Kwantyfikacja białek za pomocą wzbogacania immunopowinowactwa peptydów w połączeniu ze spektrometrią mas

Summary

Standardy stabilnych izotopów i wychwytywanie przez przeciwciała antypeptydowe (SISCAPA) łączą wzbogacanie peptydów o powinowactwie ze spektrometrią mas z rozcieńczaniem stabilnych izotopów (MRM-MS), aby zapewnić ilościowy pomiar peptydów jako substytutów ich odpowiednich białek. Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący cząstki magnetyczne w częściowo zautomatyzowanym formacie.

Abstract

Istnieje duże zapotrzebowanie na testy ilościowe w pomiarze białek. Tradycyjne testy immunologiczne typu sandwich, w dużej mierze uważane za złoty standard w oznaczaniu ilościowym, wiążą się z wysokimi kosztami, długim czasem realizacji i są obarczone wadami (np. przeciwciała heterofilne, interferencja autoprzeciwciał, "efekt haczyka"). ¹ Alternatywną techniką jest wzbogacanie peptydów w powinowactwo w połączeniu z ilościową spektrometrią mas, powszechnie określaną jako SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Anti-Peptide Antibodies). ² W tej technice wzbogacanie peptydów w powinowactwo za pomocą rozcieńczania stabilnego izotopu i detekcji za pomocą spektrometrii mas z monitorowaniem wybranych/wielokrotnych reakcji (SRM/MRM-MS) zapewnia ilościowy pomiar peptydów jako substytutów ich odpowiednich białek. SRM/MRM-MS ma ugruntowaną pozycję w dokładnym oznaczaniu ilościowym małych cząsteczek ^{3, 4}, a ostatnio został przystosowany do pomiaru stężeń białek w lizatach osocza i komórek. ^5-7 Aby uzyskać ilościową ocenę białek, te większe cząsteczki są trawione do peptydów składowych za pomocą enzymu, takiego jak trypsyna. Jeden lub więcej wybranych peptydów, których sekwencja jest unikalna dla białka docelowego u tego gatunku (tj. peptydy "proteotypowe"), są następnie wzbogacane z próbki przy użyciu przeciwciał antypeptydowych i mierzone jako ilościowe surogaty stechiometryczne dla stężenia białka w próbce. W związku z tym, w połączeniu z metodami rozcieńczania stabilnych izotopów (SID) (tj. wzorcem peptydowym znakowanym stabilnym izotopem), SRM/MRM może być stosowany do pomiaru stężeń peptydów proteotypowych jako substytutów do oznaczania ilościowego białek w złożonych matrycach biologicznych. Testy mają kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi testami immunologicznymi. Odczynniki są stosunkowo tańsze w wytwarzaniu, specyficzność analitu jest doskonała, testy mogą być wysoce multipleksowane, wzbogacanie można przeprowadzić z czystego osocza (nie jest wymagane zubożenie), a technika jest podatna na szeroki wachlarz białek lub modyfikacji będących przedmiotem zainteresowania. ^8-13 W tym filmie pokazujemy podstawowy protokół dostosowany do platformy z kulkami magnetycznymi.

Protocol

Procedura eksperymentalna:

Test wymaga syntetycznych peptydów i przeciwciał antypeptydowych. Wybrane peptydy powinny być unikalne dla interesującego białka, zawierać od 8 do 22 aminokwasów i nie mieć znanych modyfikacji potranslacyjnych. Na ogół unika się reszt metioniny, a peptydy zawierające aminokwasy dwuzasadowe (np. KK, KR, RR) są niepożądane. W tej technice powszechne jest stosowanie stabilnych peptydów znakowanych izotopami jako wzorców wewnętrznych, zawierających ciężkie (¹³C i ¹⁵N) znakowane aminokwasy na C-końcu peptydu (tj. znakowane K lub R).

Poniższy protokół opisuje test opracowany do pomiaru peptydu GDSLAYGLR z białka myszy Osteopontin, przy użyciu przeciwciał antypeptydowych uzyskanych od Epitomics Inc. (Burlingame, CA) i syntetycznych peptydów z New England Peptide (Gardner, MA). Protokół składa się z trzech głównych etapów (ryc. 1): 1) Trawienie trypsyny w złożonej mieszaninie białek, 2) Wzbogacanie peptydów 3) Analiza za pomocą spektrometrii mas. Zostanie to zademonstrowane na próbce ludzkiego osocza wzbogaconej mysim białkiem osteopontyny.

