Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje duże zapotrzebowanie na ilościowe testy pomiaru białek. Tradycyjne immunoanalizy typu kanapkowego, uznawane w dużej mierze za złoty standard w oznaczaniu ilościowym, wiążą się z wysokimi kosztami, długim czasem oczekiwania i obarczone są licznymi wadami (np. obecnością przeciwciał heterofilnych, interferencją autoprzeciwciał, tzw. „efektem haczyka”).1 Alternatywną techniką jest wzbogacanie powinowactwa do peptydów połączone z ilościową spektrometrią mas, powszechnie określane jako SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 W tej technice wzbogacanie powinowactwa do peptydów z rozcieńczeniem izotopami stabilnymi oraz detekcja za pomocą spektrometrii mas z monitorowaniem wybranej lub wielu reakcji (SRM/MRM-MS) pozwala na ilościowy pomiar peptydów jako substytutów ich odpowiednich białek. Metoda SRM/MRM-MS jest dobrze ugruntowana w precyzyjnym oznaczaniu ilościowym małych cząsteczek 3, 4, a w ostatnim czasie została zaadaptowana do pomiaru stężeń białek w osoczu i lizatach komórkowych.5-7 Aby uzyskać ilościowe oznaczenie białek, te większe cząsteczki są trawione do peptydów składowych przy użyciu enzymu, takiego jak trypsyna. Następnie jeden lub więcej wybranych peptydów, których sekwencja jest unikalna dla danego białka docelowego u tego gatunku (tzw. peptydy „proteotypowe”), jest wzbogacanych z próbki przy użyciu przeciwciał przeciwpeptydowych i mierzone jako ilościowe substytuty stechiometryczne stężenia białka w próbce. Zatem, w połączeniu z metodami rozcieńczania izotopami stabilnymi (SID) (tj. poprzez dodanie standardu peptydowego znakowanego izotopami stabilnymi), SRM/MRM może być wykorzystywane do pomiaru stężeń peptydów proteotypowych jako substytutów do ilościowego oznaczania białek w złożonych matrycach biologicznych. Testy te mają kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi immunoanalizami. Odczynniki są stosunkowo tańsze w wytworzeniu, specyficzność względem anality jest doskonała, testy mogą być wysoko multipleksowane, wzbogacanie można przeprowadzać z czystego osocza (brak konieczności deplecji), a technika ta jest stosowalna dla szerokiego spektrum białek lub modyfikacji będących przedmiotem zainteresowania.8-13 W tym filmie prezentujemy podstawowy protokół zaadaptowany do platformy z kulkami magnetycznymi.
Protokół
Procedura eksperymentalna:
Analiza wymaga zastosowania syntetycznych peptydów oraz przeciwciał antypeptydowych. Wybrane peptydy powinny być unikalne dla badanego białka, zawierać od 8 do 2 aminokwasów i nie posiadać znanych modyfikacji potranslacyjnych. Zazwyczaj unika się reszt metioniny, a niepożądane są peptydy zawierające aminokwasy zasadowe w układzie dibazowym (np. KK, KR, RR). W tej technice powszechnie stosuje się peptydy znakowane stabilnymi izotopami jako standardy wewnętrzne, wprowadzając ciężkie aminokwasy znakowane (13C i 15N) na koniec C-końcowy peptydów (np. znakowane K lub R).
Poniższy protokół opisuje analizę opracowaną w celu pomiaru peptydu GDSLAYGLR z białka Osteopontyna mysiego, z wykorzystaniem przeciwciał przeciwpeptydowych uzyskanych z Epitomics Inc. (Burlingame, CA) oraz syntetycznych peptydów z New England Peptide (Gardner, MA). Protokół składa się z trzech głównych etapów (Rysunek 1): 1) trawienie trypsyną złożonej mieszaniny białek, 2) wzbogacanie peptydów, 3) analiza metodą spektrometrii mas. Metoda zostanie zademonstrowana na próbce ludzkiej osocza z dodatkiem białka Osteopontyny mysiej.
1. Trawienie enzymatyczne trypsyną i oczyszczanie
- Rozmrozić 10 μL alikwot czystej plazmy na wilgotnym lodzie.
- Oznaczyć całkowite stężenie białek za pomocą testu BCA, a następnie odwirować próbkę w celu usunięcia zawiesiny ciał stałych.
- Przenieść pipetą 10 μL alikwotu z probówki do przechowywania do płytki głębokodnnej 10 μL i przykryć folią perforowaną.
