$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Reaktywne formy azotu i tlenu (RNS/ROS) w niskich stężeniach odgrywają istotną rolę w regulacji funkcji komórkowych, sygnalizacji i odpowiedzi immunologicznej, lecz w niekontrolowanych stężeniach są szkodliwe dla żywotności komórek1, 2. Choć organizmy żywe wykształciły endogenne i dietetyczne mechanizmy obrony antyoksydacyjnej w celu regulacji generowania ROS, formy te są wytwarzane w sposób ciągły jako naturalne produkty uboczne normalnego metabolizmu tlenu i mogą powodować uszkodzenia oksydacyjne biomolekuł, prowadząc do utraty funkcji białek, rozrywania DNA lub peroksydacji lipidów3, a w konsekwencji do stresu oksydacyjnego skutkującego uszkodzeniem lub śmiercią komórki4.
Anionorodnik ponadtlenkowy (O2•-) jest głównym prekursorem niektórych z najsilniej utleniających gatunków znanych w systemach biologicznych, takich jak nadtlenek azotowy i rodnik hydroksylowy. Powstawanie O2•- sygnalizuje pierwszy etap wyrzutu utleniaczy, dlatego jego detekcja i/lub sekwestracja w systemach biologicznych jest istotna. W niniejszej demonstracji O2•- został wygenerowany z neutrofili polimorfojądrowych (PMN). Poprzez stymulację chemotaktyczną za pomocą fosforanu 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA), PMN generują O2•- poprzez aktywację oksydazy dinukleotydowej nikotynamidoadeninowej (NADPH) oksydazy5.
Syntaza tlenku azotu (NO), występująca w trzech izoformach: indukowalnej, neuronalnej i śródbłonkowej (odpowiednio iNOS, nNOS i eNOS), katalizuje przekształcanie L-argininy w L-cytrulinę, wykorzystując NADPH do produkcji NO6. W niniejszej pracy wygenerowano NO z komórek śródbłonka. W warunkach stresu oksydacyjnego eNOS może na przykład przejść z produkcji NO na produkcję O2•- w procesie zwanym rozprzęganiem (uncoupling), który prawdopodobnie jest wywoływany przez utlenianie hemu7 lub kofaktora, tetrahydrobiopteryny (BH4)8.
Istnieje niewiele wiarygodnych metod wykrywania wolnych rodników w systemach biologicznych, a są one ograniczone pod względem specyficzności i czułości. Pułapkowanie spinowe jest powszechnie stosowane do identyfikacji wolnych rodników i polega na reakcji addycji rodnika do pułapki spinowej, w wyniku której powstaje trwały addukt spinowy, który można wykryć za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). Różne addukty rodnikowe wykazują charakterystyczne widma, które mogą służyć do identyfikacji generowanych rodników i dostarczać bogatych informacji na temat natury i kinetyki powstawania rodników9.
Cykliczne nitrony, 5,5-dimetylopirrolin-N-tlenek, DMPO10, podstawiony grupą fosforylową DEPMPO11 oraz podstawione estrami EMPO12 i BMPO13, są szeroko stosowane jako pułapki spinowe – te ostatnie wykazują dłuższy okres półtrwania dla adduktu O2•-. Ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, jest powszechnie używany do pułapkowania NO ze względu na wysoką szybkość tworzenia adduktu oraz wysoką stabilność adduktu spinowego14.