Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Streszczenie

Fundamentalnym celem zarówno neuronauki podstawowej, jak i klinicznej jest lepsze zrozumienie tożsamości, składu molekularnego oraz wzorców łączności charakterystycznych dla neuronów w mózgu zdrowym i chorobowym. W tym celu ogromny wysiłek poświęcono na tworzenie wysokorozdzielczych map neuroanatomicznych^1-3. Rozwój genetyki molekularnej oraz postępy w mikroskopii świetlnej umożliwiły badanie nie tylko morfologii neuronów, ale także składu molekularnego i komórkowego pojedynczych neuronów oraz powiązanych z nimi sieci⁴. Znaczący postępy w możliwości znakowania i manipulowania neuronami za pomocą technologii transgenicznych oraz celowania genowego u gryzoni pozwalają obecnie badaczom na dowolne „programowanie” podzbiorów neuronów^5-6. Prawdopodobnie jednym z najbardziej wpływowych wkładów w współczesną neuronaukę było odkrycie i klonowanie genów kodujących białka fluorescencyjne (FPs) u bezkręgowców morskich^7-8, a następnie ich inżynieria, która doprowadziła do powstania stale rozszerzającego się zestawu niezbędnych reporterów⁹. Wykorzystanie specyficznej dla typu komórek aktywności promotora do kierowania celowanej ekspresji FP w dyskretnych populacjach neuronów pozwala obecnie na prowadzenie badań neuroanatomicznych z precyzją genetyczną.

Inżynieria ekspresji białek FP w neuronach znacząco poprawiła nasze zrozumienie struktury i funkcji mózgu. Jednak obrazowanie pojedynczych neuronów oraz powiązanych z nimi sieci w głębokich tkankach mózgu lub w trzech wymiarach wciąż stanowi wyzwanie. Ze względu na wysoką zawartość lipidów tkanka nerwowa jest dość nieprzezroczysta i wykazuje autofluorescencję. Te wrodzone właściwości biofizyczne utrudniają wizualizację i obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych neuronów z wysoką rozdzielczością przy użyciu standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej na głębokościach przekraczających kilkanaście mikronów. Aby obejść ten problem, badacze często stosują metody obrazowania i rekonstrukcji seryjnych cienkich przekrojów¹⁰ lub dwufotonową mikroskopię skaningową¹¹. Obecnymi wadami tych podejść są odpowiednio: pracochłonne przygotowanie tkanek lub zbyt kosztowna aparatura.

W niniejszej pracy przedstawiamy stosunkowo szybką i prostą metodę wizualizacji komórek znakowanych fluorescencyjnie w utrwalonych, półgrubych skrawkach mózgu mysiego poprzez optyczne klarowanie i obrazowanie. W załączonym protokole opisujemy metody: 1) utrwalania tkanki mózgowej in situ poprzez perfuzję wewnątrzsercową, 2) wycięcia i usunięcia całego mózgu, 3) zatapiania mózgu w agarozie, 4) precyzyjnego przygotowania półgrubych skrawków przy użyciu nowoczesnego wibratomu, 5) klarowania tkanki mózgowej przy użyciu gradientu glicerolu oraz 6) montowania na szkiełkach przedmiotowych do mikroskopii świetlnej i rekonstrukcji stosu z (Rysunek 1).

Do przygotowania skrawków mózgu zastosowaliśmy stosunkowo nowe urządzenie o nazwie „Compresstome” VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Jest to półautomatyczny mikrotom wyposażony w zmotoryzowany system posuwu i wibracji ostrza, o funkcjach zbliżonych do innych wibrotomów. W przeciwieństwie do innych wibrotomów, tkanka do cięcia jest osadzona w agarozy wewnątrz cylindra ze stali nierdzewnej. Tkanka jest wysuwana z cylindra na pożądaną grubość i przecinana przez przesuwające się do przodu wibrujące ostrze. System z zastosowaniem cylindra z agarozą umożliwia powtarzalne mocowanie tkanki, jej wyrównanie oraz precyzyjne cięcie. W naszych doświadczeniach „Compresstome” pozwala na uzyskanie wysokiej jakości skrawków tkankowych do elektrofizjologii, immunohistochemii oraz bezpośredniego mocowania i obrazowania utrwalonej tkanki. W połączeniu z metodą przezrocznienia optycznego demonstrujemy tutaj przygotowanie półgrubych utrwalonych skrawków mózgu do wysokorozdzielczego obrazowania fluorescencyjnego.

