Identyfikacja i analiza mysich progenitorów erytroidalnych za pomocą testu cytometrycznego przepływowego CD71 / TER119

Summary

Cytometryczna metoda cytometryczna do identyfikacji i analizy molekularnej specyficznych dla etapu różnicowania mysich erytroidalnych progenitorów i prekursorów, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodu. Test opiera się na markerach powierzchni komórki CD71, Ter119 i wielkości komórki.

Abstract

Badanie erytropoezy ma na celu zrozumienie, jak powstają czerwone krwinki z wcześniejszych krwiotwórczych i erytroidalnych komórek progenitorowych. W szczególności szybkość tworzenia czerwonych krwinek jest regulowana przez hormon erytropoetynę (Epo), którego synteza jest wyzwalana przez niedotlenienie tkanek. Zagrożenie dla odpowiedniego natlenienia tkanek powoduje szybki wzrost Epo, co prowadzi do wzrostu częstości erytropoetycznych, procesu znanego jako reakcja na stres erytropoetyczny. Wynikający z tego wzrost liczby krążących krwinek czerwonych poprawia dostarczanie tlenu do tkanek. Skuteczna reakcja na stres erytropoetyczny ma zatem kluczowe znaczenie dla przeżycia i powrotu do zdrowia po stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak duża wysokość, niedokrwistość, krwotok, chemioterapia lub przeszczep komórek macierzystych.

Mysz jest kluczowym modelem do badania erytropoezy i jej reakcji na stres. Ostateczna erytropoeza myszy (typu dorosłego) ma miejsce w wątrobie płodu między 12,5 a 15,5 dniem embrionalnym, w śledzionie noworodka oraz w dorosłej śledzionie i szpiku kostnym. Klasyczne metody identyfikacji erytroidalnych komórek progenitorowych w tkance opierają się na zdolności tych komórek do tworzenia kolonii krwinek czerwonych po posiewie w pożywkach półstałych zawierających Epo. Ich erytroidalne potomstwo prekursorowe identyfikuje się na podstawie kryteriów morfologicznych. Żadna z tych klasycznych metod nie pozwala na dostęp do dużej liczby komórek erytroidalnych specyficznych dla etapu różnicowania do badań molekularnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę cytometrii przepływowej służącą do identyfikacji i badania progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla etapu różnicowania, bezpośrednio w kontekście świeżo wyizolowanej tkanki myszy. Test opiera się na markerach powierzchni komórki CD71, Ter119 oraz na parametrze cytometrii przepływowej "rozproszenie do przodu", który jest funkcją wielkości komórki. Test CD71 / Ter119 może być stosowany do badania progenitorów erytroidalnych podczas ich odpowiedzi na stres erytropoetyczny in vivo, na przykład u myszy z niedokrwistością lub myszy trzymanych w warunkach niskiego poziomu tlenu. Może być również stosowany do badania progenitorów erytroidalnych bezpośrednio w tkankach genetycznie zmodyfikowanych dorosłych myszy lub zarodków, w celu oceny specyficznej roli zmodyfikowanego szlaku molekularnego w erytropoezie.

Protocol

1. Pobieranie tkanek

1. Przygotować probówki zawierające od 2 do 5 ml zimnego buforu barwiącego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z dodatkiem 0,2% BSA i 5 mM glukozy). Trzymaj probówki na lodzie przed pobraniem tkanek.
2. Usunąć myszy zgodnie z odpowiednim zatwierdzonym protokołem (np. wdychanie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy).
3. Pobrać krew przez nakłucie serca do probówek do pobierania krwi EDTA lub heparyny w celu późniejszej analizy, np. hematokrytu, liczby retikulocytów lub analizy morfologii krwi.
4. Zbierz śledzionę i kości, umieszczając tkanki każdej myszy w osobnej probówce, przygotowanej w kroku 1. Łatwy dostęp do śledziony znajduje się z lewej strony. W przypadku szpiku kostnego zbierz jedną lub obie kości udowe. Zebrane tkanki należy przechowywać na lodzie.
5. W razie potrzeby zważ śledzionę. Myszy poddawane reakcji na stres erytropoetyczny prawdopodobnie wykazują znaczny wzrost masy śledziony.

