Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z bydlęcych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Reaktywne formy azotu i tlenu (RNS/ROS) w niskich stężeniach odgrywają istotną rolę w regulacji funkcji komórkowych, sygnalizacji i odpowiedzi immunologicznej, jednak w stężeniach niekontrolowanych są szkodliwe dla żywotności komórek1, 2. Chociaż systemy żywe wykształciły endogenne i dietetyczne mechanizmy obrony antyoksydacyjnej w celu regulacji generowania ROS, formy te są produkowane w sposób ciągły jako naturalne produkty uboczne prawidłowego metabolizmu tlenu i mogą powodować uszkodzenia oksydacyjne biomolekuł, co skutkuje utratą funkcji białek, rozszczepieniem DNA lub peroksydacją lipidów3, a w konsekwencji prowadzi do stresu oksydacyjnego wywołującego uszkodzenie lub śmierć komórki4.
Anion rodnika ponadtlenkowego (O2•-) jest głównym prekursorem niektórych z najbardziej utleniających związków znanych w systemach biologicznych, takich jak nadtlenek azotowy i rodnik hydroksylowy. Generowanie O2•- stanowi pierwszy sygnał wybuchu oksydacyjnego, dlatego jego detekcja i/lub sekwestracja w systemach biologicznych jest istotna. W niniejszej demonstracji O2•- został wygenerowany z polimorfojądrowych neutrofili (PMN). Poprzez stymulację chemotaktyczną za pomocą forbolu-12-mirystynianu-13-octanu (PMA), PMN generują O2•- poprzez aktywację oksydazy dinukleotydowej fosforanowej (NADPH) oksydazy5.
Syntaza tlenku azotu (NO), występująca w trzech izoformach: indukowalnej, neuronalnej i śródbłonkowej (odpowiednio iNOS, nNOS i eNOS), katalizuje przekształcenie L-argininy w L-cytrulinę, wykorzystując NADPH do produkcji NO6. W niniejszej pracy wygenerowano NO z komórek śródbłonka. W warunkach stresu oksydacyjnego eNOS może na przykład przejść z produkcji NO na produkcję O2•- w procesie zwanym rozprzęganiem (uncoupling), który prawdopodobnie jest wywoływany przez utlenianie hemu7 lub kofaktora, tetrahydrobiopteryny (BH4)8.
Istnieje niewiele wiarygodnych metod wykrywania wolnych rodników w systemach biologicznych, a te są ograniczone pod względem swoistości i czułości. Pułapkowanie spinowe jest powszechnie stosowane do identyfikacji wolnych rodników i polega na reakcji addycji rodnika do pułapki spinowej, w wyniku której powstaje trwały addukt spinowy, który można wykryć za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). Różne addukty rodnikowe wykazują charakterystyczne widma, które mogą być wykorzystane do identyfikacji generowanych rodników i dostarczyć wielu informacji na temat natury oraz kinetyki powstawania rodników9.
Cykliczne nitrony, 5,5-dimetylopirrolina-N-tlenek, DMPO10, fosforylowany DEPMPO11 oraz estrowane EMPO12 i BMPO13, są powszechnie stosowane jako pułapki spinowe – te ostatnie wykazują dłuższy okres półtrwania dla adduktu O2•-. Ditiokarbaminian żelaza(II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, jest powszechnie używany do pułapkowania NO ze względu na wysoką szybkość tworzenia adduktu oraz wysoką stabilność adduktu spinowego14.
Protokół
1. Hodowla byczych komórek śródbłonka aorty (BAEC)
- Przestrzegano odpowiednich zasad aseptyki.
- W łaźni wodnej ogrzano pożywkę bez antybiotyków do 37 °C.
Uwaga: Pożywka składa się z wolnego od fenolu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) z 4.5 g/L D-glucose, 4 mM L-glutamine, 1% nieessential amino acids, uzupełnionego o 10% FBS (fetal bovine serum) oraz 2.5 mg/L czynnika wzrostu śródbłonka.
- Wyjąć z inkubatora kolbę T75 zawierającą komórki i oczyścić jej powierzchnię 70% etanolem przed umieszczeniem jej w dygestorium.
- Usunąć stare pożywkę za pomocą aspirat....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pułapkowanie spinowe EPR jest stosowane w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych do ilościowego oznaczania i identyfikacji wolnych rodników. Pułapkowanie spinowe charakteryzuje się wysoką czułością, umożliwiając detekcję rodników w stężeniach od nM do μM, co czyni je odpowiednim do zastosowań w systemach biologicznych. Podstawą detekcji NO via EPR jest tworzenie paramagnetycznego adduktu NO-Fe2+-MGD. Fe2+-MGD reaguje z NO szybko18, ze stałą szybkości ok. 106 M.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantu RO1 HL81248 przyznanego przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi (NIH National Heart, Lung, and Blood Institute).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka DMEM bez fenolu Wysoka zawartość glukozy 1X | GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsyna-EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamina | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Niezbędne aminokwasy MEM | GIBCO | 11140 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endotelialny czynnik wzrostu | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Rozpuścić w DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Rozpuścić w PBS z Ca i Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Rozpuścić w PBS z Ca2+ i Mg2+ |
| Komórki BAEC | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS z CaCl2 i MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Octan forbolu mirystynianu (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
Bibliografia
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- <....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