1. Trawienie enzymatyczne trypsyny i oczyszczanie

1. Rozmrozić 10 μl czystej podwielokrotności osocza na mokrym lodzie.
2. Oznaczyć całkowite stężenie białka za pomocą testu BCA i odwirować próbkę w celu usunięcia wszelkich zawieszonych ciał stałych.
3. Odmierzyć pipetę 10 μl porcji z rurki do przechowywania na płytkę głębinową o pojemności 1000 μl i przykryć folią przebijającą.
4. Do każdej próbki dodać 20 μl świeżego 9M mocznika / 30mM ditiotreitolu (DTT) (stężenie końcowe 6M mocznika / 20mM DTT).
5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C.
6. Dodać 3 μl świeżego 500 mM jodoacetamidu (końcowy IAM 50mM) do każdej próbki.
7. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
8. Dodać 257 μl 100 mM Tris (pH 8) (rozcieńcza mocznik do °0,6M).
9. Dodać 10 μl roztworu podstawowego trypsyny (1 μg/μl; dla stosunku enzym do substratu 1:50).
10. Inkubować w temperaturze 37°C przez noc (12-16 godzin).
11. Dodać 3 μl czystego kwasu mrówkowego (końcowe stężenie 1%).
12. Dodaj stabilny wzorzec izotopowy (w przypadku wykonywania testu multipleksowego dodaje się wiele wzorców, zwykle jest to około 10 μl zawierających 50-100 fmol standardowego peptydu znakowanego izotopowo).
13. Dobrze umyj płytkę wkładu Oasis 500 μl 0,1% kwasu mrówkowego w 80% acetonitrylu, odrzucając przepływ. Powtórz to 3 razy.
14. Zrównoważyć płytkę wkładu, dodając 500 μl 0,1% kwasu mrówkowego do wody i wyrzucić przepływ. Powtórz to 4 razy.
15. Załaduj próbki mineralizowane na płytę wkładu i dostosuj podciśnienie tak, aby przepływ był bardzo wolny.
16. Przemyć 500 μl 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie i wylać płynny. Powtórz to 3 razy.
17. Elute peptydy przez dodanie 2 x 500 μl 0,1% kwasu mrówkowego w 80% acetonitrylu do płytki głębinowej o pojemności 1000 μl (nie wyrzucać przepływu).
18. Liofilizować (lub speedvac) eluat do sucha. (Preferowaną metodą jest liofilizacja)
19. Rozpuść wysuszone peptydy, dodając 50 μl PBS + 0,03% CHAPS.

2. Wzbogacenie peptydowego powinowactwa immunologicznego

1. Przenieść próbkę na standardowe płytki dołkowe Kingfisher 96.
2. Dodaj 1 μg przeciwciała i 1,5 μl kulek magnetycznych pokrytych białkiem G na cel (opcjonalnie można połączyć przeciwciało z kulkami przed dodaniem). Upewnij się, że koraliki są dobrze zawieszone przez potrząsanie lub wirowanie.
3. Przykryj talerz folią.
4. Inkubować przez noc (12-16 godzin) z delikatnym bębnowaniem, aby upewnić się, że kulki są zawieszone.
5. Odwirować płytkę o masie 32 x g przez 5 sekund, aby usunąć płyn z powierzchni folii.
6. Zdejmij foliową osłonę.
7. Mycie i elucja kulek może odbywać się ręcznie lub w sposób zautomatyzowany. Ta procedura opisuje kroki zautomatyzowane na platformie Kingfisher.
8. Umyj koraliki 2 razy 200 μL PBS + 0,03% CHAPS (1 minuta na pranie).
9. Umyj koraliki 1 raz w 200 μl PBS + 0,03% CHAPS w rozcieńczeniu 1:10 (1 minuta).
10. Peptydy eluuje się w 25 μl 5% kwasu octowego + 0,03% CHAPS.
11. Umieść płytkę elucyjną na magnesie i przenieś eluat na 96-dołkową płytkę, uważając, aby nie przenieść resztek kulek.
12. Przykryj płytkę matą uszczelniającą.
13. Płytka zawierająca eluat jest dostarczana do potrójnego kwadrapolowego spektrometru mas w celu analizy.