- Do każdej próbki dodać 20 μL świeżego roztworu 9M mocznika / 30mM ditiotreitolu (DTT) (stężenie końcowe 6M mocznika / 20mM DTT).
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C.
- Do każdej próbki dodać 3 μL świeżego 50 mM jodooctanu (stężenie końcowe IAM 50mM).
- Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
- Dodać 257 μL 10 mM Tris (pH 8) (co rozcieńcza mocznik do ˜0,6M).
- Dodać 10 μL roztworu zapasu trypsyny (1 μg/μL; dla stosunku enzymu do substratu 1:50).
- Inkubować w 37°C przez noc (12-16 godzin).
- Dodać 3 μL czystego kwasu mrówkowego (stężenie końcowe 1%).
- Dodać standard izotopowy (w przypadku analizy multipleksowej dodaje się wiele standardów, zazwyczaj jest to około 10 μL zawierających 50-10 fmol standardowego peptydu znakowanego izotopowo).
- Dokładnie przemyć płytkę z kartridżami Oasis 50 μL 0,1% kwasu mrówkowego w 80% acetonitrylu, odrzucając filtrat. Powtórzyć ten krok 3 razy.
- Urównoważyć płytkę z kartridżami, dodając 50 μL 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie, i odrzucić filtrat. Powtórzyć ten krok 4 razy.
- Nanieść próbki po trawieniu na płytkę z kartridżami i dostosować próżnię tak, aby przepływ był bardzo powolny.
- Przemyć 50 μL 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie i odrzucić filtrat. Powtórzyć ten krok 3 razy.
- Eluować peptydy, dodając 2 x 50 μL 0,1% kwasu mrówkowego w 80% acetonitrylu do płytki głębokodnnej 10 μl (nie odrzucać filtratu).
- Liofilizować (lub odparować w SpeedVac) eluat do suchości. (Liofilizacja jest metodą preferowaną).
- Rekonstytuować wysuszone peptydy, dodając 50 μL PBS + 0,03% CHAPS.
2. Wzbogacanie immunochromatograficzne peptydów
- Przenieś próbkę do standardowych płytek 96-dołkowych Kingfisher.
- Dodaj 1 μg przeciwciała i 1,5 μL magnetycznych kulek pokrytych Proteiną-G na każdy cel (opcjonalnie można przeprowadzić sieciowanie przeciwciała z kulkami przed dodaniem). Upewnij się, że kulki są dobrze zawieszone poprzez potrząsanie lub użycie wirówki vortex.
- Przykryj płytkę folią.
- Inkubuj przez noc (12-16 godzin) przy łagodnym obracaniu, aby zapewnić zawieszenie kulek.
- Odwiruj płytkę przy 32 x g przez 5 sekund, aby usunąć ciecz z powierzchni folii.
- Zdejmij foliową pokrywę.
- Przemywanie i elucja kulek mogą być wykonane ręcznie lub automatycznie. Niniejsza procedura opisuje kroki zautomatyzowane na platformie Kingfisher.
- Przemyj kulki 2 razy 20 μL PBS + 0,03% CHAPS (1 minuta na każde przemycie).
- Przemyj kulki 1 raz 200 μL rozcieńczenia 1:10 PBS + 0,03% CHAPS (1 minuta).
- Peptydy są eluowane w 25 uL 5% kwasu octowego + 0,03% CHAPS.
- Umieść płytkę z elucją na magnesie i przenieś eluat do płytki 96-dołkowej, uważając, aby nie przenieść pozostałych kulek.
- Przykryj płytkę matą uszczelniającą.
- Płytka zawierająca eluat jest przekazywana do potrójnego spektrometru mas z quadrupolem w celu analizy.
3. Analiza metodą monitorowania wybranych reakcji w spektrometrii mas
- Przejścia dla analizy SRM/MRM można wybrać i zoptymalizować poprzez infuzję roztworu standardu peptydowego o stężeniu 1 picomol na mikrolitr w 30% acetonitrylu/0,1% kwasu mrowieniowego do spektrometru mas z prędkością 0,5 μL/min. Po uzyskaniu stabilnego rozpylania należy zebrać widmo MS/MS.