2. Przygotowanie komórek śledziony

1. Za pomocą wstępnie zwilżonego tłoka strzykawki o pojemności 3 ml delikatnie wepchnij śledzionę lub część śledziony (najlepiej 0,1 grama lub mniej, co odpowiada około 10-8 komórkom) przez sterylne sitko do komórek o objętości 40 μm (numer katalogowy Fisherbrand 22363547 lub inny) umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Podczas tej procedury trzymaj probówkę na lodzie. Przemyć komórki przez sitko z łącznie 2 ml buforu barwiącego.
2. Delikatnie odpipetować napiętą zawiesinę komórek, aby rozbić wszelkie małe grudki. W razie potrzeby ponownie unieruchomić komórki.
3. Umyć komórki dwukrotnie przez odwirowanie i ponownie zawiesić w zimnym buforze.
4. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Typowe plony to 1-2 x 10⁸ komórek/śledziona. Do analizy metodą cytometrii przepływowej należy podać od 1 do 2 milionów komórek na próbkę, albo do probówek barwiących FACS (probówki z polistyrenu okrągłodennego BD Falcon, 352008) lub 96-dołkowej płytki z dnem U (BD Falcon 353910). Objętość barwienia próbki wynosi 200 μl, do końcowego stężenia komórek 0,5 do 1 x 10⁷ komórek/ml lub 1-2 x 10⁶ komórek/200 μl próbki.

3. Przygotowanie komórek szpiku kostnego

1. Przygotować strzykawki o pojemności 1 lub 3 ml z dołączoną igłą 26G, wstępnie napełnione zimnym buforem barwiącym.
2. Usuń mięśnie przyczepione do kości udowej, aby wyraźnie uwidocznić kość.
3. Za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych odetnij oba końce kości udowej, jak najbliżej końców kości. Powinno to ujawnić mały otwór na każdym odciętym końcu, prowadzący do jamy szpiku kostnego, która biegnie przez całą długość kości udowej.
4. Używając ampułkostrzykawek z kroku 1, włóż igłę przez jeden z tych otworów i delikatnie wypłucz szpik przez otwór na drugim końcu do probówki.
5. Oddzielić przepłukane komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przecedzić przez sitko o średnicy 40 μm, tak jak w przypadku śledziony powyżej (patrz sekcja 2.1).
6. Dwukrotnie przemyć komórki przez odwirowanie w zimnym buforze barwiącym
7. Zliczyć komórki i zawiesić ponownie jak w punkcie 2.4. Typowa wydajność to około 10-7 komórek na kość udową.

4. Przygotowanie komórek wątroby płodu

1. Aby przygotować samice myszy w ciąży w czasie, należy przygotować myszy do krycia wieczorem; sprawdź, czy nie ma czopów dopochwowych przed godziną 10 rano następnego dnia; dzień, w którym wykryto czop pochwowy, jest uważany za dzień 0,5. Personel weterynaryjny może być w stanie pomóc badaczom, którzy nie są zaznajomieni z tą techniką, w identyfikacji ciężarnych samic. Ciążę można również określić, monitorując masę ciała myszy.
2. Czas – ciężarne samice myszy są zabijane w dniach od 12,5 do 14,5 ciąży. Rogi macicy wyjmuje się na szalkę Petriego zawierającą lodowatą pożywkę hodowlaną lub bufor barwiący.
3. Zarodki są usuwane z każdej macicy, a wątroba płodu jest preparowana. Mikroskop preparacyjny jest wymagany w 12,5 dniu zarodkowym (E12,5) lub młodszym.
4. Wątroby mogą być dysocjowane mechanicznie przez pipetowanie w buforze i są przetwarzane pojedynczo w 96-dołkowych płytkach lub łączone razem, w zależności od wymagań doświadczalnych.
5. Wątroba płodu w E13,5 ma ~10⁷ komórek. Komórki przemywa się dwukrotnie w buforze barwiącym i ponownie zawiesza w próbce 1-2 x 10⁶ komórek/200 μl do analizy cytometrycznej przepływowej.

