy użyciu przeciwciał przeciwko jednemu lub kilku białkom podpowierzchniowym, najlepiej zlokalizowanym w periplazmie.
Metodę IFA powierzchniowej można wykorzystać do analizy ekspozycji powierzchniowej każdego białka leptospiralnego, do którego dostępne są swoiste przeciwciała. Zarówno użyteczność, jak i ograniczenia tej metody zależą od tego, czy zastosowane przeciwciała są w stanie wiązać się z epitopami natywnymi. Ponieważ przeciwciała są często wytwarzane przeciwko białkom rekombinowanym, epitopy natywnych białek eksponowanych na powierzchni mogą nie zostać rozpoznane. Niemniej jednak, metoda IFA powierzchniowa jest cennym narzędziem do badania składników nienaruszonych powierzchni bakteryjnych. Metodę tę można stosować nie tylko w przypadku leptospir, ale także innych krętków i bakterii gram-ujemnych. W celu sformułowania bardziej jednoznacznych wniosków dotyczących ekspozycji powierzchniowej OMP, zaleca się kompleksowe podejście obejmujące kilka metod lokalizacji komórkowej 10.
Protokół
1. Fixacja Leptospira na szkiełkach przedmiotowych
- Leptospira interrogans jest patogenem klasy BSL2. Praca z żywymi komórkami wymaga zachowania odpowiednich środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego oraz wykonywanie etapów pipetowania w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Hodować Leptospira w podłożu EMJH1 z dodatkiem 1% surowicy króliczej w temperaturze 30° C aż do osiągnięcia środkowej lub późnej fazy logarytmicznej (gęstość 5 x 107 do 5 x 108 komórek/ml) przez około 6 dni.
- Zbiór kultury należy przeprowadzić poprzez wirowanie przy przyspieszeniu ok. 20 x g przez 7 min w temperaturze pokojowej.
- Usunąć nadsącz poprzez aspirację, a następnie delikatnie resuspendować osad w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem 5 mM MgCl2.2, pH 7,2 do stężenia końcowego 5 x 108 komórek/ml.
- Do każdej studni szkiełek przedmiotowych z dwiema komorami należy dodać 1 ml zawiesiny komórkowej, a następnie inkubować w 30° C przez 80 min, aby umożliwić adhezję komórek.
- Ostrożnie usuń ciecz zawierającą niezwiązane komórki poprzez aspirację.
- Utrwal pozostałe nienaruszone bakterie na szkiełkach przedmiotowych, dodając 1 ml/dołek 2% paraformaldehydu w PBS z 5 mM MgCl2.2Inkubować przez 40 min w temperaturze 30° CPreparaty te będą służyć do oceny białek eksponowanych na powierzchni.
- W przypadku preparatów kontrolnych służących do oceny białek podpowierzchniowych, należy przepuścić błonę zewnętrzną poprzez utrwalenie za pomocą 1 ml/dołka 10% lodowatego metanolu. Inkubować w temperaturze -20° C przez 20 min. Metanol działa w kilku obszarach: zwiększa przepuszczalność błony zewnętrznej, denaturuje białka i utrwala komórki na szkiełkach przedmiotowych.
- Usunąć środki utrwalające poprzez aspirację.
2. Markowanie swoistymi przeciwciałami
- Zablokuj wiązania niespecyficzne, dodając 1 ml/dołek buforu blokującego (Difco Leptospira Enrichment EMJH). Inkubuj w temperaturze 30° C przez 90 min.
- Rozcieńcz swoiste przeciwciała (immunologiczne sera królicze lub mysie przeciwciała monoklonalne, w tym przypadku poliklonalne sera królicze swoiste dla OmpL5410, FlaA112 oraz OmpL113) oraz sera królicze przedimmunizacyjne lub mysi płyn ascytyczny nie zawierający przeciwciał (stosowane jako kontrole negatywne) w buforze blokującym. Rozcieńczenia dla każdego przeciwciała należy wyznaczyć empirycznie, w zależności od miana przeciwciał, reaktywności antygen-przeciwciało oraz zawartości białka w komórce. Zwyczajny zakres rozcieńczeń wynosi od 1:50 do 1:60.
- Usuń bufor blokujący za pomocą aspiratora i dodaj 1 ml/dołek rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych.
- Inkubuj w temperaturze 30° C przez 1h.
- Usuń ciecz za pomocą aspiratora i przemyj dołki trzykrotnie przy użyciu PBS (1 ml/dołek).