- Przejścia wybiera się z widma MS/MS poprzez zidentyfikowanie trzech obfitych jonów fragmentacyjnych w regionie widma o niskim poziomie szumu. W przypadku wielokrotnie naładowanych jonów peptydowych, fragmenty jonów y wykrywane przy m/z > m/z prekursora są zazwyczaj najlepsze do opracowywania analiz SRM/MRM. Rysunek 2 przedstawia widmo MS/MS i wybrane jony przejść 476,3 > 508,3, 579,3, 692,4 (nie pokazano przejść dla ciężkiego standardu stabilnego izotopu 481,3 > 518,3, 589,3, 702,4) dla peptydu GDSLAYGLR.
- W zależności od marki i modelu użytego spektrometru mas istnieje wiele parametrów, które można zoptymalizować dla każdego przejścia. W tym przypadku zoptymalizowano energię kolizyjną dla każdego wybranego przejścia poprzez stopniowe zwiększanie energii kolizyjnej i monitorowanie poziomu sygnału. Dla każdego przejścia zastosowano energię kolizyjną wynoszącą 25.
- W skrócie, typowa konfiguracja dla analizy SRM/MRM przedstawia się następująco: faza ruchoma (A) 0,1% kwas mrowieniowy; (B) 90% acetonitryl / 0,1% kwas mrowieniowy, kolumna pułapkowa C18 0,3 x 5 mm, kolumna analityczna C18 75 μm ID x 15 cm (Reprosil-Pur C18 AQ, pory 120 A°). Objętość wstrzykiwania wynosi 10 μL, próbkę ładuje się przez 5 min przy 3% B i całkowitym przepływie 3 μL/min, a następnie eluje liniowym gradientem od 3 do 45% B przy przepływie 30–40 nL/min w ciągu 10 min. Warunki na urządzeniu 40 QTRAP (ABSCIEX, Foster City, CA) obejmowały: napięcie rozpylania 2,3 kV, temperaturę źródła jonów 150 °C, GS1 wynoszące 12 oraz gaz osłonowy (curtain gas) 15.
- Próbkę analizuje się metodą SRM/MRM poprzez wstrzyknięcie 10 μL próbki. Powierzchnie pików dla peptydów lekkich i ciężkich są całkowane przy użyciu programu Skyline.14 Oblicz stosunek powierzchni pików (PAR) peptydu nieznakowanego do znakowanego w każdej próbce, wykorzystując najbardziej obfite przejście wolne od szumu tła; w tym przypadku przejście y5 (lekki peptyd 476,3 > 579,3, ciężki peptyd standardowy 481,3 > 589,3).
4. Reprezentatywne wyniki:
Zmierzone stosunki powierzchni piku (lekki peptyd endogenny w stosunku do dodanego ciężkiego peptydu znakowanego izotopowo) zapewniają ilościowy pomiar peptydu docelowego. Rysunek 3 przedstawia przykładowy chromatogram peptydów lekkich i ciężkich w próbce wzbogaconej metodą SISCAPA. Należy zauważyć, że peptydy lekkie i ciężkie eluują w tym samym czasie, a w celu potwierdzenia tożsamości każdego peptydu można monitorować wiele przejść.
Rysunek 1. Schematyczny przegląd procesu SISCAPA. Złożona mieszanina białek jest trawiona do peptydów. Docelowe anality peptydowe (anality endogenny oraz dodany wewnętrzny standard znakowany stabilnymi izotopami) są wzbogacane przy użyciu przeciwciał przeciwpeptydowych unieruchomionych na magnetycznych cząstkach powlekanych białkiem G. Po izolacji docelowe peptydy są eluowane z cząstek magnetycznych i analizowane metodą spektrometrii mas w celu ich oszacowania ilościowego względem standardu wewnętrznego.
Rycina 2. Widmo MS/MS peptydu GDSLAYGLR przedstawiające wybór trzech fragmentów dla przejść SRM/MRM.
Rycina 3. Przykładowe chromatogramy przedstawiające profil piku lekkiego analitu peptydowego (kolor czerwony) oraz ciężkiego standardu wewnętrznego znakowanego stabilnym izotopem (kolor niebieski). Chromatogramy dla przejścia y5 lekkiego peptydu (476,3 > 579,3) oraz standardu znakowanego ciężkim stabilnym izotopem (481,3 > 589,3) są przedstawione w funkcji czasu w miarę ich elucji z układu chromatograficznego.