5. Barwienie przeciwciał w cytometrii przepływowej

1. Przygotować wstępną mieszaninę do barwienia przeciwciał pierwszorzędowych, która ma być stosowana do wszystkich próbek, z wyjątkiem próbek kontrolnych, zawierających:
   • ChromePure Rabbit IgG (Jackson, 015-000-003), do końcowego stężenia 200 μg/ml. Sprawdź stężenie na butelce (może się różnić). Służy to do blokowania receptorów Fc w komórkach myszy; alternatywnymi gatunkami, które można do tego celu wykorzystać, są IgG myszy lub IgG szczura. Wybór gatunku zależy od potencjalnej obecności w protokole barwienia przeciwciał drugorzędowych skierowanych przeciwko pierwszorzędowym przeciwciałom szczura/myszy/królika, w którym to przypadku gatunki te nie mogą być stosowane jako przeciwciała blokujące. Alternatywnie zamiast oczyszczonej IgG można również zastosować 5% surowicę króliczą. Kolejną alternatywą jest zastosowanie przeciwciał monoklonalnych lub fragmentów Fab skierowanych na mysie receptory Fc. Poniższy podstawowy protokół nie obejmuje żadnych przeciwciał drugorzędowych, a więc można stosować IgG dowolnego z trzech gatunków.
   • CD71-FITC, rozcieńczony w stosunku 1:200 (zapas 0,5 mg/ml, BD-Biosciences, 553266)
   • Ter119-PE, rozcieńczony w stosunku 1:200 (zapas 0,2 mg/ml, BD-Biosciences, 553673)
   • Wszelkie dodatkowe przeciwciała skierowane przeciwko epitopom powierzchniowym będącym przedmiotem zainteresowania, np. przeciwciała skierowane przeciwko Fas lub FasL (patrz ^1,2). Delikatnie wymieszaj roztwór przeciwciała, odwracając probówkę 2-3 razy.
2. Dodać 200 μl mieszanki wstępnej do każdej próbki komórek i delikatnie zawiesić komórki.
3. Przygotować próbki komórek kontrolnych w następujący sposób:
   • 'Niebarwione': komórki te pozostawia się w buforze barwiącym i zapewniają autofluorescencję tła komórek.
   • Kontrole "jednokolorowe": jedna taka kontrola jest wymagana dla każdego przeciwciała/koloru użytego w protokole. Komórki w tych kontrolach są barwione albo bezpośrednio sprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym, albo zarówno przeciwciałem pierwszorzędowym, jak i sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym. Te elementy sterujące służą do korygowania nakładania się widma między kanałami.
   • Kontrole "fluorescencja minus jeden" (FMO): jedna taka kontrola jest wymagana dla każdego przeciwciała/koloru w protokole: komórki są barwione wszystkimi kolorami/przeciwciałami w protokole, z wyjątkiem koloru/przeciwciała, dla których jest to kontrola FMO. Kontrolka FMO dla określonego kanału zapewnia prawdziwe tło dla tego kanału. Może zawierać nieswoiste przeciwciało o tym samym izotypie i sprzężone z tym samym znacznikiem fluorescencji co badane przeciwciało (kontrola izotypu).
4. Inkubować próbki i odpowiednie kontrole w pierwotnym barwieniu przeciwciał na lodzie przez 45 stóp do 1 godziny w ciemności (umieścić pokrywę z folii aluminiowej na wiadrze z lodem).
5. Pod koniec inkubacji przemyć komórki, dodając 3 ml buforu barwiącego do każdej probówki z próbką i wirować przez 3' do 5' w temperaturze około 400 x g w temperaturze 4°C. W przypadku stosowania płytek 96-dołkowych należy umyć komórki trzykrotnie w objętości 200 μl.
6. W razie potrzeby zastosuj wtórne barwienie przeciwciałami. Nałożyć i umyć jak w przypadku pierwszego zabarwienia przeciwciałami.
7. W razie potrzeby na koniec inkubacji nakłada się barwnik z załącznikiem V, używając buforu hepes, jak podano w instrukcjach producenta. Tę plamę nakłada się na 15 minut w temperaturze pokojowej lub na 1 godzinę na lodzie.
8. Komórki są ponownie zawieszane do analizy cytometrii przepływowej w roztworze barwiącym zawierającym nieprzepuszczalny dla komórek barwnik DNA, w celu wykluczenia martwych komórek. Dostępnych jest kilka barwników DNA, w tym jodek propidyny, 7-amino-aktynomycyna D (7AAD) lub DAPI. Wybór spośród nich zależy od dostępnych kanałów, biorąc pod uwagę kanały pobierane do barwienia określonych przeciwciał oraz kanały dostępne w cytometrze przepływowym. 7AAD jest uzyskiwany przez BD-Biosciences (559925) i stosowany zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku barwienia DAPI należy przygotować zapas 1 mg / ml dimetyloformamidu (DMF) z proszku (Roche, Cat # 236276), utrzymywać w temperaturze -20 ° C i rozcieńczać 1:10 000 do 1: 15 000 w buforze do barwienia.

