Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Podsumowanie

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Streszczenie

W trakcie przerzutowania komórki nowotworowe odrywają się od guza pierwotnego, naciekają sąsiednie tkanki i rozprzestrzeniają się do odległych narządów. Przerzutowanie jest złożonym procesem, który może angażować wiele typów tkanek, trwać w zmiennych przedziałach czasowych i często zachodzić głęboko w narządach, co utrudnia jego badanie i kwantyfikację. Ponadto na skuteczność procesu przerzutowania wpływa wiele etapów kaskady przerzutniczej, co utrudnia ocenę wkładu pojedynczego aspektu zachowania komórek nowotworowych. W konsekwencji testy przerzutowania są często przeprowadzane na zwierzętach doświadczalnych, aby zapewnić niezbędny, realistyczny kontekst do badania tego zjawiska. Niestety, modele te są dodatkowo komplikowane przez złożoną fizjologię organizmów. Zarodek piszczaka jest unikalnym modelem in vivo, który pokonuje wiele ograniczeń w badaniu przerzutowania dzięki dostępności błony chorioallantoicznej (CAM) – dobrze unaczynionej tkanki pozazarodkowej znajdującej się pod skorupą jaja, która jest podatna na ksenoprzeszczepy komórek nowotworowych (rycina 1). Co więcej, ponieważ zarodek piszczaka jest naturalnie immunodeficientny, CAM łatwo wspomaga przyjmowanie zarówno tkanek prawidłowych, jak i nowotworowych. Co najważniejsze, ptasia błona CAM pomyślnie wspiera większość cech komórek rakowych, w tym wzrost, inwazję, angiogenezę oraz przebudowę mikrośrodowiska. Dzięki temu model ten jest wyjątkowo użyteczny w badaniu szlaków prowadzących do przerzutowania nowotworów oraz w przewidywaniu odpowiedzi przerzutowego raka na nowe potencjalne terapie. Wykrywanie rozproszonych komórek za pomocą gatunkowo specyficznej metody Alu PCR umożliwia ilościową ocenę przerzutowania w narządach skolonizowanych przez zaledwie 25 komórek. Wykorzystując linię komórkową raka naskórkowego człowieka (HEp3), używamy tego modelu do analizy spontanicznych przerzutów komórek nowotworowych do odległych narządów, w tym do wątroby i płuc piszczaka. Ponadto, stosując protokół Alu-PCR, demonstrujemy czułość i powtarzalność tej metody jako narzędzia do analizy i kwantyfikacji intrawazacji, zatrzymania, ekstrawazacji oraz kolonizacji jako poszczególnych elementów przerzutowania.

Protokół

1. Przygotowanie jaj do ksenoprzeszczepu (przerzutów samoistnych)

1. Świeżo zniesione zapłodnione jaja kurze inkubuje się w inkubatorze obrotowym przez 10 dni w temperaturze 10°F i przy 60% wilgotności. Jaja są obracane cztery razy w każdej godzinie.
2. W 10. dniu rozwoju jaja umieszcza się bokiem w stojaku do jaj. Do prześwietlania jaj (kandowania) wykorzystuje się lampę z gęsim szyją lub inne odpowiednie źródło światła, kierując strumień światła przez skorupkę w tępy koniec jaja, gdzie znajduje się komora powietrzna.
3. Lokalizuje się i zaznacza żyłę chorioallantoiczną. Żyła ta znajduje się w górnej części skorupki jaja, w miejscu złączenia kilku dużych naczyń krwionośnych. W tym punkcie rozgałęzienia naczynie krwionośne opada w dół, oddalając się od CAM i przyłączając do zarodka. Ołówkiem rysuje się na skorupce jaja kwadrat o boku 1 cm, w odległości około 1 cm od punktu rozgałęzienia żyły. Obszar obejmujący kwadrat i jego okolice oczyszcza się za pomocą patyczka bawełnianego nasączonego jodyną.
4. Za pomocą obrotowego narzędzia tnącego (Dremel) z zamontowanym kamieniem szlifierskim z węglika krzemu (Dremel część nr 8492) wierci się otwór przez tępy koniec jaja do komory powietrznej. Tym samym narzędziem wierci się otwór wewnątrz wcześniej narysowanego kwadratu na górze jaja, zatrzymując się przed błoną skorupki. Do wykonania małego otworu w błonie skorupki używa się igły strzykawki o rozmiarze 25-gauge z delikatnym zadziorem na końcu, uważając, aby nie przerwać znajdującej się poniżej CAM. Następnie, w obszarze kwadratu, CAM oddziela się od błony skorupki, wykorzystując delikatne ssanie wytworzone za pomocą automatycznego pipetora z zamontowanym kawałkiem rurki Tygon o średnicy ¼”, przyłożonej do otworu w komorze powietrznej. Po zastosowaniu ssania pod otworem w kwadracie powinna powstać kieszeń powietrzna, co oznacza, że CAM została pomyślnie oddzielona od skorupki. Po oddzieleniu CAM otwór w komorze powietrznej oraz otwór w kwadracie w pobliżu żyły chorioallantoicznej uszczelnia się kawałkiem taśmy laboratoryjnej. Następnie jaja umieszcza się w inkubatorze stacjonarnym w temperaturze 10°F i przy 60% wilgotności w oczekiwaniu na przeszczepienie komórek nowotworowych. Kolejność czynności przedstawiono na rysunku 1.