Dyskusja
Kluczowym krokiem opisanego protokołu jest zapewnienie stałego mieszania kulek podczas okresu inkubacji. Pozwolenie kulek na opadnięcie na dno studzienki/fiolki spowoduje zwiększenie zmienności wyników. Ważne jest również odwirowanie wszelkich cieczy, które mogą pozostać na górnej części studzienki/fiolki po zakończeniu inkubacji. Krytyczna jest także powtarzalność trawienia trypsyną. Opisana tutaj procedura trawienia była szeroko stosowana w naszym laboratorium w połączeniu z metodą SISCAPA; prawdopodobnie jednak alternatywne metody trawienia mogą zostać zoptymalizowane dla konkretnego zestawu białek docelowych.15 Elucja wolnego przeciwciała nie zakłóca detekcji peptydów, prawdopodobnie dlatego, że przeciwciało jest wykluczane z kolumny lub eluuje później niż peptydy, jednak przeciwciało może zostać sieciowane z kulek Protein G przed wzbogaceniem powinowactwowym w dużych eksperymentach lub w przypadku, gdy wolne przeciwciało stanie się problematyczne. Stwierdziliśmy również, że przydatne jest umieszczenie magnesu pod płytką z próbkami w autopróbniku oraz płukanie kolumny pułapkowej w kierunku przeciwnym do przepływu (w porównaniu do ładowania), aby usunąć wszelkie pozostałe kulki lub cząstki. Oprócz opisanego podejścia z wykorzystaniem kulek magnetycznych, technikę tę można również dostosować do formatu kolumnowego (tj. chromatografii powinowactwowej).12, 16
Gdy użytkownik opanuje ogólny protokół, technikę tę można poddać kilku modyfikacjom w celu usprawnienia całego badania.11 Po pierwsze, możliwe jest analizowanie wielu analityków w ramach jednego testu poprzez połączenie przeciwciał na etapie wzbogacania (tj. multipleksowanie). Spektrometr masowy jest zdolny do jednoczesnej analizy dużej liczby analityków. Po drugie, zwiększenie objętości próbki wyjściowej poprawia czułość analizy.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu NCI Clinical Proteomic Technology Assessment Center (CPTAC) (#U24 CA126476), a także z grantu Entertainment Industry Foundation (EIF) oraz EIF Women's Cancer Research Fund przyznanego Breast Cancer Biomarker Discovery Consortium, a także dzięki hojnym darowiznom od Keck Foundation, Canary Foundation oraz Paul G. Allen Family Foundation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytki 96-dołkowe z głębokimi dołkami o pojemności 1000 µl | Eppendorf | 951032786 | |
| płyta z kartridżami Oasis HLB 1 cc, Sep-pak, płyta 96-dołkowa 40 mg | Waters | 186003966 | |
| płytka 96-dołkowa Kingfisher | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| Przezroczysta płytka 96-dołkowa z białymi ściankami | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Pokrywa z folii aluminiowej do płytki 96-dołkowej | Excel Scientific | 12-169 | |
| Mata uszczelniająca Axymat do płytek 96-dołkowych | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| film rentgenowski X-pierce | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| Procesor kulek magnetycznych Kingfisher z głowicą magnetyczną do PCR | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| Tabela 1: Materiały | |||
| Mocznik | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma zasada | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "ditiotreitol w formie nie wymagającej odważania" |
| jodoacetamid (IAM) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| Magnetyczne kulek Protein G, 2,8 μm | Invitrogen | 10004D | |
| bufor fosforanowy (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| Kwas mrówkowy | EMD Millipore | 11670 | |
| Acetonitryl | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| Kwas octowy | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Tabela 2: Odczynniki | |||
| 100 mM Tris pH 8 | |||
| 9 M mocznik / 30 mM DTT w 100 mM Tris (pH 8) | należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem | ||
| 500 mM IAM w 100 mM Tris (pH 8) | należy przygotowywać na świeżo przy każdym użyciu | ||
| Trypsyna 1 mg/ml w 100 mM Tris pH 8 | |||
| Inhibitor trypsyny 1 mg/ml w 100 mM Tris pH 8 | |||
| Mastermix standardu stabilnych izotopów | |||
| Mastermix przeciwciał przeciwpeptidekowych | |||
| Tabela 3: Roztwory do przygotowania |
Bibliografia
- Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).
- Anderson, N. L. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).
- Chace, D. H., Kalas, T. A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).
- Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).
- Barr, J. R. Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).
- Kuhn, E. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).
- Whiteaker, J. R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).
- Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).
- Kuhn, E. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
- Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).
- Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
- Ackermann, B. L., Berna, M. J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).
- MacLean, B. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Proc, J. L. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
- Berna, M. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).
Przedruki i uprawnienia