6. Sortowanie metodą cytometrii przepływowej

1. Komórki znakuje się przeciwciałami przeciwko CD71, Ter119, markerom linii i barwnikiem żywotności, zgodnie z opisem dla analizy cytometrii przepływowej (sekcja 5). Stężenie komórek podczas znakowania można zwiększyć do 5 x 10⁷/ml.
2. Wymieszać równą objętość każdego z następujących przeciwciał, aby uzyskać główną mieszankę linii:
   • FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848
   • FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087
   • FITC Chomik Anty-Myszy CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061
   • FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396
   • FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G i Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126
   • Użyć mieszanki wzorcowej w stosunku 1:80 (jest to równoważne rozcieńczeniu 1:400 każdego pojedynczego zapasu przeciwciał, z których wszystkie mają 0,5 mg/ml).
3. Używaj warunków sortowania pod niskim ciśnieniem i szerokich dysz. Do Aria (BD Biosciences) używamy dyszy 100 μ, ciśnienie 20 psi.
4. Bufor kolekcji: PBS z dodatkiem 20% płodowej surowicy bydlęcej.
5. Aby sprawdzić czystość posortowanych populacji, należy ponownie uruchomić małą porcję z każdej próbki w buforze zawierającym barwnik żywotności (7AAD lub podobny).

7. Reprezentatywne wyniki:

CD71/Ter119 barwienie dorosłego szpiku kostnego lub śledziony identyfikuje sekwencję rozwojową czterech podzbiorów, oznaczonych jako ProE, EryA, EryB i EryC (Rysunek 1) ¹. Morfologicznie odpowiadają one coraz bardziej dojrzałym erytroblastom. Rysunek 1 ilustruje sekwencję bramkowania na etapie analizy danych, która odrzuca bardzo małe zdarzenia (w tym jądra, krwinki czerwone), komórki zagregowane i komórki martwe.

Ekspresja białek na powierzchni komórki może być mierzona jednocześnie dla każdego z tych podzbiorów, poprzez dodanie odpowiednich przeciwciał w tym samym czasie, co barwienie Ter119 i CD71. Rycina 1 przedstawia przykład ekspresji receptora śmierci Fas ¹ na powierzchni komórki. Pomiar ten przeprowadzono u myszy, którym wstrzyknięto Epo lub u myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Oczywiste jest, że Epo hamuje ekspresję Fas w populacji EryA in vivo ¹.