3. Wizualizacja leptospir
- Do każdej studni dodaj 1 ml przeciwciał wtórnych znakowanych Alexa Fluor 48 (kozich anty-rabbit IgG lub kozich anty-mouse IgG) rozcieńczonych 1:20 oraz fluorescencyjnego barwnika kwasów nukleinowych, dihydrochlorku 4’,6-diamidyno-2-fenylopentanu (DAPI), rozcieńczonego do stężenia końcowego 0,25 μg/ml w buforze blokującym. Ten etap służy odpowiednio do wykrycia wiązania przeciwciał oraz obecności wszystkich krętków, niezależnie od wiązania przeciwciał.
- Inkubuj preparaty w temperaturze 30° C przez 45 min.
- Usuń ciecz poprzez aspirację, a następnie przemyj studnie dwukrotnie PBS i raz wodą destylowaną (1 ml/studnia).
- Zdejmij komory oraz pasek klejący z szkiełek przedmiotowych i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez ok. 10 min.
- Nałóż medium montażowe zapobiegające blaknięciu ProLong Gold (2 x 20 μl na szkiełko) oraz nakrywek 24 x 50 mm.
- Inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Krok ten jest niezbędny, aby medium montażowe mogło utwardzić się.
- Zabezpiecz nakryvkę lakierem do paznokci.
- Wizualizuj barwienie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używając filtra detekcyjnego cyjanowego/niebieskiego dla DAPI oraz filtra detekcyjnego zielonego dla Alexa Fluor 48. Aby zapewnić dokładną reprezentację próbek, należy ocenić cały obszar komory dla każdej próbki.
- Zapisz dane, wykonując obrazowanie reprezentatywnego pola dla każdej próbki. Podczas obrazowania fluorescencji Alexa Fluor 48 zastosuj ten sam czas ekspozycji dla wszystkich próbek. Zastosowanie spójnego czasu ekspozycji pozwoli na dokładniejsze porównanie wyników dla antygenów testowych względem kontroli.
4. Reprezentatywne wyniki:
Przykłady wyników powierzchniowej metody IFA dla komórek Leptospira interrogans z użyciem przeciwciał przeciwko białkom powierzchniowym i podpowierzchniowym przedstawiono na rysunku 2. Test uznaje się za pozytywny, gdy w próbkach z nienaruszonymi leptospirami wykryta zostanie znaczna fluorescencja dla badanego białka eksponowanego na powierzchni (Rys. 2A). Zazwyczaj w przypadku testu pozytywnego (tutaj: białko OmpL54 eksponowane na powierzchni) obserwuje się zbliżoną intensywność fluorescencji zarówno w komórkach nienaruszonych, jak i permeabilizowanych (Rys. 2A). Niezbędne jest uwzględnienie kontroli negatywnej dla integralności błony zewnętrznej przy użyciu przeciwciał przeciwko białku podpowierzchniowemu, najlepiej periplazmatycznemu (np. leptospiralnemu FlaA1, Rys. 2B). Dopiero gdy dane wykażą, że błona zewnętrzna pozostała nienaruszona podczas eksperymentu, tj. przeciwciała przeciwko białku podpowierzchniowemu nie reagują z nienaruszonymi komórkami (brak fluorescencji lub fluorescencja znacznie słabsza w porównaniu z próbką permeabilizowaną, jak na Rys. 2B), można wyciągnąć wniosek, że badane białko(a) jest eksponowane na powierzchni. W celu uzyskania jednoznacznych danych niezbędne jest włączenie do eksperymentów surowic przedimmunizacyjnych (w przypadku przeciwciał poliklonalnych) jako dodatkowej kontroli negatywnej; nie powinny one dawać znacznej fluorescencji w komórkach nienaruszonych ani permeabilizowanych (Rys. 2A, 2C). Barwienie DAPI jest konieczne do wizualizacji leptospir w przypadku uzyskania wyników negatywnych (brak fluorescencji Alexa Fluor 48). Akceptywalną alternatywą dla DAPI jest przeciwbarwienie jodkiem propidium.
