Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2813

⸱

16 lipca 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Streszczenie

Erytropoeza jest powszechnie stosowanym modelem badawczym w studiach nad różnicowaniem komórek. Podczas erytropoezy pluripotencjalne dorosłe ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) różnicują się w progenitorów oligopotencjalnych, zdeterminowane prekursory oraz dojrzałe krwinki czerwone 1. Proces ten jest w dużej mierze regulowany na poziomie ekspresji genów, przy czym specyficzne czynniki transkrypcyjne aktywują geny specyficzne dla danej linii komórkowej, jednocześnie represując geny charakterystyczne dla innych typów komórek 2. Badania nad czynnikami transkrypcyjnymi regulującymi erytropoezę są często prowadzone z wykorzystaniem ludzkich i mysich linii komórkowych, które w pewnym stopniu reprezentują komórki erytroidalne na określonych etapach różnicowania 3-5. Jednakże transformowane linie komórkowe mogą jedynie częściowo naśladować komórki erytroidalne i, co najważniejsze, nie pozwalają na kompleksowe badanie dynamicznych zmian zachodzących w miarę przechodzenia komórek przez wiele etapów w kierunku ich ostatecznego losu erytroidalnego. W związku z tym aktualnym wyzwaniem pozostaje opracowanie protokołu pozwalającego na uzyskanie stosunkowo homogennych populacji pierwotnych HSCs oraz komórek erytroidalnych na różnych etapach różnicowania w ilościach wystarczających do przeprowadzenia eksperymentów z zakresu genomiki i proteomiki.

W niniejszym opracowaniu opisujemy ex vivo protokół hodowli komórkowej w celu indukcji różnicowania erytroidalnego z ludzkich komórek macierzystych/progenitorowych krwiotwórczych wyizolowanych z krwi pępowinowej, szpiku kostnego lub krwi obwodowej osób dorosłych zmobilizowanej za pomocą G-CSF (leukaferezą). System hodowlany ten, opracowany pierwotnie przez laboratorium Douaya 6, wykorzystuje cytokiny i kokulturę komórek mezenchymalnych do naśladowania mikrośrodowiska szpiku kostnego. Wykorzystując tę ex vivo protokół różnicowania obserwujemy silną amplifikację progenitorów erytroidalnych, indukcję różnicowania wyłącznie w kierunku linii erytroidalnej oraz pełne dojrzewanie do stadium bezjądrowych erytrocytów. Zatem system ten stwarza możliwość badania molekularnego mechanizmu regulacji transkrypcyjnej w miarę postępu komórek macierzystych krwi wzdłuż linii erytroidalnej.

Badanie erytropoezy na poziomie transkrypcyjnym wymaga również możliwości nadekspresji lub wyciszenia (knockdown) specyficznych czynników w pierwotnych komórkach erytroidalnych. W tym celu wykorzystujemy system dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusów, który umożliwia efektywne zakażanie zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się 7. W niniejszej pracy wykazujemy, że jesteśmy w stanie efektywnie wyciszyć czynnik transkrypcyjny TAL1 w pierwotnych ludzkich komórkach erytroidalnych. Ponadto ekspresja GFP wykazuje wydajność infekcji lentiwirusowej bliską 90%. Tym samym nasz protokół zapewnia niezwykle użyteczny system do charakterystyki sieci regulacyjnej czynników transkrypcyjnych kontrolujących erytropoezę.

Protokół

Część I. Erytropoeza ex vivo ludzkich macierzystych i progenitorowych komórek krwi

1. Izolacja ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych CD34+

Populację ludzkich komórek CD34+, która zawiera mieszaninę hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs) oraz wczesnych progenitorów 8, pozyskuje się z krwi pępowinowej, krwi obwodowej mobilizowanej G-CSF (leukafereza) lub szpiku kostnego (Rysunek 1-Krok1). W przypadku użycia krwi pępowinowej lub krwi obwodowej należy przejść bezpośrednio do kroku 1.2. W przypadku użycia szpiku kostnego należy rozpocząć od kroku 1.1. Listę odczynników i sprzętu znajduje się w Tabeli 1.

Ten etap przeprowadza się w warunkach sterylnych (tzn. w komorze z laminarnym przepływem powietrza) i w RT, chyba że wskazano inaczej.

  1. Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny szpiku kostnego:
    1. Resuspenduj szpik w 10 objętościach pożywki RPMI 1640 zawierającej 0,02% kolagenazy B i 100 U/ml DNazy 1
    2. Mieszać delikatnie na shakerze analitycznym przez 45 min.
    3. Przefiltruj komórki przez nylonowy siewnik o oczkach 30 μm.
  2. Wyizoluj mononuklearne komórki o niskiej gęstości (MNC) metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll:
    1. Rozcieńczyć zawiesinę krwi lub szpiku 2–4 objętościami buforu PBS zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 2 mM EDTA. Uwaga: zwiększenie objętości podnosi czystość MNC.
    2. W probówce stożkowej o pojemności 50 ml ostrożnie nanieś 35 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek na 15 ml Ficoll-paque. Wirować z przyspieszeniem 400g przez 30 min w rotorze z ruchomymi koszyczkami (swinging-bucket), bez użycia hamulca.
    3. Odssać górną warstwę, pozostawiając nienaruszoną pośrednią warstwę MNC.
    4. Przenieś warstwę interfazy (zawierającą MNC) do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    5. Dopełnić probówkę buforem PBS zawierającym 2% FBS i 2 mM EDTA, delikatnie wymieszać poprzez odwracanie probówki i wirować z prędkością 300g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Odciąć nadsącz.
    6. Przemyj osad komórkowy jeszcze 2 razy, aby usunąć płytki krwi. Uwaga: krok ten zwiększa czystość CD34+ komórki
    7. Należy pobrać 20 μl zawiesiny komórek i przenieść do probówki typu Eppendorf. Dodać 200 μl buforu do lizy erytrocytów (Tabela 1) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. Następnie 18 μl tej zawiesiny należy nanieść na komorę hemocytometryczną i policzyć jądrowe komórki mononuklearne (MNC).
    8. Mononuklearne komórki krwi (MNC) można wykorzystać natychmiast lub zamrozić w temperaturze 108 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowej zawierającej 10% DMSO i przechowywanej w ciekłym azocie.
  3. Izolacja CD34+ komórki poprzez pozytywną selekcję immunomagnetyczną (Rysunek 1-Krok 1)
    Używamy zestawu CD34 Microbead Kit (zawierającego roztwór mikrokulek sprzężonych z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko ludzkiemu antygenowi CD34 oraz roztwór odczynnika FcR Blocking Reagent zawierający ludzkie IgG) w połączeniu z dwiema kolumnami LS Mini-Macs, buforem autoMACS Running Buffer oraz separatorem MiniMACS Separator (Tabela 1). Poniżej opisujemy nasz protokół, rozpoczynając od 2,3x108 MNC. W przypadku zastosowania innej liczby komórek, objętości należy odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć. Ponadto, dla liczby do 2x108 Kolumny MS MiniMacs mogą być stosowane zamiennie z kolumnami LS MiniMacs do izolacji MNC.
    Należy utrzymywać komórki i odczynniki w niskiej temperaturze (4-8°C), aby zapobiec cappingowi przeciwciał na powierzchni komórek oraz niespecyficznemu znakowaniu komórek.
    1. Resuspend pellet zawierający 2,3x108 komórki mononuklearne (MNC) w 690 μl buforu do elektroforezy (300 μl na 10⁸ MNC, przy czym 300 μl stanowi minimalną wymaganą objętość zawiesiny) i przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
    2. Dodać 230 μl odczynnika blokującego FcR (FcR Blocking Reagent)
    3. Dodać 230 μl roztworu CD34 MicroBeads.
    4. Wymieszać dokładnie ręcznie i inkubować przez 30 min w temperaturze 4°C.
    5. Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu do elektroforezy (Running Buffer), a następnie odwirować z prędkością 300g przez 10 min.
    6. Całkowicie odessaj nadsącz.
    7. Resuspenduj komórki w 1,2 ml buforu do analizy (Running Buffer) (użyj 0,5 ml buforu na 108 komórki mononuklearne (MNCs) Uwaga: Przed separacją magnetyczną ważne jest uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek. W razie potrzeby należy przepuścić komórki przez nylonowe sito o oczkach 30 μm w celu usunięcia aglutynatów komórkowych.
    8. Przygotować kolumnę LS, umieszczając ją w polu magnetycznym separatora MiniMACS.
    9. Przepłucz kolumnę 3 ml buforu do prowadzenia (Running Buffer).
    10. Nanieś 1,2 ml zawiesiny komórkowej na kolumnę.
    11. Zebrać frakcję przepływową i wykorzystać ją do weryfikacji wydajności oraz czystości CD34+ izolacja komórek. Alternatywnie należy zamrozić komórki zawarte w tej frakcji i przechowywać je w ciekłym azocie. Uwaga: frakcja ta zawiera nieoznaczone komórki i może również zawierać część komórek CD34 oznaczonych.+ komórki, które nie przywarły do kolumny.
    12. Przemyj kolumnę trzykrotnie 3 ml buforu do elucji (Running Buffer), połącz otrzymane frakcje i wykorzystaj je w sposób analogiczny do powyższej frakcji nieprzepuszczonej (flow-through).
    13. Zdejmij kolumnę z magnesu i umieść ją w 15 ml polipropylenowej probówce zbiorczej.
    14. Aby eluować komórki, należy dodać 5 ml buforu do elektroforezy (Running Buffer) na kolumnę i natychmiast wypłukać oznakowane komórki CD34.+ komórki poprzez mocne dociśnięcie tłoka do kolumny.
    15. Powtórz procedurę oczyszczania kolumnowego (kroki od h do n), przepuszczając komórki przez świeżo przygotowaną kolumnę LS. Uwaga: zwiększa to czystość CD34+ komórek. Z zawiesiny o stężeniu 2,3x108 MNC wyizolowane z leukaferezy; zazwyczaj otrzymujemy 1,1x106 CD34+ komórki o czystości > 95±3% (Rycina 1-Krok 1).
    16. Zamrozić komórki w pożywce hodowlanej zawierającej 10% DMSO i przechowywać w ciekłym azocie lub przejść bezpośrednio do kroku 2).