Protokół

1. Fixacja mózgu in situ

*Przygotować strzykawkę 10 ml (igła 28 G) wypełnioną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
*Przygotować strzykawkę 10 ml (igła 28 G) wypełnioną 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS. Odstawić dodatkowe 5-10 ml PFA/PBS do późniejszej fiksacji.

1. Wstrzyknij myszy doświadczalnej dootrzewnowo dawkę śmiertelną Avertinu lub Nembutalu.
2. Po uśpieniu myszy zwilż brzuch etanolem i przymocuj zwierzę do dna tacy wyłożonej korkiem, woskiem lub elastomerem silikonowym za pomocą szpilek sekcyjnych. Ustawiając brzuch do góry, przymocuj cztery łapy do powierzchni, rozsuwając je najszerzej jak to możliwe.
3. Chwyć skórę pęsetą na wysokości mostka i przetnij ją w poprzek, aby odsłonić wątrobę. Przetnij tkankę bocznie, a następnie w górę przez żebra i przeponę. Usuń płat tkanki żebrowej i kontynuuj cięcie, aż serce stanie się dostępne.
4. Przebij lub przetnij prawy przedsionek, aby odprowadzić krew z krwiobiegu.
5. Wypłucz pozostałą krew z układu krążenia poprzez perfuzję PBS przez lewą komorę.
6. Korzystając z tego samego otworu po igle, utrwal całą mysz poprzez następczą perfuzję PBS/PFA przez lewą komorę.

2. Disekcja i wyodrębnianie mózgu

1. Usuń skórę z głowy, szyi i czaszki, przecinając tkankę wokół kanału słuchowego i oczodołów, a następnie odsuń skórę w kierunku przednim, aby odsłonić czaszkę.
   *Ilustrację kroków od 2.2) do 2.5) przedstawiono na Rysunku 2
2. Za pomocą nożyczek do kości wykonaj cięcie poprzeczne od oczodołu przez małżowiny nosowe. Powtórz tę czynność po obu stronach. Cięcie poprzeczne powinno znajdować się przed oczami i opuszki węchowymi.
3. Wykonaj cięcia wzdłużne od każdego kanału słuchowego do oczodołu.
4. Za pomocą małych nożyczek do sekcji przetnij płytkę kości potylicznej nad móżdżkiem, prowadząc cięcie od jednego kanału słuchowego do drugiego.
5. Tymi samymi nożyczkami do sekcji przetnij tkankę w kierunku przednim wzdłuż linii środkowej do poziomu opuszek węchowych.
6. Za pomocą pęsety usuń każdą płytkę kostną z mózgu, uważając, aby usunąć wszelką tkankę łączną, tak aby mózg pozostał nienaruszony podczas zdejmowania kości.
7. Przetnij nerwy wzrokowe i czaszkowe, przetnij górne kręgi szyjne i przełóż mózg do utrwalacza.
8. Przeprowadź do-utrwalanie przez 1-2 hrs w 4° C. Przemyj 3 razy po 15 min w PBS.

3. Osadzanie w agarozie

1. Roztopić 2% agarozę typu I-B o wysokiej wytrzymałości i niskim punkcie żelowania (numer katalogowy Sigma: A0576) w soli PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej.
2. Przenieść roztopioną agarozę do probówki. Umieścić probówkę w ciepłym inkubatorze lub łaźni wodnej (40°-41° C) do momentu wyrównania temperatury.
3. Przykleić utrwaloną tkankę mózgu do tłoka strzykawki do próbek za pomocą kleju cyjanoakrylowego (Rysunek 3A). Nanieść pędzlem cienką warstwę nasyconego roztworu sacharozy w PBS na powierzchnię tkanki mózgu, aby ułatwić późniejsze oddzielenie pierścienia agarozy od skrawków mózgu.
4. Wcisnąć tłok z tkanką mózgu do obudowy tłoka (Rysunek 3B).
5. Pipetować lub wlać ciepłą agarozę do obudowy tłoka, zakrywając tkankę mózgu. Unikać zamykania pęcherzyków powietrza w agarozie. Pęcherzyki powietrza w agarozie pogorszą jakość skrawków.
6. Zacisnąć strzykawkę do próbek w zimnym (0° do -25° C) bloku chłodzącym na 1 minutę w celu utwardzenia agarozy (Rysunek 3C).

