Wykrywanie tlenku azotu i anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z wykorzystaniem pułapek spinowych

Podsumowanie

Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z wołowych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)₂, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.

Streszczenie

Reaktywne formy azotu i tlenu (RNS/ROS) w niskich stężeniach odgrywają istotną rolę w regulacji funkcji komórkowych, sygnalizacji i odpowiedzi immunologicznej, lecz w niekontrolowanych stężeniach są szkodliwe dla żywotności komórek^{1, 2}. Choć organizmy żywe wykształciły endogenne i dietetyczne mechanizmy obrony antyoksydacyjnej w celu regulacji generowania ROS, formy te są wytwarzane w sposób ciągły jako naturalne produkty uboczne normalnego metabolizmu tlenu i mogą powodować uszkodzenia oksydacyjne biomolekuł, prowadząc do utraty funkcji białek, rozrywania DNA lub peroksydacji lipidów³, a w konsekwencji do stresu oksydacyjnego skutkującego uszkodzeniem lub śmiercią komórki⁴.

Anionorodnik ponadtlenkowy (O₂•-) jest głównym prekursorem niektórych z najsilniej utleniających gatunków znanych w systemach biologicznych, takich jak nadtlenek azotowy i rodnik hydroksylowy. Powstawanie O₂•- sygnalizuje pierwszy etap wyrzutu utleniaczy, dlatego jego detekcja i/lub sekwestracja w systemach biologicznych jest istotna. W niniejszej demonstracji O₂•- został wygenerowany z neutrofili polimorfojądrowych (PMN). Poprzez stymulację chemotaktyczną za pomocą fosforanu 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA), PMN generują O₂•- poprzez aktywację oksydazy dinukleotydowej nikotynamidoadeninowej (NADPH) oksydazy⁵.

Syntaza tlenku azotu (NO), występująca w trzech izoformach: indukowalnej, neuronalnej i śródbłonkowej (odpowiednio iNOS, nNOS i eNOS), katalizuje przekształcanie L-argininy w L-cytrulinę, wykorzystując NADPH do produkcji NO⁶. W niniejszej pracy wygenerowano NO z komórek śródbłonka. W warunkach stresu oksydacyjnego eNOS może na przykład przejść z produkcji NO na produkcję O₂•- w procesie zwanym rozprzęganiem (uncoupling), który prawdopodobnie jest wywoływany przez utlenianie hemu⁷ lub kofaktora, tetrahydrobiopteryny (BH₄)⁸.

Istnieje niewiele wiarygodnych metod wykrywania wolnych rodników w systemach biologicznych, a są one ograniczone pod względem specyficzności i czułości. Pułapkowanie spinowe jest powszechnie stosowane do identyfikacji wolnych rodników i polega na reakcji addycji rodnika do pułapki spinowej, w wyniku której powstaje trwały addukt spinowy, który można wykryć za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). Różne addukty rodnikowe wykazują charakterystyczne widma, które mogą służyć do identyfikacji generowanych rodników i dostarczać bogatych informacji na temat natury i kinetyki powstawania rodników⁹.

Cykliczne nitrony, 5,5-dimetylopirrolin-N-tlenek, DMPO¹⁰, podstawiony grupą fosforylową DEPMPO¹¹ oraz podstawione estrami EMPO¹² i BMPO¹³, są szeroko stosowane jako pułapki spinowe – te ostatnie wykazują dłuższy okres półtrwania dla adduktu O₂•-. Ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)₂, jest powszechnie używany do pułapkowania NO ze względu na wysoką szybkość tworzenia adduktu oraz wysoką stabilność adduktu spinowego¹⁴.

Protokół

1. Hodowla byczych komórek śródbłonka aorty (BAEC)

1. Stosowano odpowiednie techniki aseptyczne.
2. W łaźni wodnej podgrzano pożywkę bez antybiotyków do 37 °C.

Uwaga: Pożywka składa się z wolnego od fenolu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) z 4.5 g/L D-glukozy, 4 mM L-glutaminy i 1% niezasadniczych aminokwasów, uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 2.5 mg/L czynnika wzrostu śródbłonka.