2. Różnicowanie erytroidalne w hodowli komórkowej

Komórki CD34+ hoduje się w uzupełnionej pożywce IMDM z sekwencyjnym dodawaniem hydrokortyzonu i specyficznych kombinacji cytokin zgodnie z czteroetapowym protokołem zaadaptowanym z 6 (Rysunek 1-Krok 2). W trakcie całej procedury przeprowadza się serię testów w celu weryfikacji wzrostu komórek i różnicowania erytroidalnego.

Liczba komórek CD34+ wymagana do rozpoczęcia hodowli jest zmienna i zależy od skali eksperymentu. Zazwyczaj w badaniach nad ekspresją genów przeprowadzamy hodowlę w małej skali, rozpoczynając od 0,1x106 komórek CD34+ w 10 ml pożywki i utrzymując małe objętości poprzez zamrażanie nadmiaru komórek w trakcie procedury. W badaniach, w których wymagana jest ekstrakcja białek, hodowle prowadzone są w większej skali. Opisujemy tutaj eksperyment w dużej skali, w którym rozpoczynamy od ~7x106 komórek CD34+ wyizolowanych z leukaferezy.
Przez cały czas zachowywane są warunki sterylne. Odczynniki wymieniono w Tabelach 1, 2 i 3.

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować suplementowane podłoże IMDM zgodnie z opisem w Tabeli 2 i zamrozić alikwoty o objętości 40 ml w temperaturze -20°C (można to zrobić z wyprzedzeniem).
    2. Przygotować roztwory stokowe hydrokortyzonu i cytokin zgodnie z opisem w Tabeli 3.
  2. Krok 1: Dzień 0-11
    Komórki hematopoetyczne hoduje się w suplementowanym podłożu IMDM zawierającym hydrokortyzon (HC), czynnik komórek macierzystych (SCF), interleukinę 3 (IL-3) i erytropoetynę (EPO) (Tabela 3). Mysie komórki zrębu szpiku kostnego MS-5 (Tabela 1) są namnażane w przygotowaniu do Kroku 2.
    • Dzień 0:
      1. Podgrzać 120 ml suplementowanego podłoża IMDM i dodać HC, SCF, IL-3 oraz EPO (Tabela 3).
      2. Rozmrozić 7x106 komórek CD34+, umieszczając najpierw fiolkę(i) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Gdy komórki są jeszcze zamrożone, dodać 1 ml podgrzanego podłoża i przenieść komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Przepłukać fiolkę 2 ml podłoża i przenieść zawartość do probówki 15 ml.
      3. Dodać 6 ml podłoża do zawiesiny komórkowej, wymieszać poprzez odwracanie probówki i wirować z prędkością 200 g przez 5 min.
      4. Odssać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 10 ml świeżego podłoża.
      5. Policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru po zmieszaniu 10 μl zawiesiny komórkowej z 10 μl roztworu Trypan Blue (Tabela 1). Uwaga: Śmiertelność komórek podczas rozmrażania wynosi około 25%, zatem stężenie żywych komórek powinno wynosić ~0,5x106 komórki/ml.
      6. Odłożyć około 3 ml zawiesiny komórkowej do testów (patrz akapit 6).
      7. Przenieść pozostałe 7 ml do kolby T-175 i dodać 63 ml podłoża, aby uzyskać stężenie 0,05x106 komórki/ml w 70 ml, a następnie umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37°C.
    • Dzień 1:
      1. Podgrzać 85 ml podłoża do hodowli komórek MS-5: αMEM z Glutamax (Tabela 1), 10% FBS oraz 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
      2. Przygotować trzy okrągłe szalki hodowlane 150 mm x 25 mm, każda z zasiałem 2x106 komórek MS-5 w 25 ml podłoża w celu uzyskania stężenia 0,08x106 komórki/ml i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37°C. Uwaga: Najlepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu komórek MS-5 o niskim numerze pasażu (<20). Kulturę konfluentną należy powiększać poprzez pasażowanie 1:5 co trzeci dzień przy użyciu trypsyny zawierającej 0,05% EDTA.
    • Dzień 2:
      1. Policzyć komórki hematopoetyczne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~20 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: W naszym doświadczeniu w ciągu pierwszych 2 dni śmiertelność komórek może przekroczyć 30-50%, w związku z czym końcowe stężenie komórek jest zazwyczaj zbliżone do tego z Dnia 0 (Rysunek 2).
      2. Wymienić podłoże hodowlane MS-5 na 25 ml świeżego podłoża, upewniając się, że usunięto komórki MS-5, które nie przytwierdziły się do podłoża.
    • Dzień 4:
      1. Policzyć komórki hematopoetyczne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~10 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Na tym etapie komórki powinny zacząć proliferować, z >75% żywych komórek przy stężeniu ~0,2x106 komórki/ml. Komórki można zamrozić w stężeniu 1-2x106 komórki/ml w suplementowanym podłożu IMDM zawierającym 10% DMSO i przechowywać w ciekłym azocie.
      2. Przenieść pozostałe ~40 ml kultury do kolby T-175 i dodać odpowiednią ilość suplementowanego podłoża IMDM zawierającego HC, SCF, IL-3 i EPO (Tabela 3), aby osiągnąć objętość końcową 150 ml. Uwaga: Stężenie komórek powinno wynosić ~0,05x106 komórki/ml.
      3. Powiększyć hodowlę komórek MS-5 (które powinny być konfluentne w 60-70%) poprzez ich rozcieńczenie 1:5 w nowych okrągłych szalkach hodowlanych 150 mm x 25 mm przy użyciu trypsyny 0,05% EDTA. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić ~0,08x106 komórki/ml. Uwaga: Zazwyczaj jedną szalkę można powiększyć 5-krotnie, tak aby uzyskać 15 szalek komórek MS-5 o stężeniu ~0,08x106 komórki/ml.
    • Dzień 6:
      1. Policzyć komórki hematopoetyczne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~5 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Komórki są w fazie intensywnej proliferacji i stężenie komórek powinno być utrzymywane na poziomie ≤1,5x106 komórki/ml. Jeśli stężenie komórek jest wyższe, dodać świeże suplementowane podłoże IMDM zawierające HC, SCF, IL-3 i EPO.
    • Dzień 7:
      1. Policzyć komórki hematopoetyczne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki. Uwaga: W naszym doświadczeniu komórki zazwyczaj osiągają gęstość 1,5x106 komórki/ml w Dniu 7.