2. Przygotowanie jaj do wstrzyknięcia dożylnego (metastaza eksperymentalna)

1. Świeżo zniesione zapłodnione jaja kurze inkubuje się w inkubatorze obrotowym przez 12 dni w temperaturze 10°F i wilgotności 60%. Jaja są obracane cztery razy w każdej godzinie.
2. W 12. dniu rozwoju jaja umieszcza się na boku w stojaku do jaj. Do prześwietlania jaj (kandlowania) wykorzystuje się lampę z gąsiej szyją lub inne odpowiednie źródło światła, kierując strumień światła przez skorupkę jaja w jego tępym końcu, gdzie znajduje się komora powietrzna.
3. Lokalizuje się i zaznacza żyłę chorioallantoiczną. Na skorupce jaja, bezpośrednio nad żyłą, rysuje się ołówkiem prostokąt o wymiarach 1 cm na 0,5 cm. Obszar wewnątrz i wokół kwadratu oczyszcza się za pomocą patyczka higienicznego nasączonego jodyną.
4. W zaznaczonym miejscu w skorupce jaja wykonuje się małe okno za pomocą wiertła Dremmel (#18). Fragment skorupki usuwa się, aby odsłonić leżącą pod nim błonę skorupową, którą następnie czyni się przezroczystą za pomocą kropli oleju mineralnego. Graficzne przedstawienie znajduje się na rysunku 5A.
5. W tym momencie otwór w komorze powietrznej oraz otwór w kwadracie w pobliżu żyły chorioallantoicznej uszczelnia się kawałkiem taśmy laboratoryjnej. Następnie jaja umieszcza się w inkubatorze stacjonarnym w temperaturze 10°F i wilgotności 60% w oczekiwaniu na wstrzyknięcie komórek nowotworowych.

3. Przygotowanie komórek nowotworowych do przeszczepienia lub wstrzyknięcia.

1. W przypadku ksenoprzeszczepu komórki nowotworowe są odrywane od naczyń hodowlanych przy użyciu Trypsyny/EDTA i przemywane 10 objętościami soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby usunąć pozostałości pożywki, Trypsyny lub EDTA.
2. W przypadku wstrzykiwania dożylnego (I.V.), hodowane komórki są odrywane przy użyciu nieenzymatycznego roztworu do dysocjacji komórek i przemywane pożywką DMEM bez surowicy.
3. Komórki są liczone za pomocą hemacytometru i resuspenderowane w PBS w stężeniu 10-40 milionów komórek/ml w celu przeszczepienia lub alternatywnie resuspenderowane w pożywce DMEM bez surowicy w stężeniu 1 milion komórek/ml w celu wstrzyknięcia dożylnego (I.V.).

4. Przeszczepianie komórek nowotworowych na nowo odsłoniętą błonę chalazy (CAM) (Przerzuty spontaniczne)

1. Jaja wyjmuje się z inkubatora i w miejscu wcześniej narysowanego kwadratu, gdzie utworzyła się nowa komora powietrzna, wycina się małe okienko. Najłatwiej wykonać to za pomocą narzędzia rotacyjnego z tarczą tnącą (narzędzie Dremel z okrągłą tarczą tnącą nr #409). Do usunięcia niewielkiego fragmentu skorupy jaja i odsłonięcia znajdującej się pod nią błony chrzęstno-płucnej (CAM) używa się pęsety z wąskimi końcami.
2. Za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem (Fisher Brand #23-40-01) błonę CAM ściera się 5 razy. Na bawełnie powinna pojawić się niewielka ilość krwi. Natychmiast po uszkodzeniu błony CAM, na uszkodzony obszar nanosi się 25μl zawiesiny komórkowej. Optymalna liczba komórek jest ustalana empirycznie, lecz może wynosić od 0.5X10⁵ do 1X10⁶. Okienko w jajie szczelnie zakleja się taśmą, a jaja pozostawia się w pozycji pionowej przez 10-15 minut, aby umożliwić osiadanie komórek. Po 15 minutach jaja umieszcza się ponownie w inkubatorze stacjonarnym.
3. Guzy pozostawia się do wzrostu przez 5-8 dni, w zależności od konkretnego zastosowania i charakteru użytej linii komórek nowotworowych. Schematyczną prezentację przedstawiono na rysunku 1.