3. Wyjąć kolbę T75 z komórkami z inkubatora i przetrzeć powierzchnię kolby 70% etanolem przed umieszczeniem jej w dygestorium.
4. Usunąć zużytą pożywkę za pomocą aspiratora i przemyć dwukrotnie 5 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS).
5. Dodać 2 ml trypsyny i odczekać 4-5 min do odklejenia się komórek, okresowo kontrolując proces pod mikroskopem.
6. Dodać 3 ml pożywki i wielokrotnie wymieszać za pomocą pipety, aby rozdzielić komórki i uzyskać jednorodną zawiesinę.
7. Przenieść 5 ml pożywki z trypsyną do probówki 15 ml i wirować przy 121 g przez 5 min.
8. Usunąć nadsącz za pomocą aspiratora. Dodać 5 ml DPBS i dokładnie wymieszać. Wirować przy 121 g przez 5 min.
9. Odssać nadsącz i resuspendować osad komórkowy, dodając 6 ml pożywki.
10. Do każdego dołka płytki 6-dołkowej dodać 1 ml zawiesiny komórkowej, a następnie dodać 1 ml pożywki. Wymieszać zawiesinę za pomocą pipety.
11. Opisać płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

2A. Detekcja NO z wykorzystaniem komórek BAEC

1. Stosowano odpowiednie techniki aseptyki.
2. Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora i odessać medium z pierwszego dołka. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml DPBS.
3. Dodać 210 μl 1,9 mM siarczanu żelaza(II) siedmiowodnego (FeSO₄.7H₂O, przygotowanego na świeżo przez rozpuszczenie 0,8 mg w 1 ml DPBS z CaCl₂ i MgCl₂) oraz 210 μl ditiokarbaminianu amonu N-metylo-D-glukaminy (MGD, przygotowanego na świeżo przez rozpuszczenie 2,7 mg w 500 μl DPBS z CaCl₂ i MgCl₂) w stosunku 1:7. (Uwaga: Stosunek ten, w którym wykorzystuje się nadmiar MGD, jest konwencjonalnie stosowany do przygotowania kompleksu Fe²⁺-MGD ze względu na fakt, że wydajność dla Fe³⁺-MGD jest maksymalna w obecności nadmiaru MGD. Dodanie askorbinianu do roztworu w celu stabilizacji Fe²⁺-MGD nie jest konieczne, ponieważ powstały NO-Fe³⁺-MGD jest endogennie redukowany do wykrywalnego metodą EPR NO-Fe²⁺-MGD przez askorbinian, hydrochinon lub cysteinę z wydajnością konwersji do 99,9%. Niskospinowy stan diamagnetyczny Fe²⁺ umożliwia detekcję NO przy użyciu płaskiej celi lub rurki kapilarnej bez konieczności stosowania urządzenia do niskich temperatur)¹⁵.
4. Dokładnie wymieszać powstałą zawiesinę i dodać 4,6 μl jonoforu wapnia (CaI) (przygotowanego z roztworu stokowego 1,9 mM przez rozpuszczenie 1 mg w 1 ml DMSO).
5. Ponownie wymieszać roztwór i inkubować w temperaturze 37 °C przez 36 min, aby umożliwić dalszą redukcję NO-Fe³⁺-MGD do wykrywalnego metodą EPR NO-Fe²⁺-MGD.
6. Zebrać nadsącz (425 μl) do probówki Eppendorf i przenieść do płaskiej celi EPR (lub do rurki kapilarnej 50 μl).
7. Parametry akwizycji EPR to: częstotliwość mikrofal: 9,8 GHz; pole centralne: 3427 G; amplituda modulacji: 6,0 G; szerokość skanowania: 100 G; wzmocnienie odbiornika: 1 x 10⁵; moc mikrofal: 10 mW; całkowita liczba skanów: 121; czas skanowania: 10 s; oraz stała czasowa: 20 ms. (Uwaga: Ponieważ parametry różnią się w zależności od instrumentu i warunków doświadczalnych, najważniejszymi parametrami do rozważenia są jedynie pole centralne, częstotliwość i amplituda modulacji.)
8. Rejestrować widma w temperaturze pokojowej; widma 2-D zintegrowano w celu redukcji szumu tła i skorygowano linię bazową przy użyciu oprogramowania Bruker WinEPR Data Processing lub innego oprogramowania do przetwarzania danych. Do ilościowego oznaczenia tworzenia adduktu można sporządzić standardowe wykresy zależności stężenia od natężenia sygnału (lub pola) przy użyciu donora NO SNAP.