Metoda ta ma charakter jakościowy, a nie ilościowy, ponieważ silniejsza fluorescencja może wynikać z rozpoznawania wielu eksponowanych na powierzchni epitopów antygenowych w obrębie jednego antygenu w porównaniu do innych antygenów o tej samej obfitości, ale z mniejszą liczbą epitopów powierzchniowych. W związku z tym intensywność fluorescencji może służyć jedynie do porównywania reaktywności tych samych przeciwciał, na przykład w przypadku komórek nienaruszone kontra permeabilizowanych, a nie do porównywania intensywności fluorescencji różnych białek. Rozróżnienie to jest istotne w przypadku uzyskania niejednoznacznego wyniku, w którym w komórkach nienaruszonych obserwuje się znacznie słabszą fluorescencję niż w komórkach permeabilizowanych (Rys. 2C). Taki wynik wskazuje, że białko znajduje się w lokalizacji podpowierzchniowej (przy pewnym nieswoistym barwieniu tła komórek nienaruszone), przeciwciała wiążą się preferencyjnie z epitopami nienatywnymi, które zostają odsłonięte po permeabilizacji metanolem, lub białko może posiadać wiele miejsc lokalizacji, jak opisano dla białek Erp i Elp innej krętkicy, Borrelia burgdorferi14. W każdym z tych przypadków niejednoznaczny wynik IFA, taki jak ten, wymaga zastosowania alternatywnych podejść, np. biotinylacji powierzchniowej lub proteolizy powierzchniowej, aby określić, czy badane białko jest eksponowane na powierzchni, czy nie 10.
Rycina 1. Schemat analizy immunofluorescencyjnej powierzchni krętków Leptospira interrogans. Najpierw do każdej studni szkiełek z dwukomorową komorą (co najmniej dwa szkiełka dla każdego eksperymentu) dodaje się 1 ml zawiesiny komórkowej i inkubuje w celu przytwierdzenia leptospir. Następnie leptospiry utrwala się na szkiełkach komorowych poprzez dodanie 1 ml/studnię 2% paraformaldehydu (PFA) w przypadku próbek z nienaruszoną błoną zewnętrzną (OM) lub 1 ml/studnię 10% zimnego metanolu w przypadku próbek z permeabilizowaną błoną OM. Następnie leptospiry inkubuje się z przeciwciałami rozpoznającymi białka eksponowane na powierzchni oraz przeciwciałami kontrolnymi przeciwko białkom podpowierzchniowym (przeciwciała pierwotne) w 30° C przez 90 min. Następnie przeciwciała pierwotne są wykrywane poprzez inkubację z 1 ml/dołek przeciwciał wtórnych sprzężonych z Alexa Fluor 48. Na koniec komórki są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 2. Analiza immunofluorescencji powierzchniowej białek leptospir. Spirochety *Leptospira interrogans* poddano badaniu z użyciem serum odpornościowego i przedimmunizacyjnego; w przypadku wyników negatywnych zastosowano przeciwbarwienie DAPI w celu wykazania obecności spirochet. Do detekcji wiązania znakowanego Alexa Fluor 48 przeciwciała wtórnego z białkami eksponowanymi na powierzchni użyto filtra fluorescencji zielonej, natomiast do detekcji wiązania DAPI z DNA komórkowym użyto filtra fluorescencji niebiesko-cyjanowej. A) Leptospiry poddane badaniu z przeciwciałami rozpoznającymi białko eksponowane na powierzchni, OmpL5410B) Komórki znakowane przeciwciałami przeciwko białku podpowierzchniowemu periplazmy, FlaA1 (kontrola negatywna). C) Komórki znakowane przeciwciałami przeciwko porynie leptospiralnej, OmpL1. Wiązanie surowic króliczych z leptospirami wykryto za pomocą fragmentów IgG kozich przeciwko króliczym sprzężonych z Alexa Fluor 48. Wszystkie obrazy wykonano przy czasie ekspozycji wynoszącym 4 s.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasza technika powierzchniowej IFA jest podobna do tej, której użyto do wykazania ekspozycji powierzchniowej różnych białek borrelialnych 15, 16 oraz leptospiralnych 12, 17. Szczegóły opisanej tutaj metody powierzchniowej IFA zostały opracowane w celu zminimalizowania manipulacji komórkami, aby zachować integralność błony zewnętrznej, wykorzystując jednocześnie tendencję komórek Leptospira do przylegania do szkiełek przedmiotowych. Metoda ta zakłada zastosowanie niższego stężenia (2% zamiast 4%) par...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsze badanie zostało sfinansowane z grantu Public Health Service AI-34431 (przyznanego D.A.H.) z National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz z funduszy VA Medical Research Funds (przyznanych D.A.H.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełka przedmiotowe z dwiema komorami | Lab-Tek | 177380 | |
| Surowica królika | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Pożywka wzbogacona EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 przeciwko IgG (H+L) królika, kozie | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 przeciwko IgG (H+L) myszy, kozie | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidyno-2-fenyloindol dihydrochlorek (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Medium montażowe ProLong Gold anti-fade | Invitrogen | P36930 | Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej |
| Lampki cover glass Fisherfinest Premium | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
Bibliografia
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