      2. Dodać odpowiednią ilość podłoża, aby utrzymać stężenie komórek na poziomie ~0,8x106 komórki/ml. Uwaga: Zazwyczaj dodajemy 100 ml świeżego suplementowanego podłoża IMDM zawierającego HC, SCF, IL-3 i EPO, aby uzyskać 245 ml komórek o stężeniu ~0,8x106 komórki/ml.
      3. Powiększyć hodowlę komórek MS-5 (które powinny być konfluentne w 60-70%) poprzez ich rozcieńczenie 1:5 w kolbach T-175 (zamiast szalek) przy użyciu trypsyny 0,05% EDTA. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić ~0,08x106 komórki/ml. Uwaga: Należy przygotować 61 kolb komórek MS-5 o stężeniu ~0,08x106 komórki/ml. Pozostałe komórki MS-5 zamrozić i przechowywać w ciekłym azocie.
    • Dzień 8:
      1. Policzyć komórki hematopoetyczne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~5 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek powinna wynosić ~1x106 komórki/ml.
      2. Podgrzać 2 L suplementowanego podłoża IMDM zawierającego tylko SCF i EPO (Tabela 2 i 3).
      3. Zebrać 200 ml kultury hematopoetycznej (zawierającej ~200x106 komórek), wirować z prędkością 200 g przez 10 min, odssać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 40 ml suplementowanego podłoża IMDM zawierającego SCF i EPO.
      4. Rozdzielić zawiesinę komórkową do 8 kolb T-175 (5 ml na kolbę) i dodać 245 ml suplementowanego podłoża IMDM zawierającego SCF i EPO do każdej kolby. Uwaga: Mamy teraz 8 kolb, z których każda zawiera 250 ml komórek o stężeniu 0,1x106 komórki/ml.
      5. Pozostałe komórki (~40 ml) z Dnia 8 można zamrozić w stężeniu 1-2x106 komórki/ml w suplementowanym podłożu IMDM zawierającym 10% DMSO i przechowywać w ciekłym azocie.
    • Dzień 10:
      1. Policzyć komórki hematopoetyczne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~5 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek powinna wynosić ~1x106 komórki/ml.
  3. Krok 2: Dzień 11-15
    Około połowy komórek zbiera się do przyszłego wykorzystania (np. ekstrakcji jąder). Pozostałe komórki erytroidalne są hodowane w ko-kulturze na komórkach MS-5 w suplementowanym podłożu IMDM zawierającym EPO (Tabela 2 i 3). Komórki erytroidalne muszą być przenoszone na świeżą warstwę MS-5 co 3-4 dni.
    • Dzień 11:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki. Uwaga: Gęstość komórek powinna wynosić ~1,5x106 komórki/ml.
      2. Podgrzać w temperaturze 37°C 1 L 1xPBS, 400 ml suplementowanego podłoża IMDM oraz 5 L suplementowanego podłoża IMDM zawierającego EPO (Tabela 2 i 3).
      3. Odłożyć objętość kultury odpowiadającą 15x108 komórkom (np. ~4 kolby po 250 ml każda) i przejść do punktu e.
      4. Pozostałe komórki (np. 15x108) zebrać do probówek stożkowych, wirować przy 450 g przez 10 min, resuspender w zimnym buforze MS30 (Tabela 5) zawierającym 0,1 mM DTT przy maksymalnym stężeniu 108 komórki/ml i przechowywać w temperaturze -80°C po szybkim zamrożeniu w ciekłym azocie do przyszłego wykorzystania (np. ekstrakt jądrowy).
      5. Przepłukać 50 kolb konfluentnych komórek MS-5, używając 20 ml 1xPBS dla każdej kolby, i natychmiast dodać 80 ml świeżego suplementowanego podłoża IMDM zawierającego EPO do każdej kolby. Uwaga: Ze względu na dużą liczbę kolb, przetwarzamy 4 kolby naraz. Dokładnie: wyjmujemy z inkubatora 4 kolby konfluentnych komórek MS-5, przepłukujemy je 1xPBS, dodajemy 80 ml podłoża i wracamy kolby do inkubatora. Gdy wszystkie kolby zostaną przygotowane i zwrócone do inkubatora, przechodzimy do punktu f. Ze względu na liczbę kolb do przetworzenia w procedurze na dużą skalę, korzystne jest, aby te etapy były wykonywane przez dwie osoby pracujące jednocześnie.
      6. Odwirować równowartość 15x108 komórek erytroidalnych w 4 probówkach stożkowych przy 450 g przez 10 min i usunąć nadsącz.
      7. Przepłukać 4 osady komórkowe, używając 100 ml suplementowanego podłoża IMDM dla każdego z nich.
      8. Resuspender każdy osad komórkowy w 250 ml suplementowanego podłoża IMDM zawierającego EPO i rozdzielić 20 ml tej zawiesiny komórkowej do każdej z 50 kolb zawierających komórki MS-5 i 80 ml podłoża. Uwaga: Na tym etapie powinni Państwo otrzymać 50 kolb z konfluentnymi komórkami MS-5 zawierających 100 ml komórek erytroidalnych o stężeniu 0,3x106 komórki/ml.
      9. Powiększyć pozostałe 11 kolb komórek MS-5 poprzez ich rozcieńczenie 1:5 w kolbach T-175 przy użyciu trypsyny 0,05% EDTA. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić ~0,08x106 komórki/ml. Uwaga: Należy przygotować 55 kolb komórek MS-5 o stężeniu ~0,08x106 komórki/ml.
    • Dzień 12:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~4 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek powinna wynosić ~0,6x106 komórki/ml.
    • Dzień 14:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~3 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek powinna wynosić ~0,9x106 komórki/ml.
  4. Krok 3: Dzień 15-18
    Część komórek zbiera się do przyszłego wykorzystania (np. ekstrakcji jąder). Pozostałe komórki erytroidalne są hodowane w ko-kulturze na komórkach MS-5 w suplementowanym podłożu IMDM bez cytokin.
    • Dzień 15:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki. Uwaga: Gęstość komórek powinna wynosić ~1x106 komórki/ml.
      2. Podgrzać w temperaturze 37°C 1 L 1xPBS oraz 5 L suplementowanego podłoża IMDM (Tabela 2).
      3. Odłożyć objętość kultury odpowiadającą 10x108 komórkom (np. ~10 kolb po 100 ml każda) i przejść do punktu e.
      4. Pozostałe komórki (np. 40x108) zebrać i resuspender w zimnym buforze MS30 (Tabela 5) zawierającym 0,1 mM DTT do przyszłego wykorzystania (patrz Krok 2: Dzień 11 punkt d).