Ekspresja białek wewnątrzkomórkowych lub status cyklu komórkowego mogą być również mierzone dla komórek w każdym podzbiorze. Rycina 2 ilustruje reprezentatywną analizę cyklu komórkowego świeżo pobranych komórek szpiku kostnego. Pomiary te wymagają, oprócz barwienia powierzchni komórek za pomocą CD71 i Ter119, utrwalenia i przepuszczalności komórek w celu znakowania wewnątrzkomórkowego (patrz sekcja Dyskusja).

W wątrobie płodu, komórki nieerytroidalne są najpierw wykluczane przez bramkowanie na komórkach 'Lin-', które są ujemne dla CD41, Mac-1, Gr-1, B220 i CD3 (Rysunek 3). Pozostałe komórki są podzielone na 6 podzbiorów, od S0 do S5. Dokładny wzór komórek w wątrobie płodu zależy od wieku embrionalnego (patrz sekcja Dyskusja). Przedstawiono reprezentatywną analizę cyklu komórkowego podzbioru S3 w wątrobie płodu E13.5 (ryc. 4).

Rysunek 1. Podzbiory erytroidalne CD71/Ter119 w śledzionie myszy. Strategia bramkowania: Komórki śledziony zostały przetworzone i znakowane przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD71, Ter119 i Fas. Na tym rysunku przedstawiono strategię analizy po kroku pozyskiwania danych. Histogram I pokazuje wszystkie pozyskane zdarzenia. Bramka ukośna reprezentuje zdarzenia, które prawdopodobnie są pojedynczymi komórkami, z wyłączeniem dubletów lub większych agregatów. Komórki w tej bramce są dalej analizowane na histogramie II. W tym przypadku wykluczone są bardzo małe zdarzenia, prawdopodobnie jądra lub szczątki. Bramkowane komórki są pokazane na histogramie III, gdzie komórki DAPI-dodatnie, które prawdopodobnie są przepuszczalnymi przez błonę komórkami apoptotycznymi, są wyłączone z dalszej analizy. Histogram IV pokazuje uzyskaną populację żywotnych komórek śledziony. Bramka ProE zawiera komórki^pośrednie Ter119^{o wysokiej zawartości}CD71. ^{Wysokie komórki} Ter119 są dalej analizowane na histogramie V. Tutaj^{komórki o wysokim poziomie} CD71 dzielą się na mniej dojrzałe, duże erytroblasty "EryA" (CD71^wysokipoziom Ter119,^wysokipoziom FSC) i mniejsze, bardziej dojrzałe erytroblasty "EryB" (^{CD71 wysoki}Ter119^wysokiFSC^niski). Najbardziej dojrzałym podzbiorem erytroblastów jest EryC (CD71^niskiTer119^wysokiFSC^niski). Histogram VI pokazuje ekspresję Fas na powierzchni komórki, szczególnie w podzbiorze EryA, u myszy w stanie podstawowym (wstrzyknięto sól fizjologiczną) i myszy, którym wstrzyknięto pojedynczą dawkę Epo. Barwienie przeciwciałem Fas prowadzono równocześnie z barwieniem CD71/Ter119. Ur. Preparaty cytospinowe komórek posortowanych z każdego ze wskazanych podzbiorów. Komórki barwiono Giemsą i diaminobenzydyną, ta ostatnia generuje brązową plamę z hemoglobiną. Dane dotyczące cytospiny zostały pierwotnie opublikowane w Liu et al., Blood. 1 lipca 2006; 108(1):123-33. EPUB 2006 9 marca.