5. Dożylne wstrzyknięcie komórek nowotworowych (metastaza eksperymentalna)

1. Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 30 G wżewiono 10μl zawiesiny komórek do żyły alantoicznej każdego zarodka, a następnie jaja zwrócono do inkubatora stacjonarnego, gdzie pozostały przez kolejne 1–7 dni.
>
2. W określonych punktach czasowych z każdego zarodka pobrano płuco lub dolną część błony CAM i poddano je obróbce w celu wykrycia komórek nowotworowych, zgodnie z poniższym opisem.

6. Pobieranie guzów i tkanek kurcząt

1. Przygotowuje się obszar do sekcji. Analiza wykrywa komórki przerzutowe poprzez ilościowe oznaczenie ludzkiego DNA przy użyciu wysoce czułej metody PCR. Dlatego bardzo ważne jest zapobieganie kontaminacji egzogennym DNA. Sekcje wykonuje się w wydzielonym obszarze, a narzędzia są czyszczone pomiędzy każdym zwierzęciem. Aby zapobiec kontaminacji krzyżowej próbek podczas procesu sekcji, stosuje się 3 oddzielne zestawy narzędzi: jeden zestaw do rozcinania jaja, jeden zestaw do usuwania guza pierwotnego i jeden zestaw do usuwania narządów wewnętrznych. Ponadto stosuje się cztery pojemniki do płukania w celu sekwencyjnego oczyszczania narzędzi między zwierzętami. Płukany są one kolejno w: 1) wodzie dwukrotnie destylowanej, 2) wodzie dwukrotnie destylowanej, 3) podchlorynie sodu i 4) 70% etanolu.
2. Jaja wyjmuje się z inkubatora stacjonarnego i umieszcza na lodzie na 15 minut w celu znieczulenia i uśmiercenia zwierząt. Otwiera się okna w skorupce tak, aby guzy stały się widoczne. Może być konieczne powiększenie okien poprzez usunięcie części skorupy jaja. Guzy pierwotne są wycinane z CAM, ważone i przekazywane do badania histologicznego.
3. Pisklę wyjmuje się ze skorupki jaja, rozcinając ją promieniście na równe połowy. Zarodek zostaje przelany z rozciętej skorupki i przeniesiony stroną grzbietową do góry do czystej łódki wagowej. Zwierzę jest sekcjonowane przy użyciu świeżego, czystego zestawu narzędzi. Zwierzę otwiera się, przecinając mostek. Po otwarciu zarodka pobiera się fragment wątroby z prawego lub lewego płata. Następnie usuwa się narządy wewnętrzne, delikatnie pociągając za przełyk przyczepiony do żołądka mięśniowego i przecinając więzadła łączące narządy. Aby pobrać płuca, otwiera się klatkę piersiową, oddziela płytkę mostka i usuwa serce. W tym momencie można wyciąć płuca z czterech stron (górnej najbliżej głowy, lewej wzdłuż klatki piersiowej, dolnej w pobliżu przepony i prawej wzdłuż tchawicy). Dla zapewnienia spójności w każdym zwierzęciu pobiera się to samo płuco. Pobrane próbki tkanek przechowuje się w temperaturze -20°C do późniejszego użycia lub można je bezzwłocznie poddać izolacji DNA.