2B. Eksperyment dotyczący rozprzęgania eNOS

1. Wyjmij płytkę 6-dołkową z inkubatora, odessij medium z drugiego dołka i przemyj go dwukrotnie 1 ml DPBS.
2. W celu rozprzęgnięcia eNOS¹⁶ zastosowano donor nadtlenku azotku, chlorek 5-amino-3-(4-morfolinyl)-1,2,3-oksadiazolium (SIN-1). Dodaj 100 μl 0,5 mM SIN-1 (M_r 206,6 g/mol, z 10 mM roztworu stokowego świeżo przygotowanego przez rozpuszczenie 1 mg SIN-1 w 500 μl PBS bez jonów Ca/Mg) i rozcieńcz do 2 ml za pomocą DPBS i 10% FBS.
3. Inkubuj przez 2 h w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.
4. Wyjmij płytkę z inkubatora i przemyj dwukrotnie DPBS.
5. Dodaj 210 μl 2,8 mM FeSO₄.7H₂O oraz 210 μl 19,6 mM MGD świeżo przygotowanego zgodnie z opisaną powyżej procedurą.
6. Zamieszaj roztwór i dodaj 4,6 μl 1,9 mM CaI.
7. Ponownie zamieszaj roztwór i inkubuj w 37 °C przez 36 min.
8. Zbierz nadsącz (425 μl) do probówki Eppendorf i przenieś do płaskiej celi EPR.
9. Parametry akwizycji EPR to: częstotliwość mikrofal: 9,8 GHz; pole centralne: 3427 G; amplituda modulacji: 6 G; szerokość sweepu: 100 G; wzmocnienie odbiornika: 1 x 10⁵; moc mikrofal: 10 mW; całkowita liczba skanów: 121; czas sweepu: 10 s; oraz stała czasowa: 20 ms.
10. Zarejestruj widma; widma 2-D zostały zintegrowane w celu redukcji szumów tła i poddane korekcji linii bazowej, jak wspomniano powyżej.

3. Wykrywanie O₂•- z neutrofili polimorfonuclearnych (PMN)

1. Neutrofile wyizolowano z ludzkiej próbki krwi zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁷.
2. Przygotować roztwór zapasowy 1 M DMPO* w PBS zawierającym 0,1 mM kwasu diethylenotriaminopentaoctowego (DTPA). DMPO ma temperaturę topnienia 25-29 °C, dlatego wygodniej jest pipetować ciekły DMPO (gęstość ~ 1,02 g/ml przy 25 °C) do szklanej fiolki (Uwaga: do odważania nie należy używać fiolek plastikowych, ponieważ czysty DMPO reaguje z plastikiem). Zamrożony DMPO można roztopić, polewając fiolkę letnią wodą (Uwaga: nie należy używać gorącej wody, ponieważ DMPO może ulec rozkładowi).
3. Ważne jest zastosowanie DMPO o wysokiej czystości (> 99%), ponieważ niektóre z dostępnych komercyjnie pułapek spinowych zawierają zanieczyszczenia paramagnetyczne; w związku z tym niezbędne jest wykonanie widma EPR samego roztworu DMPO (w tym przypadku 10 mM). Krytyczne jest, aby nie stwierdzono sygnału tła (patrz Rysunek 3A).
4. Przygotować roztwór zapasowy (1 mg/ml) phorbolu-12-myristate-13-acetate (PMA) w DMSO. Przygotować alikwoty poprzez rozcieńczenie roztworu do stężenia 10 μg/ml w PBS.
5. W probówce Eppendorf 1,5 ml przygotować roztwór o całkowitej objętości 0,6 ml, zachowując następującą kolejność dodawania: ~10⁶ komórek PMN na ml, D-glukoza (1 mg/ml) i albumina (1 mg/ml), 10 mM DMPO oraz 0,2 μg/ml PMA. (Uwaga: PMA jest aktywatorem rodników i powinien być dodany na końcu).
6. Przenieść roztwór do płaskiej kuwety EPR.
7. Parametry akwizycji EPR są następujące: częstotliwość mikrofal: 9,8 GHz; pole centralne: 3486 G; amplituda modulacji: 0,5 G; szerokość skanowania: 100 G; wzmocnienie odbiornika: 5 x 10⁵; całkowita liczba skanów: 10; czas skanowania: 30 s; moc mikrofal: 20 mW; stała czasowa: 81 ms. Do ilościowego oznaczenia tworzenia adduktów można sporządzić standardowe wykresy zależności stężenia od intensywności sygnału (lub pola), wykorzystując stabilne nitroksydy, takie jak TEMPO lub kwas 3-karboksylowy-PROXYL.

* Ważna uwaga dotycząca stosowania DMPO: użycie płaskiej kuwety pozwala zwiększyć gęstość komórek, a tym samym zwiększyć intensywność sygnału adduktu spinowego, jednak okres półtrwania adduktu O₂•- z DMPO jest krótki (t_1/2 ~ 1 min), a sam addukt ulega rozkładowi do DMPO-OH. DMPO można zastąpić takimi samymi stężeniami EMPO, BMPO lub DEPMPO, które są dostępne w sprzedaży, w celu zwiększenia stabilności adduktów, których t_1/2 wynosi odpowiednio ~ 8 i 14 min.