4. Sekcjonowanie skrawka mózgu za pomocą urządzenia Compresstome

1. Zamontuj strzykawkę z próbką zawierającą tkankę mózgu w urządzeniu Compresstome (Rycina 3D).
2. Ustaw krawędź żyletki w bliskiej odległości od wylotu strzykawki z próbką (Rycina 3E).
3. Napełnij zbiornik buforowy roztworem PBS.
4. Obróć mikrometr o wartość odpowiadającą grubości jednego przekroju, aby wysunąć blok tkanki mózgu w agarozie ze strzykawki z próbką.
5. Naciśnij przycisk „start” na jednostce sterującej urządzenia Compresstome, aby rozpocząć proces sekcjonowania.
6. Powtarzaj kroki 4.4) i 4.5), aż do uzyskania pożądanej liczby przekrojów o określonej grubości.
7. Zbierz przekroje mózgu za pomocą pędzelka lub pipety i przenieś je do probówek lub dołków do barwienia wypełnionych PBS (Rycina 3F).

5. Przejaśnianie optyczne

1. Przygotować roztwór glicerolu i PBS w stężeniu 75% obj.
2. Odlać (lub odpipetować) połowę objętości buforu PBS użytego do płukania zebranych skrawków mózgu.
3. Uzupełnić usuniętą objętość roztworem glicerolu/PBS.
4. Pozostawić do osiągnięcia równowagi, delikatnie mieszając w temperaturze 4° C, aż skrawki opadną na dno.
5. Powtarzać kroki od 6.2) do 6.4), aż końcowe stężenie glicerolu osiągnie 75%.
6. Wymienić roztwór na 90% glicerol w PBS i pozostawić do osiągnięcia równowagi.
   *Uwaga: Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza podczas dodawania roztworów glicerolu. Roztwory należy wlewać powoli i delikatnie mieszać, ponieważ pęcherzyki powietrza będą zakłócać równomierną równowagę i przeniosą się na etap montowania preparatów na szkiełkach.

6. Montowanie skrawków do obrazowania

1. Wytnij dwustronną taśmę uszczelniającą (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) w kształcie otwartego prostokąta, dopasowanego do pola widzenia preparatu mikroskopowego (Superfrost Plus, 25 X 75 X 1 mm, kat. # 48311-703, VWR), z krawędziami o szerokości 2-3 mm.
2. Za pomocą pipety lub pędzelka umieść skrawki mózgu w centrum prostokąta z taśmy klejącej. Nadmiar glicerolu usuń delikatnie poprzez aspirację.
3. Ułóż skrawki mózgu na preparacie w pożądanej kolejności, używając pędzelka.
4. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe (24 X 60 mm, kat. # 48383-139, VWR) na taśmę klejącą, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby zapewnić kontakt z taśmą klejącą.
5. Odsącz nadmiar glicerolu z krawędzi między preparatem a szkiełkiem nakrywowym.
6. Uszczelnij krawędzie preparatu i szkiełka nakrywkowego za pomocą bezbarwnego laku do paznokci.
7. Pozostaw do wyschnięcia przed obrazowaniem lub przechowuj długoterminowo w kasetkach do preparatów w temperaturze 4° C.