      5. Przepłukać 50 kolb konfluentnych komórek MS-5, używając 20 ml 1xPBS dla każdej kolby, i natychmiast dodać 80 ml świeżego suplementowanego podłoża IMDM do każdej kolby.
      6. Odwirować równowartość 10x108 komórek erytroidalnych w 4 probówkach stożkowych przy 450 g przez 10 min i usunąć nadsącz.
      7. Przepłukać 4 osady komórkowe, używając 100 ml suplementowanego podłoża IMDM dla każdego z nich.
      8. Resuspender każdy osad komórkowy w 250 ml suplementowanego podłoża IMDM i rozdzielić 20 ml tej zawiesiny komórkowej do każdej z 50 kolb zawierających komórki MS-5 i 80 ml podłoża. Uwaga: Na tym etapie powinni Państwo otrzymać 50 kolb z konfluentnymi komórkami MS-5 zawierających 100 ml komórek erytroidalnych o stężeniu 0,2x106 komórki/ml.
      9. Powiększyć pozostałe 5 kolb komórek MS-5 poprzez ich rozcieńczenie 1:5 w kolbach T-175 przy użyciu trypsyny 0,05% EDTA. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić ~0,08x106 komórki/ml. Uwaga: Należy przygotować 20 kolb komórek MS-5 o stężeniu ~0,08x106 komórki/ml. Pozostałe komórki MS-5 zamrozić i przechowywać w ciekłym azocie.
    • Dzień 16:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~4 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek powinna wynosić ~0,6x106 komórki/ml.
  5. Krok 4: Dzień 18-26
    Komórki erytroidalne zagęszcza się 3-4 krotnie, aby uzyskać końcowe stężenie 5-7x106 komórki/ml i utrzymuje się je na warstwie MS-5, aby umożliwić dojrzewanie. Do suplementowanego podłoża IMDM dodaje się 10% FBS, aby zapewnić lepszą konserwację hodowanych czerwonych krwinek (cRBCs).
    • Dzień 18:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~2 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek powinna wynosić ~1,7x106 komórki/ml.
      2. Podgrzać w temperaturze 37°C 300 ml 1xPBS oraz 1,5 L suplementowanego podłoża IMDM (Tabela 2) zawierającego 10% FBS.
      3. Przepłukać 15 kolb konfluentnych komórek MS-5, używając 20 ml 1xPBS dla każdej kolby, i natychmiast dodać 80 ml świeżego suplementowanego podłoża IMDM do każdej kolby.
      4. Odwirować komórki erytroidalne (tj. równowartość 85x108 komórek) przy 450 g przez 10 min, połączyć i rozdzielić osad do 4 probówek stożkowych.
      5. Resuspender każdy osad komórkowy w 75 ml suplementowanego podłoża IMDM zawierającego 10% FBS i rozdzielić 20 ml tej zawiesiny komórkowej do każdej z 15 kolb zawierających komórki MS-5 i 80 ml podłoża. Uwaga: Na tym etapie powinni Państwo otrzymać 15 kolb z konfluentnymi komórkami MS-5 zawierających 100 ml komórek erytroidalnych o stężeniu 6x106 komórki/ml.
      6. Powiększyć pozostałe 5 kolb komórek MS-5 poprzez ich rozcieńczenie 1:5 w kolbach T-175 przy użyciu trypsyny 0,05% EDTA. Końcowe stężenie komórek powinno wynosić ~0,08x106 komórki/ml. Uwaga: Należy przygotować 20 kolb komórek MS-5 o stężeniu ~0,08x106 komórki/ml. Pozostałe komórki MS-5 zamrozić i przechowywać w ciekłym azocie.
    • Dzień 20:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~1,5 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek jest utrzymywana na poziomie ~1,5x106 komórki/ml.
    • Dzień 22:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~1,5 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek jest utrzymywana na poziomie ~1,5x106 komórki/ml.
      2. Wymienić podłoże i przenieść komórki erytroidalne na nowe warstwy komórek MS-5 zgodnie z opisem dla Dnia 18.
    • Dzień 24:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~1,5 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek jest utrzymywana na poziomie ~1,5x106 komórki/ml.
    • Dzień 26:
      1. Policzyć komórki erytroidalne przy użyciu Trypan blue, aby wykluczyć martwe komórki, i zebrać niezbędną liczbę komórek (tj. ~1,5 ml kultury) do testów (patrz akapit 6). Uwaga: Gęstość komórek jest utrzymywana na poziomie ~1,5x106 komórki/ml.
      2. Zebrać nieprzylegające, enukleowane i w pełni hemoglobinizowane cRBCs. Uwaga: Dojrzałe cRBCs można przechowywać w podłożu SAGM (MacoPharma) w temperaturze 4°C do jednego miesiąca.
  6. Testy i reprezentatywne wyniki
    Poniższe testy są przeprowadzane w wskazanych dniach w celu weryfikacji prawidłowej proliferacji komórek i różnicowania erytroidalnego. Reprezentatywne wyniki przedstawione na rysunkach uzyskano przy użyciu komórek CD34+ wyizolowanych z leukaferazy.
    1. Komórki są liczone co drugi dzień. Reprezentatywny wynik proliferacji komórek przedstawiono na Rysunku 2.
    2. Barwienie morfologiczne metodą May-Grünwalda Giemsy wykonuje się co drugi dzień, używając 0,05x106 komórek dla Dni 0-8 i 0,2x106 komórek dla pozostałych dni, zgodnie z instrukcją producenta barwnika Giemsa (Tabela 1). Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 3.
    3. Testy półstałe wykonuje się w dubletach w celu pomiaru progenitorów hematopoetycznych co drugi dzień od Dnia 0 do Dnia 12, używając 0,01x106 komórek na test, zgodnie z instrukcją producenta półstałego podłoża Methocult (Tabela 1). Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 4.
    4. Analiza następujących markerów komórkowych jest wykonywana co drugi dzień metodą FACS: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS przy użyciu 0,2x106 komórek na test. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 5.
    5. Hemoglobinę mierzy się co drugi dzień za pomocą barwienia benzydyną. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 5.
    6. Ekspresję genów bada się metodą RT-qPCR lub za pomocą mikromacierzy po ekstrakcji RNA z 1x106 komórek. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 6B.