Rysunek 2. Analiza cyklu komórkowego erytroblastów^{o wysokimpoziomie} Ter119 CD71 w szpiku kostnym myszy. Myszom wstrzyknięto dootrzewnowo BrdU, a śledzionę lub szpik kostny pobrano 30 do 60 minut później. Komórki utrwalono i przepuszczalno, a oprócz barwienia na CD71 i Ter119, wybarwiono je w celu włączenia BrdU do ich replikującego DNA za pomocą przeciwciała monoklonalnego skierowanego na BrdU (protokół utrwalania, permeabilizacji i barwienia BrdU był zgodny z instrukcją producenta). Komórki BrdU-dodatnie znajdują się w fazie S cyklu. Komórki interfazowe są BrdU-ujemne i mogą być rozdzielone na fazy G1 lub G2 / M przy użyciu barwnika DNA 7AAD.

Rysunek 3. Podzbiory erytroidalne CD71 / Ter119 w wątrobie płodu myszy. ZA. Strategia bramkowania: Komórki wątroby płodu znakowano pod kątem CD71, Ter119 i koktajlu przeciwciał znakowanych FITC skierowanych na nieerytroidalne markery linii ("Lin"). Żywe komórki (7AAD-ujemne) analizowano pod kątem ekspresji Lin, a komórki Lin- są dalej dzielone na podzbiory erytroidalne S0 do S5. Młodsza wątroba płodu E13 składa się z mniej dojrzałych erytroblastów, o czym świadczy brak komórek w dojrzałych podzbiorach S4/S5. Ur. Preparaty cytospinowe komórek posortowanych z każdego ze wskazanych podzbiorów. Komórki barwiono Giemsą i diaminobenzydyną, ta ostatnia generuje brązową plamę z hemoglobiną. Dane dotyczące cytospiny zostały pierwotnie opublikowane w Pop et al., PLoS Biol 8(9): e1000484. doi:10.1371/journal.pbio.1000484 .

Rysunek 4. Analiza cyklu komórkowego podzbiorów erytroidalnych wątroby płodu. Ciężarnym myszom wstrzyknięto BrdU, a wątroby płodu pobrano 30 do 60 minut później, utrwalono, przepuszczalno i wybarwiono przeciwciałami przeciwko CD71, Ter119 i BrdU. Wyświetlany jest stan cyklu komórkowego komórek S3.

Discussion

Metodologia cytometrii przepływowej umożliwia jednoczesne badanie dowolnej funkcji komórkowej, którą można wykryć za pomocą swoistego przeciwciała lub liganda sprzężonego z fluorescencją, w tym markerów powierzchniowych komórki, ekspresji białek, przeżycia komórek, sygnalizacji komórkowej przy użyciu przeciwciał swoistych dla fosfonii3 i statusu cyklu komórkowego. Pomiary te mogą być wykonywane w każdym z wielu podzbiorów specyficznych dla etapu różnicowania, w kontekście świeżo wyizolowanej tkanki erytropoet...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fas-biotyna	BD Biosciences	554256
Sondy molekularne	Streptawidyna-APC	S868
40 μ m sterylne sitko do komórek	Fisher Scientific 22363547
Polistyrenowe probówki okrągłodenne do barwienia FACS	BD Biosciences	352008
U-bottom 96-dołkowa płytka	BD Biosciences	353910
ChromePure Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
CD71-FITC (stock 0,5 mg / ml)	BD Biosciences	553266
Ter119-PE (stan magazynowy 0,2 mg / ml)	BD Biosciences	553673
7AAD	BD Biosciences	559925
DAPI w proszku	Grupa Roche 236276
FITC Szczur Anty-Mysz CD41 MWReg30	BD Biosciences	553848
FITC Szczur Anty-Myszy CD45R/B220 RA3-6B2	BD Biosciences	553087
FITC Szczur Anty-Myszy CD411B/MAC-1 M1/70	BD Biosciences	557396
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G i Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5	BD Biosciences	553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11	BD Biosciences	553061
APC BrdU Zestaw przepływowy	BD Biosciences	557892
Aneksyna V-biotyna	BD Biosciences	556418