3. Analiza za pomocą monitorowania wielu reakcji - spektrometria mas

1. Przejścia do analizy SRM/MRM można wybrać i zoptymalizować, wprowadzając do spektrometru mas w tempie 0,5 μl / min 1 pikomol na mikrolitr roztworu wzorca peptydowego w 30% acetonitrylu / 0,1% kwasie mrówkowym. Po uzyskaniu stabilnego sprayu należy pobrać widmo MS/MS.
2. Przejścia są wybierane z widma MS/MS poprzez identyfikację trzech obfitych jonów fragmentacyjnych w regionie widma o niewielkim szumie. W przypadku jonów peptydowych naładowanych wielokrotnie, fragmenty jonów y wykryte w m/z > prekursorze m/z są zazwyczaj najlepsze do opracowania testu SRM/MRM. Rysunek 2 przedstawia widmo MS/MS oraz wybrane jony przejściowe 476.3 > 508.3, 579.3, 692.4 (przejścia dla wzorca ciężkiego stabilnego izotopu 481.3 > 518.3, 589.3, 702.4 nie pokazano) dla peptydu GDSLAYGLR.
3. W zależności od marki i modelu używanego spektrometru mas istnieje wiele parametrów, które można zoptymalizować dla każdego przejścia. W tym przypadku zoptymalizowaliśmy energię zderzenia każdego wybranego przejścia, zwiększając energię zderzenia i monitorując poziom sygnału. Dla każdego przejścia użyto energii zderzenia wynoszącej 25.
4. Krótko mówiąc, typowa konfiguracja do analizy SRM/MRM jest następująca: Faza ruchoma (A) 0,1% Kwas mrówkowy; (B) 90% acetonitryl / 0,1% kwas mrówkowy, 0,3 x 5 mm kolumna pułapkowa C18, 75 μm ID x 15 cm kolumna analityczna C18 (Reprosil-Pur C18 AQ, pory 120 A°). Objętość iniekcji wynosi 10 μl, a próbkę ładuje się przez 5 minut przy 3% B przy całkowitym natężeniu przepływu 3 μl/min i eluuje za pomocą gradientu liniowego od 3 do 45 %B przy 300 - 400 nL/min w ciągu 10 minut. Warunki na 4000 QTRAP (ABSCIEX, Foster City, CA) to napięcie natryskiwania 2,3 kV, temperatura źródła jonów 150 °C, GS1 12 i gaz kurtynowy 15.
5. Próbka jest analizowana za pomocą SRM/MRM poprzez wstrzyknięcie 10 μl próbki. Obszary pików są integrowane dla lekkich i ciężkich peptydów za pomocą programu Skyline. ¹⁴ Obliczyć stosunek powierzchni piku (PAR) nieznakowanego/znakowanego peptydu w każdej próbce, używając najliczniejszego przejścia, które jest wolne od szumu tła, w tym przypadku przejścia y5 (lekki peptyd 476,3 > 579,3, ciężki peptyd standardowy 481,3 > 589,3).

4. Reprezentatywne wyniki:

Zmierzone proporcje powierzchni piku (lekki endogenny peptyd w stosunku do ciężkiego peptydu znakowanego izotopowo) dostarczają ilościowej miary docelowego peptydu. Rysunek 3 przedstawia przykładowy chromatogram lekkich i ciężkich peptydów w próbce wzbogaconej SISCAPA. Należy pamiętać, że lekkie i ciężkie peptydy eluują w tym samym czasie, a dla każdego peptydu można monitorować wiele przejść w celu potwierdzenia tożsamości.

Rysunek 1. Schematyczny przegląd procesu SISCAPA. Złożona mieszanina białek jest trawiona do peptydów. Celowane anality peptydowe (endogenny analit i wzbogacony stabilny wzorzec wewnętrzny znakowany izotopem) są wzbogacane przy użyciu przeciwciał antypeptydowych unieruchomionych na cząstkach magnetycznych pokrytych białkiem G. Po izolacji docelowe peptydy są eluowane z cząstek magnetycznych i analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu ilościowego określenia w stosunku do wzorca wewnętrznego.

Rysunek 2. Widmo MS/MS peptydu GDSLAYGLR pokazujące wybór trzech fragmentów do przejść SRM/MRM.