Komentarze do wyników:

Rysunek 1 przedstawia protokół różnicowania komórek CD34+ człowieka ex vivo w dojrzałe, zawierające hemoglobinę krwinki czerwone. Podczas różnicowania erytroidalnego komórki wykazują wysoką proliferację, co ilustruje ~8,000-krotna amplifikacja przedstawiona na Rysunku 2, uzyskana przy użyciu komórek CD34+ wyizolowanych z leukaferezy. Komórki CD34+ wyizolowane z szpiku kostnego wykazują nieco niższą proliferację z ~6,000-krotną amplifikacją, podczas gdy komórki CD34+ wyizolowane z krwi pępowinowej mogą osiągnąć 50,000-krotną amplifikację. Komórki na poszczególnych etapach różnicowania wykazują charakterystyczne rozmiary i morfologię, które zilustrowano na Rysunku 3. Należy zwrócić uwagę na proces enukleacji, który zachodzi na koniec różnicowania, zaczynając od 20. dnia. W 26. dniu wszystkie komórki utraciły jądra (Rysunek 3).

Testy tworzenia kolonii przedstawione na Rysunku 4 są wykorzystywane do wykrywania wczesnych i późnych progenitorów krwiotwórczych podczas pierwszych dni różnicowania (Dzień 0 do Dnia 8). Oprócz progenitorów erytroidalnych (CFU-E i BFU-E), zauważamy, że progenitorzy granulocytowo-makrofagiczne (CFU-GM) są znacząco reprezentowane wśród wczesnych komórek CD34+ w Dniu 0. W miarę postępu różnicowania liczba CFU-GM znacząco spada, a w Dniu 6 zostają one całkowicie zastąpione przez progenitorów erytroidalnych BFU-E i CFU-E. Należy również zauważyć, że od Dnia 4 do Dnia 6 wczesne progenitorzy erytroidalni BFU-E są stopniowo zastępowane przez ich bardziej zróżnicowane odpowiedniki CFU-E. Do Dnia 10 komórki erytroidalne w zasadzie tracą zdolność do tworzenia kolonii.

Na koniec erytropoezę monitoruje się poprzez ekspresję markerów powierzchniowych komórek, co przedstawiono na rysunku 5. Należy zwrócić uwagę na: 1) stopniową utratę markera komórek macierzystych/progenitorowych układu krwiotwórczego CD34; 2) stopniowe nabywanie i utratę markera progenitorowego CD36; 3) stopniowe nabywanie i utratę markera progenitorów erytroidalnych i retikulocytów CD71; oraz 4) wzrost poziomu markera prekursorów erytroidalnych i erytrocytów GPA. Inne markery różnicowania erytroidalnego obejmują syntezę hemoglobiny rozpoczynającą się w 8. dniu (mierzoną za pomocą barwienia benzydyną – rysunek 5) oraz enukleację komórek rozpoczynającą się w 20. dniu, mierzoną poprzez utratę barwienia DNA LDS (rysunek 5). Wreszcie, różnicowanie erytroidalne można mierzyć za pomocą RT-qPCR markerów molekularnych, takich jak czynnik transkrypcyjny TAL1 (rysunek 6B) lub geny β-globiny (dane niepokazane).

Zazwyczaj 1 ml krwi pępowinowej / leukaferezy / szpiku kostnego dostarcza 0,35x105 / 0,5x105 / 1,1x105 komórek CD34+, które teoretycznie mogą wytworzyć 1,7x109 / 0,4x109 / 0,7x109 erytrocytów przy odpowiednich współczynnikach proliferacji wynoszących 50 000 / 8 000 / 6 000. Aby uzyskać 50x106 erytrocytów po zakończeniu procedury różnicowania, będziesz potrzebować około 50 ml pożywki hodowlanej.

Część II. Wyciszanie genów za pomocą lentiwirusów podczas różnicowania erytroidalnego ex vivo

Lentiwirusy są preferowanym narzędziem do transferu genów w ludzkich komórkach pierwotnych (patrz np. Amsellem et al. 9). Lentiwirusy są często wykorzystywane do wyciszania wybranych genów w komórkach pierwotnych poprzez dostarczenie ukierunkowanego shRNA (patrz np. Laurenti et al. 10). W niniejszym protokole celem jest czynnik transkrypcyjny TAL1 w ludzkich pierwotnych komórkach erytroidalnych. Jako kontrolę negatywną zastosowano shRNA o sekwencji losowej (scrambled), która nie odpowiada żadnemu znanemu genowi. Ekspresja GFP służy do oceny wydajności transdukcji.

1. Przygotowanie cząsteczek wektora lentiwirusowego

W celu uzyskania cząsteczek lentiwirusowych, ludzkie komórki embrionalnej nerki 293T są kotransfekowane trzema plazmidami: jednym obejmującym system pakowania wirusa drugiej generacji kodujący geny HIV-1 z wyjątkiem env, vpr, vif, vpu i nef (tj. psPAX2); jednym kodującym otoczkę wirusa pseudotypowanego G wirusa zapalenia jamy ustnej i języka (tj. pMD2G); oraz jednym wektorem lentiwirusowym kodującym gen zainteresowania (tj. pBLOCK-it6-DEST(shTal1) kodujący shRNA dla TAL1, pBLOCK-it6-DEST(shScr) kodujący shRNA typu scrambled lub pWPIP kodujący GFP) (Tabela 4). Cząsteczki lentiwirusowe są zbierane z nadsączu hodowli transfektowanych komórek 293T.

Aby uniknąć niezamierzonego zakażenia komórek, wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem lentiwirusów (przygotowanie wirusów i infekcję) przeprowadzamy w dedykowanej komorze z laminarnym przepływem powietrza, oddzielonej od pozostałych kultur komórkowych. Ponadto odpady powstałe w wyniku pracy z lentiwirusami są utylizowane osobno. Lentiwirusy drugiej generacji opisane w niniejszym protokole są niezdolne do replikacji i powinny być traktowane jako organizmy poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (Biosafety Level 2). Niektóre instytucje mogą stosować specyficzne procedury bezpieczeństwa dotyczące lentiwirusów, dlatego zalecamy przestrzeganie ustalonych wytycznych instytucjonalnych.

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół, który pozwala na uzyskanie ilości cząsteczek lentiwirusowych wystarczającej do zainfekowania od 1 do 2 milionów pierwotnych komórek erytroidalnych na dowolnym etapie różnicowania. Objętości należy odpowiednio dostosować w zależności od skali procesu. Listę odczynników przedstawiono w Tabelach 4 i 5.