7. Izolacja genomowego DNA i analiza ilościową PCR

1. DNA genomowe jest ekstrahowane z tkanek przy użyciu zestawu Sybr Green Extract–N-Amp Tissue PCR Kit (Sigma-Aldrich nr katalogowy XNATRG). Wyekstrahowany DNA można przenieść do czystej probówki typu Eppendorf i przechowywać w temperaturze -20°C lub zużyć niezwłocznie. Przed zastosowaniem w kolejnej reakcji PCR ważne jest rozcieńczenie DNA w stosunku 1:50 w wodzie wolnej od nukleaz. Alternatywnie DNA można ekstrahować, stosując dowolny standardowy protokół ekstrakcji DNA (Zijlstra et al., 202).
2. Ludzki DNA jest wykrywany w tkankach kurczaka za pomocą ilościowego PCR specyficznego dla ludzkich sekwencji Alu. qPCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla Alu przeprowadza się z wykorzystaniem amplifikacji SYBR green z zestawu Extract-N-Amp. Zestaw do PCR zawiera 2x mieszaninę reakcyjną zawierającą SYBR green, bufor, sole, dNTP, polimerazę Taq oraz przeciwciało Jumpstart Taq. Mieszaninę reakcyjną przygotowuje się do końcowej objętości 15μl, z zastosowaniem 0,4μM każdego startera. W większości przypadków zastosowanie wyekstrahowanego DNA rozcieńczonego 1:50 dostarczy danych ilościowych, jednak optymalna ilość DNA matrycowego może wymagać optymalizacji empirycznej. Startery do GAPDH kurczaka są wykorzystywane jako kontrola wewnętrzna. PCR dla sekwencji Alu przeprowadzany jest w następujących warunkach: aktywacja polimerazy w 95°C przez 2 min, a następnie 30 cykli: 95°C przez 30 s, 63°C przez 30 s i 72°C przez 30 s. Warunki reakcji dla GAPDH kurczaka są identyczne z opisanymi dla Alu, jednak konieczne może być wydłużenie PCR do 40 cykli.
3. Ilościowa analiza przerzutowania jest przeprowadzana metodą ΔΔCt poprzez porównanie grup eksperymentalnych z grupą kontrolną (Schmittgen and Livak, 2008; Zijlstra et al., 202). Alternatywnie można wygenerować krzywą wzorcową, stosując szereg rozcieńczeń ludzkich komórek nowotworowych wyekstrahowanych za pomocą zestawu Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 202). Istotność statystyczną ocenia się za pomocą testu t Studenta lub analizy ANOVA dla grup kontrolnych i eksperymentalnych.

8. Reprezentatywne wyniki:

Rys. 1. Model przerzutów w zarodku kurzym. A) Schemat składający się z czterech paneli, ilustrujący wygląd modelu w przekroju na kluczowych etapach: 1. Po 10 dniach inkubacji. Błona chalazowa (CAM) osiągnęła rozmiar bliski maksymalnemu. Tętnice i żyły są wyraźnie widoczne, a żyła alantoiczna jest ułożona przy górnej części jaja. 2. Jajo bezpośrednio po wykonaniu dwóch otworów w skorupce: jednego w komorze powietrznej, a drugiego w pobliżu punktu przyczepu żyły alantoicznej. 3. Wygląd po zastosowaniu lekkiej próżni w celu opróżnienia komory powietrznej i opuszczenia błony CAM. Komórki nowotworowe (kolor niebieski) zostają naniesione na opuszczoną błonę CAM. 4. Po umożliwieniu wzrostu wszczepionych komórek nowotworowych, guz wraz z tkankami zarodka kurczego zostaje pobrany do analizy. B) Schematyczna przedstawienie modelu: 1. Inkubacja jaj. 2. Wyznaczenie lokalizacji żyły alantoicznej. 3. Wywiercenie otworów w skorupce jaja. 4. Odsłonięcie błony CAM. 5. Wycięcie otworu do przeszczepienia komórek nowotworowych. 6. Aplikacja komórek nowotworowych. 7. Chłodzenie jaj na lodzie przed pobraniem tkanki. 8. Pobranie guza po 7 dniach wzrostu.

Rycina 2. Histologia guzów CAM. Tkanki pobrane z błony kosmowo-owocniowej z przerostem guza utrwalono w formalinie, pocięto i poddano barwieniu trójskładnikowemu. A) Guz HEp3 po siedmiu dniach wzrostu na CAM. B i C przedstawiają powiększone obszary z obrazu A, ukazujące zarówno guz, jak i zręb. D) Prawidłowa błona CAM.

Rycina 3. Ilościowa analiza podłużna przerzutówWarianty linii komórkowej raka głowy i szyi HEp3 o wysokim lub niskim potencjale przerzutowym (odpowiednio HEp3 M(High) i HEp3 M(Low)) przeanalizowano pod kątem zdolności do rozsiewania za pomocą metody Alu PCR. W każdym punkcie czasowym w ciągu 7 dni analizowano dziesięć zwierząt. Próbki te skwantyfikowano w odniesieniu do krzywej wzorcowej, a następnie wyrażono jako liczbę komórek na 50 mg tkanki.

