Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Podsumowanie

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Streszczenie

Erytropoeza jest powszechnie stosowanym modelem badawczym w studiach nad różnicowaniem komórek. Podczas erytropoezy pluripotencjalne dorosłe ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) różnicują się w progenitorów oligopotencjalnych, zdeterminowane prekursory oraz dojrzałe krwinki czerwone ¹. Proces ten jest w dużej mierze regulowany na poziomie ekspresji genów, przy czym specyficzne czynniki transkrypcyjne aktywują geny specyficzne dla danej linii komórkowej, jednocześnie represując geny charakterystyczne dla innych typów komórek ². Badania nad czynnikami transkrypcyjnymi regulującymi erytropoezę są często prowadzone z wykorzystaniem ludzkich i mysich linii komórkowych, które w pewnym stopniu reprezentują komórki erytroidalne na określonych etapach różnicowania ^3-5. Jednakże transformowane linie komórkowe mogą jedynie częściowo naśladować komórki erytroidalne i, co najważniejsze, nie pozwalają na kompleksowe badanie dynamicznych zmian zachodzących w miarę przechodzenia komórek przez wiele etapów w kierunku ich ostatecznego losu erytroidalnego. W związku z tym aktualnym wyzwaniem pozostaje opracowanie protokołu pozwalającego na uzyskanie stosunkowo homogennych populacji pierwotnych HSCs oraz komórek erytroidalnych na różnych etapach różnicowania w ilościach wystarczających do przeprowadzenia eksperymentów z zakresu genomiki i proteomiki.

W niniejszym opracowaniu opisujemy ex vivo protokół hodowli komórkowej w celu indukcji różnicowania erytroidalnego z ludzkich komórek macierzystych/progenitorowych krwiotwórczych wyizolowanych z krwi pępowinowej, szpiku kostnego lub krwi obwodowej osób dorosłych zmobilizowanej za pomocą G-CSF (leukaferezą). System hodowlany ten, opracowany pierwotnie przez laboratorium Douaya ⁶, wykorzystuje cytokiny i kokulturę komórek mezenchymalnych do naśladowania mikrośrodowiska szpiku kostnego. Wykorzystując tę ex vivo protokół różnicowania obserwujemy silną amplifikację progenitorów erytroidalnych, indukcję różnicowania wyłącznie w kierunku linii erytroidalnej oraz pełne dojrzewanie do stadium bezjądrowych erytrocytów. Zatem system ten stwarza możliwość badania molekularnego mechanizmu regulacji transkrypcyjnej w miarę postępu komórek macierzystych krwi wzdłuż linii erytroidalnej.

Badanie erytropoezy na poziomie transkrypcyjnym wymaga również możliwości nadekspresji lub wyciszenia (knockdown) specyficznych czynników w pierwotnych komórkach erytroidalnych. W tym celu wykorzystujemy system dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusów, który umożliwia efektywne zakażanie zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się ⁷. W niniejszej pracy wykazujemy, że jesteśmy w stanie efektywnie wyciszyć czynnik transkrypcyjny TAL1 w pierwotnych ludzkich komórkach erytroidalnych. Ponadto ekspresja GFP wykazuje wydajność infekcji lentiwirusowej bliską 90%. Tym samym nasz protokół zapewnia niezwykle użyteczny system do charakterystyki sieci regulacyjnej czynników transkrypcyjnych kontrolujących erytropoezę.

Protokół

Część I. Erytropoeza ex vivo ludzkich macierzystych i progenitorowych komórek krwi

1. Izolacja ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych CD34⁺

Populację ludzkich komórek CD34⁺, która zawiera mieszaninę hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs) oraz wczesnych progenitorów ⁸, pozyskuje się z krwi pępowinowej, krwi obwodowej mobilizowanej G-CSF (leukafereza) lub szpiku kostnego (Rysunek 1-Krok1). W przypadku użycia krwi pępowinowej lub krwi obwodowej należy przejść bezpośrednio do kroku 1.2. W przypadku użycia szpiku kostnego należy rozpocząć od krok....

Dyskusja

Wcześniej stosowano szereg metod różnicowania komórek erytroidalnych w kulturze z różnym stopniem powodzenia. Na przykład niektóre protokoły bez kokultury na komórkach MS-5 umożliwiają ekspansję komórek erytroidalnych, lecz nie są wydajne w produkcji w pełni dojrzałych, beżądrowych erytrocytów ^12-17. Z kolei inne metody pozwalają na wydajną enukleację, jednak dzieje się to kosztem proliferacji ^18,19. Metoda zastosowana w niniejszej pracy, opracowana pierwotnie w laboratorium Douay ⁶, łącz.......