  1. Transfekcja komórek 293T za pomocą fosforanu wapnia.
    1. Na jeden dzień przed transfekcją wysiać 13,2 x 106 komórek 293T w 20 ml pożywki DMEM/High glucose zawierającej 10% FBS oraz Pen/Strep w szalce hodowlanej o średnicy 15 cm. Uwaga: powinno to pozwolić komórkom na osiągnięcie 70% konfluencji w dniu transfekcji. Najlepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu komórek 293T o niskim numerze pasażu (<20).
      Opcjonalnie: szalki można powlec kolagenem typu I lub poli-L-lizyną, aby zwiększyć adhezję komórek 293T.
    2. Na dwie godziny przed transfekcją odessać pożywkę z komórek 293T i delikatnie dodać 20 ml świeżej pożywki podgrzanej do 37°C. Uwaga: zazwyczaj rozpoczynamy transfekcję pod koniec dnia.
    3. W probówce o pojemności 5 ml wymieszać następujące odczynniki:
      • 44,8 μg wektora ekspresyjnego dla interesującego genu (np. shRNA lub GFP – patrz Tabela 4)
      • 13,35 μg wektora otoczki pMD2.G.
      • 33,48 μg wektora pakującego psPAX2.
      • Dodać odpowiednią ilość sterylnej H2O, aby uzyskać objętość 1,116 ml.
    4. Dodać odpowiednią ilość sterylnej H2O, aby uzyskać objętość 1,116 ml.
    5. Dodać 109,8 μl CaCl2 2,5M i wymieszać za pomocą wortexa.
    6. Do probówki stożkowej o pojemności 50 ml dodać 1,116 ml buforu 2xHBS (Tabela 5).
    7. Pod stałym mieszaniem na wortexie dodawać kroplami mieszaninę DNA do buforu 2xHBS.
    8. Pozostawić do utworzenia się osadu w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 min (nie dłużej niż 30 min).
    9. Dodać kroplami roztwór o objętości 2,3 ml do szalki z komórkami 293T, delikatnie zamieszać okrężnie i przenieść komórki do inkubatora 37°C na 12-14 godzin.
    10. Wczesnym rankiem następnego dnia odessać pożywkę i zastąpić ją 20 ml świeżej pożywki podgrzanej do 37°C.
  2. Zbiór i zagęszczanie lentiwirusa
    1. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji zebrać 20 ml pożywki zawierającej lentiwirusa i przelać do probówki stożkowej 50 ml.
    2. Dodać 20 ml podgrzanej do 37°C pożywki do komórek 293T i zwrócić je do inkubatora.
    3. Odwirować supernatant wirusowy przy 450 g przez 10 min, aby usunąć resztki komórkowe, i przelać do nowej probówki 50 ml. Alternatywnie supernatant można przepuścić przez filtr 0,45 μm. Oczyszczony supernatant przechowywać w temperaturze 4°C.
    4. Dwadzieścia cztery godziny później zebrać pozostałe 20 ml pożywki. Uwaga: stwierdziliśmy, że miana wirusa są w obu zbiorach w przybliżeniu zbliżone, tj. 1x 106 TU/ml.
    5. W celu zagęszczenia wirusów supernatanty wirusowe rozdzielić do probówek Beckman OptiSeal (używając 32,4 ml supernatantu na probówkę) i wirować przy 100 000 g przez 1,5 h w temperaturze 4°C przy użyciu rotora z kątem nachylenia (swinging rotor). Uwaga: alternatywne metody zagęszczania supernatantu wirusowego obejmują wirowanie przy 47 000 g przez 2 h lub przy 3 000 g przez 8 h. Nie zamrażać wirusa przed zagęszczaniem. Zamrażanie spowoduje wytrącenie białek, co utrudni resuspensję wirusa.
    6. Bezpośrednio po ultrawirowaniu powoli odessać supernatant za pomocą plastikowej pipety 10 ml i go usunąć. Uwaga: Należy uważać, aby nie naruszyć osadu, który może łatwo oddzielić się od ścianek probówki. Po usunięciu pierwszych 5 ml supernatantu zwykle odcinamy górną część probówki do ultrawirowania, aby pomóc w usunięciu jak największej ilości supernatantu, pozostawiając ok. 100-200 μl pożywki na dnie probówki.
    7. Dodać 100 μl 1xPBS, pozostawić osad do rozpuszczenia w RT przez 30 min i resuspender poprzez 15-20 krotne pipetowanie w górę i w dół. Uwaga: zazwyczaj otrzymujemy ok. 200-300 μl zagęszczonego wirusa.
    8. Zagęszczony preparat lentiwirusa poddać mianowaniu na komórkach NIH3T3 zgodnie z protokołem firmy Invitrogen (Block-it lentiviral RNAi Expression System). Uwaga: zazwyczaj otrzymujemy miana wirusowe od 2 do 10x108 jednostek transdukcyjnych (TU)/ml.
    9. Wirus może być teraz użyty do infekcji (patrz akapit 2) lub podzielony na alykwoaty i przechowywany w -80°C do 6 miesięcy. Uwaga: nie poddawać zawiesin wirusowych więcej niż jednemu cyklowi zamrażania i rozmrażania. Wirusy są stabilne przez 4-5 h w 37°C, 2-3 dni w RT lub jeden tydzień w 4°C.

2. Infekcja lentiwirusowa pierwotnych komórek erytroidalnych w celu dostarczenia genu

  1. Infekcja
    Jądrowe komórki erytroidalne mogą być efektywnie zainfekowane na każdym etapie różnicowania, pod warunkiem zastosowania wysokiej MOI (multiplicity of infection) w zakresie 50-100. W tej części opisujemy typowy eksperyment, w którym do infekcji komórek erytroidalnych w 8. i 9. dniu różnicowania wykorzystuje się lentiwirusy ekspresyjne dla shRNA przeciwko TAL1 lub shRNA kontrolnego (scramble), stosując MOI wynoszącą 50 TU/komórkę. RNA jest ekstrahowane co 24 godziny w celu weryfikacji poziomu wyciszenia (KD) TAL1 za pomocą RT-qPCR. Równolegle mierzy się ekspresję GFP metodą FACS w celu oceny wydajności infekcji (reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 6).
    • Dzień 0:
      1. Przygotować trzy stożkowe probówki o pojemności 15 ml, zawierające każda 1x106 komórek erytroidalnych (tj. jedną probówkę dla wyciszenia TAL1, jedną probówkę dla kontroli negatywnej scramble oraz jedną probówkę dla kontroli ekspresji GFP).
      2. Przemyć komórki 5 ml uzupełnionego medium IMDM zawierającego SCF i EPO (patrz Część I), wirować przy 200 g przez 5 min i usunąć jak najwięcej supernatantu.
      3. Do stężonego roztworu wirusa dodać polybrene (Tabela 4) do stężenia końcowego 40 μg/ml.
      4. Do każdej probówki z komórkami erytroidalnymi dodać 100 μl stężonego wirusa (tj. 5x107 TU) zawierającego polybrene.
      5. Inkubować przez 1 h w inkubatorze w temperaturze 37°C, mieszając przez opukiwanie dnem probówki co 10 min. Uwaga: infekcję należy przeprowadzić w minimalnej ilości medium, aby zapewnić maksymalną adsorpcję lentiwirusa do komórek. Dodatkowo mieszanie co 10 min umożliwia równomierne rozprzestrzenienie wirusa wśród komórek.
      6. Do każdej probówki dodać 900 μl uzupełnionego medium IMDM zawierającego SCF i EPO (Tabele 2 i 3).
      7. Przenieść każdą próbkę do płytki 6-dołkowej i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37°C na 24 h.
    • Dzień 1: Zebrać komórki do oddzielnych probówek 15 ml, wirować przy 200 g przez 5 min, usunąć supernatant i powtórzyć procedurę infekcji (kroki od b do g powyżej).
    • Dzień 2: Przemyć komórki i resuspenderować je w stężeniu 0,2x106 komórek/ml w uzupełnionym medium IMDM zawierającym SCF i EPO, a następnie postępować zgodnie z opisem w Części I.
  2. Reprezentatywne wyniki
    Rysunek 6A przedstawia protokół infekcji pierwotnych komórek erytroidalnych lentiwirusem, a następnie ekstrakcję RNA. W jednym z eksperymentów zainfekowano komórki erytroidalne lentiwirusem produkującym shRNA skierowane przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu TAL1 lub kontrolny shRNA scramble 11. Rysunek 6B pokazuje, że udało się wyciszyć 75% transkryptów TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Należy również zwrócić uwagę na wzrost poziomu transkryptu TAL1 od 9. do 12. dnia w kontroli scramble, co podkreśla znaczenie tego czynnika transkrypcyjnego podczas różnicowania erytroidalnego. W innym eksperymencie zainfekowano komórki erytroidalne lentiwirusem ekspresyjnym dla białka GFP. Rysunek 6C pokazuje, że trzy dni po infekcji większość komórek erytroidalnych (87%) wykazuje ekspresję GFP, co zmierzono za pomocą fluorescencji pod mikroskopem oraz metodą FACS. Wskazuje to na wysoką wydajność infekcji w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wcześniej zainfekowano komórki CD34+ w Dniu 0 z podobną wydajnością (dane nie zostały przedstawione). Najważniejszym parametrem dla efektywnej transdukcji komórek pierwotnych jest zastosowanie wysokiej MOI (tj. stężonych lentiwirusów). W przypadku zastosowania niskiej MOI (tj. niewystężonego wirusa) wydajność transdukcji ulegnie zmniejszeniu.