Rycina 4. Hamowanie spontanicznej przerzutowości komórek u zwierząt leczonych przeciwciałem 1A5 hamującym przerzutowanieGuzy utworzono przy użyciu 5x10⁵ Komórki HEp3 naniesiono na błonę żółtkową (CAM) zarodków w 10. dniu inkubacji. Trzy dni po naniesieniu komórek nowotworowych połowę zwierząt poddano leczeniu przeciwciałem anty-CD151 1A5. Płuca zwierząt z nowotworem pobrano dwa dni później i poddano ilościowej analizie qPCR dla sekwencji alu. W przeciwieństwie do tego, ilościowe qPCR dla chGAPDH wykorzystano w celu potwierdzenia obecności równoważnych ilości genomowego DNA gospodarza. Do ilościowego porównania obu grup zastosowano metodę ΔΔCt (B).

Rycina 5. Ocena zatrzymania, wzrostu i intrawazacji w kaskadzie przerzutniczejZasadniczo przerzut do narządu wtórnego jest definiowany przez wpływ trzech aspektów: zatrzymania, szybkości wzrostu oraz szybkości intrawasacji. Można je określić ilościowo, wykorzystując kombinację przerzutów eksperymentalnych (A) i przerzutów spontanicznych (B). W przypadku przerzutów eksperymentalnych (A) zatrzymanie definiuje się jako liczbę komórek wykrytych 2 godziny po iniekcji. Przeżywalność i wzrost zatrzymanych komórek określa się jako zmianę liczby komórek 24 godziny po iniekcji. Wzrost definiuje się jako tempo proliferacji w dniach 3–7. Intrawasację określa się za pomocą przerzutów spontanicznych (B), gdzie liczba komórek, które uległy intrawasacji, jest definiowana jako obciążenie przerzutowe obecne w 7. dniu, które przekracza wartość przewidzianą na podstawie wzrostu obciążenia przerzutowego obecnego w 6. dniu.

Rysunek 6. Wizualizacja rozprzestrzeniania się przerzutów w błonie chalazowej (CAM)Komórki HEp3 wykazujące ekspresję GFP wstrzyknięto dożylnie w 12. dniu rozwoju. W 1., 3. i 5. dobie poświęcono zarodek i wykonano obrazowanie fragmentu błony chalazowej (CAM) przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Ciemnozielone tło jest wynikiem obecności skorupy jaja, unaczynienie jest widoczne jako czarne linie, a komórki nowotworowe jako jasnozielone punkty.

Dyskusja

Błona chorioallantoiczna (CAM) kurczęcia jest od dziesięcioleci wykorzystywana jako modelowy system do badania różnych aspektów biologii nowotworów i progresji przerzutowej. Główne oceny zdolności do tworzenia przerzutów w tym modelu były przeprowadzane przez wiele grup badawczych, obejmując analizę stanu uśpienia (Aguirre Ghiso et al., 1999; Ossowski and Reich, 1983), przebudowy tkanek (Deryugina et al., 2005; Hahn-Dantona et al., 1999) oraz przerzutowania (Zijlstra et al., 2008; Zijl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1X Dulbecco’pożywka DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Invitrogen	11995073
Dulbecco’roztwór soli fosforanowo-buforowej (D-PBS) (1X), ciecz	Invitrogen	14190250	pH 7,4
Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, roztwór	Invitrogen	25300054
Inkubator Sportsman	Berry Hill	1550HA	Inkubatory te należą do najłatwiej dostępnych. Jednakże w materiale wideo zaprezentowano inny sprzęt.
Inkubator dla sportowców	Berry Hill	1502EA	Inkubatory te należą do najpowszechniej dostępnych. W materiale wideo zaprezentowane zostanie jednak inne wyposażenie.
narzędzie rotacyjne Dremel	Dremel
tarcze odcinające Dremel nr 36	Dremel	409
Przenośny pipetator elektroniczny	Fisher Scientific	1368115E
Patyczki z bawełnianym końcem	Fisher Scientific	23-400-001)
Zapłodnione jaja	Różnorodne		Można korzystać z produktów wielu różnych dostawców. Jaja powinny ważyć około 35–55 g. Kury, które je znoszą, powinny być w wieku od 36 do 55 tygodni.
Komora Licznikowa (Hemocytometr)	Hausser Scientific	15170-090
Iluminator światłowodowy do mikroskopu	Amscope	HL250-AY	150 W
igła 25 G
Ekstrakt Sybr Green—Zestaw do PCR z tkanek N-Amp	Sigma-Aldrich	XNATRG