Rysunek 3. Przykładowe chromatogramy przedstawiające profil piku lekkiego analitu peptydowego (kolor czerwony) i wzorca wewnętrznego znakowanego ciężkim stabilnym izotopem (kolor niebieski). Chromatogramy dla przejścia y5 z lekkiego peptydu (476.3 > 579.3) i wzorca znakowanego ciężkim stabilnym izotopem (481.3 > 589.3) są wykreślane w czasie, gdy eluują się z systemu chromatograficznego.

Discussion

Najważniejszym krokiem w opisanym protokole jest upewnienie się, że kulki pozostają dobrze wymieszane w okresie inkubacji. Pozostawienie kulek na dnie studzienki/fiolki spowoduje zwiększoną zmienność. Ważne jest również, aby odwirować wszelkie płyny, które mogą pozostać na wierzchu studzienki/fiolki po okresie inkubacji. Kluczowe znaczenie ma również powtarzalne trawienie trypsyny. Opisana tutaj procedura trawienia była szeroko stosowana w naszym laboratorium w połączeniu z SISCAPA; Jest jednak prawdopodobne, że alternatywne metody trawienia mogą być zoptymalizowane dla danego zestawu docelowych białek. ¹⁵ Elucja wolnego przeciwciała nie zakłóca wykrywania peptydu, prawdopodobnie dlatego, że przeciwciało jest wykluczane z kolumny lub eluuje później niż peptydy, ale przeciwciało może być usieciowane z kulkami białka G przed wzbogaceniem powinowactwa w dużych eksperymentach lub jeśli wolne przeciwciało staje się problemem. Uznaliśmy również, że przydatne jest umieszczenie magnesu pod płytką próbki w automatycznym podajniku próbek, a także umycie kolumny pułapki w odwrotnym kierunku przepływu (w porównaniu z ładowaniem) w celu usunięcia wszelkich pozostałości kulek lub cząstek. Oprócz opisanego podejścia opartego na kulkach magnetycznych, technikę tę można również dostosować do formatu kolumnowego (tj. chromatografii powinowactwa). ^{12, 16}

Gdy użytkownik zaznajomi się z całym protokołem, technika ta może być również poddana kilku modyfikacjom, które poprawiają ogólny test. ¹¹ Po pierwsze, możliwa jest analiza wielu analitów w jednym teście poprzez połączenie przeciwciał na etapie wzbogacania (tj. multipleksowania). Spektrometr mas jest w stanie jednocześnie analizować dużą liczbę analitów. Po drugie, zwiększenie objętości oryginalnej próbki poprawia czułość testu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000ul Studnia głębinowa 96-dołkowe płytki	Eppendorf	951032786
Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96-dołkowa	płytka Waters	186003966
Kingfisher 96-dołkowa	płytka Thermo Fisher Scientific, Inc.
Przezroczysta, biała płyta ścienna 96 dołków	Bio-Rad	HSP9601
Foliowa osłona na płytkę 96-dołkową	Excel Scientific	12-169
Axymat Mata uszczelniająca do płytki 96-dołkowej	Axygen Scientific	521-01-151
X folia do przebijania	Sigma-Aldrich	Z722502
Kingfisher magnetyczny procesor kulek z głowicą	magnetyczną PCRThermo Fisher Scientific, Inc.	HSP 9601
Tabela 1: Materiały
Mocznik	Sigma-Aldrich	U6031
Baza Trizma	Sigma-Aldrich	T1503
Ditiothreitol (DTT)	Pierce, Thermo Scientific	20291	"ditiotreitol bez wagi"
Jodoacetamid (IAM)	Sigma-Aldrich	I1149
Trypsin Gold	Promega Corp.	V5280
Kulki magnetyczne białka G, 2,8um	Invitrogen	10004D
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	L5401
CHAPS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	28300
Kwas mrówkowy	EMD Milipor	11670
Acetonitryl	Thermo Fisher Scientific, Inc.	A998-1
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	242853
Tabela 2: Odczynniki
100 mM Tris pH 8
9 M mocznik / 30 mM DTT w 100 mM Tris (pH 8)			muszą być przygotowywane świeże za każdym razem
500 mM IAM w 100 mM Tris (pH 8)			muszą być przygotowywane świeże za każdym razem
Trypsyna 1 mg / ml w 100 mM Tris pH 8
Inhibitor trypsyny 1 mg / ml w 100 mM Tris pH 8
Stabilny izotop wzorcowy mastermix
Przeciwciało antypeptydowe mastermix
Tabela 3: Roztwory, które należy przygotować