3. Reprezentatywne wyniki

Schemat pozytywnej izolacji komórek HSC CD34+; separacja immunomagnetyczna, erytroidalne różnicowanie bezsurowicze.
Rycina 1. Schemat protokołu izolacji i ex vivo różnicowania erytroidalnego ludzkich pierwotnych komórek macierzystych i progenitorowych krwi. (Krok 1) Komórki CD34+ (czystość 95 ± 3%) są izolowane z krwi pępowinowej, szpiku kostnego lub ludzkiej krwi obwodowej zmobilizowanej G-CSF (leukafereza) przy użyciu pozytywnej selekcji immunomagnetycznej. (Krok 2) Komórki CD34+ są hodowane w kulturze płynnej zgodnie z wskazanym czteroetapowym protokołem.

Wykres amplifikacji komórek; skala logarytmiczna; dni hodowli w stosunku do analizy trendu wzrostu komórek.
Rycina 2. Amplifikacja komórek podczas protokołu różnicowania erytroidalnego ex vivo. Wyniki przedstawiono w skali logarytmicznej. Reprezentatywne wyniki otrzymane z komórek CD34+ wyizolowanych z leukaferezy.

Schemat etapów erytropoezy, obrazy mikroskopowe śledzące rozwój RBC w ciągu 26 dni.
Rycina 3. Analiza morfologiczna komórek podczas różnicowania erytroidalnego ex vivo. Komórki barwiono odczynnikiem May-Grünwalda-Giemsy w określonych punktach czasowych podczas różnicowania (powiększenie x 40). HSC: hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe; BFU-E: jednostki tworzące wybuchy – erytroidalne; CFU-E: jednostki tworzące kolonie – erytroidalne; Pro EB: proerytroblasty; Baso EB: erytroblasty bazofilne; Poly EB: erytroblasty polichromatofilne; Ortho EB: erytroblasty ortochromatyczne; RET: retikulocyty; RBC: czerwone krwinki.

Wykres testu w podłożu półstałym; wzrost progenitorów CFU-GM, BFU-E, CFU-E; dni hodowli komórkowej; porównanie obrazów.
Rycina 4. Testy tworzenia kolonii (CFC) w celu wykrycia i ilościowego oznaczenia progenitorów krwiotwórczych. W zaznaczonych punktach czasowych 104 komórek wysiano w półstałym podłożu metylocelulozowym w obecności rekombinowanych ludzkich cytokin: rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO, aby zapewnić optymalny wzrost progenitorów erytroidalnych (BFU-E i CFU-E) oraz progenitorów granulocytowo-makrofagicznych (CFU-GM). BFU: burst forming units; CFU: colony forming units. Przedstawiono również typowe obrazy BFU-E i CFU-E. Należy zwrócić uwagę na czerwono-brązowy kolor wynikający z hemoglobinizacji BFU-E i CFU-E.

Wykresy różnicowania hematopoetycznego pokazujące markery komórkowe CD34, CD36, CD71, GPA, benzydynę i LDS w czasie.
Rycina 5. Kinetyka markerów hematopoetycznych/erytroidalnych podczas różnicowania erytroidalnego ex vivo. W zaznaczonych punktach czasowych pobrano 2x105 komórek i przeanalizowano ekspresję wskazanych markerów za pomocą FACS (CD34, CD36, CD71, GPA i LDS) lub mikroskopii (benzydyna). Słupki reprezentują odsetki komórek pozytywnych. CD34: transbłonowa glikoproteina, obecna na ludzkich komórkach macierzystych/progenitorowych układu krwiotwórczego; CD36: receptor trombospondyny, obecny na komórkach progenitorowych; CD71: receptor transferyny, obecny na progenitorach erytroidalnych i retikulocytach; GPA: glikoforyna A, obecna na prekursorach erytroidalnych i erytrocytach; Benzydyna: barwienie hemoglobiny; LDS: laser dye styryl, barwnik DNA.

Oś czasu infekcji lentiwirusowym shRNA, wykres słupkowy ekspresji mRNA TAL1, mikroskopia GFP, cytometria przepływowa.
Rysunek 6. Lentiwirusowy transfer genów w ludzkich pierwotnych proerytroblastach. (A) Oś czasu indukcji wyciszenia genu TAL1 (KD) w pierwotnych proerytroblastach z wykorzystaniem lentiwirusowego systemu dostarczania genów. (B) Wyciszenie TAL1 zostało przeprowadzone za pomocą dostarczonego przez lentiwirusa shRNA anty-Tal1 (TAL1 KD) lub kontrolnego shRNA o losowej sekwencji (Scr). Kinetykę poziomu transkryptu mRNA TAL1 zmierzono metodą RT-qPCR. Ekspresję transkryptu TAL1 określono względem 18S RNA. (C) Dostarczenie GFP za pomocą lentiwirusa zweryfikowano za pomocą mikroskopii (panel lewy) lub FACS (panel prawy). GFP wykazano w 87% komórek.