7. Reprezentatywne wyniki:

Obróbka, obrazowanie i analiza tkanki mózgowej znakowanej fluorescencyjnie stały się niezbędne w badaniach nad neurobiologią. Wiele z tych analiz wymaga zaawansowanych manipulacji genetycznych w celu uzyskania ekspresji reportera w ukierunkowanych podzbiorach neuronów, a następnie przeprowadzenia analiz obrazowych w niskiej i wysokiej rozdzielczości. Często ograniczenia eksperymentalne i techniczne uniemożliwiają uzyskanie tego typu danych z tego samego zwierzęcia lub w krótkim czasie. Przygotowanie optycznie przejaśnionych, półgrubych skrawków mózgu do obrazowania fluorescencyjnego pomaga rozwiązać ten problem. Przykład nienaruszonego grubego skrawka mózgu znakowanego genetycznie zmodyfikowanym wirusem wścieklizny zaprojektowanym do ekspresji EGFP, obrazowanego przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej oraz konfokalnej, przedstawiono odpowiednio na Rysunku 4 i Rysunku 5. Do obrazowania epifluorescencyjnego wykorzystano mikroskop Leica M205 FA, a do akwizycji obrazów konfokalnych mikroskop Zeiss LSM 510. Ze względu na względną prostotę załączonego protokołu, metoda ta pozwala na uzyskanie użytecznych danych obrazowych z tkanki wykazującej ekspresję reporterów fluorescencyjnych w czasie krótszym niż jeden dzień i jest kompatybilna z mikroskopią świetlną w niskiej i wysokiej rozdzielczości.

Jeśli badacz zdecyduje się na włączenie dodatkowych metod znakowania pośmiertnego, barwienia immunohistochemicznego lub wykonania cieńszych skrawków, protokół ulega odpowiedniemu wydłużeniu. Opisana powyżej metoda stanowi jednak prosty i stosunkowo wysokoprzepustowy sposób przesiewania wzorców ekspresji białek reporterowych in vivo w nienaruszonym mózgu.

Rycina 1. Schemat blokowy przedstawiający procedurę fiksacji, sekcji, krojenia, klarowania i montażu półgrubych skrawków mózgu.

Rysunek 2. Schemat sekwencyjnych etapów cięcia w celu wyizolowania nienaruszonego mózgu myszy.

Rycina 3. Etapy montowania i krojenia tkanki mózgowej przy użyciu urządzenia Compresstome. A) Mocowanie tkanki mózgowej do tłoka tnącego za pomocą superglue. B) Wciąganie zamocowanej tkanki mózgowej do tłoka w celu zatopienia w agarozie. C) Utwardzanie wtyczki mózgowej z agarozy przy użyciu schłodzonego bloku kompresyjnego. D) Wprowadzenie wtyczki mózgowej z agarozy i tłoka do komory tnącej Compresstome. E) Wyrównanie żyletki względem urządzenia z tłokiem. F) Krojenie i zbieranie skrawków mózgu do komory z buforem Compresstome.

Rycina 4. Obrazy mikroskopii świetlnej grubego skrawka tkanki mózgowej oczyszczonej glicerolem, przechodzące przez korę czołową wykazującą ekspresję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP). A) Przekrój czołowy mózgu myszy (grubość 200 um) oznakowany wektorem wirusowym ekspresującym EGFP i obrazowany w niskiej rozdzielczości za pomocą stereoskopu epifluorescencyjnego. Pasek skali, 2 mm.

Rysunek 5. Obraz przy dużym powiększeniu fluorescencyjnie znakowanych neuronów kory warstwy 5/6 w utransparentnionym grubym skrawku mózgu. A) Konfokalny obraz o wysokiej rozdzielczości z maksymalnej projekcji stosu Z (grubości 150 um) przez obszar zaznaczony na (Rysunku 4). Pasek skali, 25 um.

Dyskusja

Ze względu na powszechne zastosowanie białek fluorescencyjnych do celowania w podgrupy neuronów w celu badania ich za pomocą mikroskopii świetlnej, nieoceniona stała się potrzeba szybkiego przesiewania, obrazowania i analizy sieci neuronalnych w nienaruszonej tkance mózgowej.

Postępy techniczne w opracowywaniu przyjaznych dla użytkownika wektorów wirusowych, technik elektroporacji in vivo oraz genetycznie modyfikowanych linii myszy zapewniają obecnie pozornie nieograniczone źródło zna...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
nożyczki do kości	F.S.T.	16044-10	-lub odpowiednik
nożyczki do dyssekcji	F.S.T.	14084-08	-lub odpowiednik
agaroza typu I-B	Sigma-Aldrich	A0576
Compresstome	Precisionary Instruments	VF-200	-kompatybilne są inne wibratomy
dwustronna taśma klejąca	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L
szkiełka Superfrost Plus	VWR international	48311-703
szkiełko nakrywką	VWR international	48383-139
glicerol	EMD Millipore	GX0185-6	-lub odpowiednik