4. Reprezentatywne wyniki

Pułapkowanie spinowe rodnika NO przeprowadzono z użyciem Fe²⁺-MGD. Rycina 2A i 2B nie wykazują sygnału EPR dla Fe²⁺-MGD ani mieszaniny Fe²⁺-MGD z CaI, co wskazuje, że odczynniki te nie generują tła sygnału NO. BAEC po stymulacji CaI uwalniają NO, który reaguje z Fe²⁺-MGD, tworząc addukt spinowy NO-Fe²⁺-MGD, wykazujący charakterystyczny sygnał tripletowy o wartości stałej rozszczepienia nadsubtelnego (hfsc) a_N = 12,66 G i współczynniku g wynoszącym g= 2,040 (Rycina 2C). Wartość hfsc określono za pomocą programu symulacyjnego WINSIM, który można pobrać ze strony bazy danych oprogramowania EPR NIEHS. Eksperymentalna wartość hfsc jest zgodna z wartością literaturową a_N=12,70 G i g = 2,041¹⁸ dla adduktu NO-Fe²⁺-MGD. Analogicznie, wpływ SIN-1 na BAEC obniżył produkcję NO z powodu rozprzęgania eNOS, co przedstawiono na Rycini 2D.

Do detekcji O₂•- wykorzystano pułapkę spinową DMPO. Sam DMPO nie generował sygnału, co pokazano na Rysunku 3A, potwierdzając, że pułapka spinowa jest wolna od zanieczyszczeń paramagnetycznych. Rysunek 3B przedstawia widmo samego DMPO i PMN; podobnie jak wcześniej, nie stwierdzono wykrywalnego sygnału, co sugeruje, że DMPO nie powoduje aktywacji enzymu NADPH oksydazy. Rysunek 3C pokazuje obserwowany sygnał EPR po stymulacji PMN za pomocą PMA. Wartości hfsc dla tego sygnału określono jako a_N =14.71 G, a_β-H =11.40 G oraz a_γ-H =1.25 G, co jest zgodne z wartościami literaturowymi a_N =14.3 G, a_β-H =11.7 G i a_γ-H =1.3 G ¹⁹ dla adduktu DMPO-O₂H.

Rysunek 1. Schemat blokowy detekcji rodników z neutrofili i BAEC z wykorzystaniem pułapkowania spinowego EPR. (A) PMN zmieszano z DMPO i PMA, a otrzymaną mieszaninę przeniesiono do płaskiej kuwety EPR w celu akwizycji danych. (B) BAEC hodowano na płytce, a następnie przemyto DPBS. Dodano pułapkę spinową Fe(MGD)₂ wraz z CaI. Roztwór dokładnie wymieszano i inkubowano. Mieszaninę przeniesiono do płaskiej kuwety EPR w celu akwizycji danych EPR.

Rycina 2. Wykrywanie NO z BAEC za pomocą EPR. (A) Widmo samego Fe²⁺-MGD (B) Widmo samego Fe²⁺-MGD + CaI. (C) Widmo tripletowe wynikające z wychwytywania NO przez Fe²⁺-MGD przy użyciu komórek stymulowanych CaI. (D) Widmo wykazujące spadek produkcji NO w wyniku traktowania komórek 0,5 mM SIN-1.

Rysunek 3. Detekcja EPR kompleksu DMPO-O₂H z aktywowanych neutrofili. (A) Widmo samego 10 mM DMPO. (B) Widmo samych PMN w obecności 10 mM DMPO. (C) Widmo PMN aktywowanych PMA w obecności 10 mM DMPO.

Dyskusja

Pułapkowanie spinowe EPR było wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych do ilościowego oznaczania i identyfikacji wolnych rodników. Pułapkowanie spinowe jest wysoce czułe, zdolne do wykrywania rodników w stężeniach od nM do μM, co czyni je odpowiednim do zastosowań w układach biologicznych. Podstawą detekcji NO via EPR jest tworzenie paramagnetycznego adduktu NO-Fe²⁺-MGD. Fe²⁺-MGD reaguje z NO szybko¹⁸ z szybkością ~ 10⁶ M^-1 s^-1....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka DMEM bez fenolu High glucose 1X	GIBCO	31053
0.25% Trypsyna-EDTA	GIBCO	25200
L-Glutamina	Fisher Scientific	BP379-100
Niezbędne aminokwasy MEM	GIBCO	11140
Płodowa surowica bydlęca	Atlanta Biologicals	S11550
Endotelialny czynnik wzrostu	Millipore	02-102
CaI	Enzo Life Sciences	A-23187	Rozpuścić w DMSO
SIN-1	Enzo Life Sciences	BML-CN245-0020
DMPO	Dojindo Laboratories	D048-10
FeSO4.7H2O	Sigma Aldrich	215422-250G	Rozpuścić w PBS z Ca i Mg
MGD	Enzo Life Sciences	ALX-400-014-M050	Rozpuścić w PBS z Ca2+ i Mg2+
Komórki BAEC	Cell Systems	2B2-C75
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
DPBS z CaCl2 i MgCl2	Sigma Aldrich	D8662
Octan forbolomyristianu (PMA)	Sigma Aldrich	79346-1MG