4. Materiały

OdczynnikŹródłoNumer katalogowy
RPMI 1640 SigmaR8758
Kolagenaza BRoche Applied Science11088807001
DNaza ISigmaD5025-15KU
Filtry do wstępnej separacji (siatka nylonowa 30μm)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
Bufor do lizy erytrocytów EasySep 10xStemCell Technologies20120
Zestaw MicroBead CD34Miltenyi Biotec Inc130-046-703
Kolumny LS Mini-MacsMiltenyi Biotec Inc130-042-401
Bufor roboczy autoMACS – bufor do separacji MACSMiltenyi Biotec Inc130-091-221
Separator MiniMACSMiltenyi Biotec Inc130-042-102
Stromalne komórki szpiku kostnego myszy MS-5 (regularnie badać pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmami)DSMZACC 441
Roztwór błękitu trypanu (0.4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Trypsyna 0.05%/EDTAThermoScientific J101521
Barwnik May-Grünwalda Giemsy Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Testy Methocult CFC (kolonii tworzących komórki) dla komórek ludzkich StemCell Technologies 04044

Tabela 1.

SkładnikRoztwór stokowyObjętość 600 ml
IMDMSigma I3390443.4 ml
Pen/Strept 1% (obj/obj)Gibco 103786ml
L-glutamina 4x10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
Inozytol 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
przygotowanie: Rozpuścić 28 mg proszku w 7 ml IMDM i wysterylizować przez filtr – stabilny przez 1 tydzień w 4°C.		6ml
Kwas foliowy 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
przygotowanie: Rozpuścić 7 mg proszku w 7 ml ogrzanego wstępnie IMDM i wysterylizować przez filtr – stabilny przez 1 tydzień w 4°C. Ogrzać wstępnie przed użyciem.		6ml
Monotioglicerol 1.6x10-4M0.16M (Sigma M6145)
przygotowanie: Rozpuścić 10 μl roztworu stokowego 11.56M w 712 μl IMDM i wysterylizować przez filtr – stabilny przez 1 tydzień w 4°C.		0.6ml
Azotan żelaza(II) 90 ng/ml18μg/ml (Sigma 8508)
przygotowanie: Rozpuścić 1.8 mg w 1ml wody destylowanej. Odmierzyć 0.1 ml, dodać 9.9 ml IMDM i wysterylizować przez filtr – stabilny przez 1 tydzień w 4°C.		3ml
Siarczan żelaza(II) 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
przygotowanie: Rozpuścić 18 mg w 1ml wody destylowanej. Odmierzyć 0.1 ml, dodać 9.9 ml IMDM i wysterylizować przez filtr – stabilny przez 1 tydzień w 4°C.		3ml
Seryjna albumina wołowa-insulina-transferyna (BIT)
20% (obj/obj)		StemCell Technologies 9500120 ml

Tabela 2.

SkładnikRoztwór stokowyObjętość do dodania do 100 ml uzupełnionego IMDM (Tabela 2)
Hydrokortyzon (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
przygotowanie: Rozpuścić 5mg proszku w 1,03ml IMDM. Odjąć 0,1 ml, dodać 9,9 ml IMDM i wysterylizować przez filtrację. Stabilny przez 1 tydzień w 4°C. 		1ml
Stem Cell Factor (SCF) 100ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
przygotowanie: Rozpuścić 50 μg proszku w 500 μl PBS+0,1% BSA i wysterylizować przez filtrację. Przygotować alikwoty po 100 μl i przechowywać w -20°C.		100 μl
Erytropoetyna (EPO) 3 IU/ml100 μg/ml równoważne 12 000UI/ml (Feldan FB03-10-290)
przygotowanie: Rozpuścić 50 μg proszku w 500 ml PBS+0,1% BSA i wysterylizować przez filtrację. Przygotować alikwoty po 25 ml i przechowywać w -20°C.		25 μl
Interleukina 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
przygotowanie: Rozpuścić 10 μg proszku w 100 μl PBS+0,1% BSA i wysterylizować przez filtrację. Przygotować alikwoty po 5 ml i przechowywać w -20°C.		5 μl

Tabela 3.

OdczynnikŹródłoReferencja
komórki 293T
(regularnie testować pod kątem kontaminacji mycoplasmapą) 		ATCCCRL-11268
DMEM/High GlucoseThermoScientificSH30243.01
bromek heksadymetryny (Polybrene)SigmaH9268-5G
probówki do ultrawirówki OptiSealBeckman Coulter361625
plazmid psPAX2Addgene (laboratorium D. Trono)12260
plazmid pMD2.GAddgene (laboratorium D. Trono)12259
plazmid pBLOCK-it6-DEST (shTal1)sekwencja shRNA Tal1 sklonowana do plazmidu pBLOCK-it6-DEST z InvitrogenPalii et al. EMBO J.
plazmid pBLOCK-it6-DEST (shScr)przemieszana (scrambled) sekwencja shRNA sklonowana do plazmidu pBLOCK-it6-DEST z InvitrogenPalii et al. EMBO J.
plazmid pWPIAddgene (laboratorium D. Trono)12254

Tabela 4.

BuforPrzygotowanieStężenie końcowe
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O)
  • Dodać wodę Milli-Q.
  • Dostosować pH do dokładnie 7.11-7.13 poprzez dodanie roztworu NaOH, a następnie uzupełnić wodą Milli-Q do 100 ml.
  • Precyzyjnie ustawić pH na 7.11-7.13.
  • Przefiltrować sterylizująco, rozdzielić na aliquoty po 10 ml i przechowywać w -200C
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g bezwodnego CaCl2
  • Rozpuścić w 10 ml wody Milli-Q.
  • Przefiltrować sterylizująco, rozdzielić na aliquoty po 1 ml i przechowywać w -20°C
  • 2.5M
MS30
  • 25ml [2M] Tris pH8.0
  • 5ml [0.5M] EDTA
  • 300ml glicerolu
  • 50mM
  • 2.5mM
  • 30% (v/v)

Tabela 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wcześniej stosowano szereg metod różnicowania komórek erytroidalnych w kulturze z różnym stopniem powodzenia. Na przykład niektóre protokoły bez kokultury na komórkach MS-5 umożliwiają ekspansję komórek erytroidalnych, lecz nie są wydajne w produkcji w pełni dojrzałych, beżądrowych erytrocytów 12-17. Z kolei inne metody pozwalają na wydajną enukleację, jednak dzieje się to kosztem proliferacji 18,19. Metoda zastosowana w niniejszej pracy, opracowana pierwotnie w laboratorium Douay 6, łącz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy L. Douay i M.C Giarratana (Université Paris VI, Francja) za wskazówki dotyczące różnicowania erytroidalnego ex vivo, D. Allan i H. Atkins (OHRI, Kanada) za dostarczenie próbek krwi (uzyskanych na podstawie decyzji Ottawa Hospital Research Ethics Board nr 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) za dostarczenie wektorów lentiwirusowych oraz F.J. Dilworth (OHRI, Kanada) za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Projekt ten był finansowany z grantu CIHR (MOP-82813) przyznanego M.B. C.G. P. jest laureatem stypendium podoktorskiego Ontario Research Fund Computational Regulomics Training Postdoctoral Fellowship. M.B. piastuje stanowisko Canada Research Chair w zakresie regulacji ekspresji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

  1. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
  8. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
  16. Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja komórek CD34-dodatnichkokultura z komórkami stromalnymiprotokół infekcji lentiwirusemanaliza ekspresji GFPwalidacja wyciszenia genów metodą RT-qPCRczynnik transkrypcyjny TAL1protokół różnicowania erytroidalnego
Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.