Transdukcja komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w kompleksie z polimerem w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Podsumowanie

Lentiwirusy są cennym narzędziem badawczym w analizie funkcji genów; jednak badacze mogą chcieć uniknąć produkcji pantropowych lentiwirusów kodujących znane lub podejrzewane onkogeny. Jako alternatywę przedstawiamy bezpieczniejszy protokół wykorzystania ektropowych lentiwirusów w komórkach ludzkich zmodyfikowanych w celu ekspresji ektropowego receptora mSlc7a1.

Streszczenie

Badania nad biologią komórek macierzystych i komórek nowotworowych często wymagają transdukcji wirusowej ludzkich komórek za pomocą znanych lub podejrzewanych onkogenów, co budzi poważne kwestie bezpieczeństwa personelu laboratoryjnego. Lentiwirusy pantropowe, takie jak powszechnie stosowany pseudotyp VSV-G, stanowią cenne narzędzie do badania funkcji genów, ponieważ mogą transdukować wiele typów komórek, w tym komórki niedzielące się. Jednak badacze mogą chcieć uniknąć produkcji i wirowania wirusów pantropowych kodujących onkogeny ze względu na wymogi dotyczące wyższego poziomu bezpieczeństwa biologicznego oraz kwestie bezpieczeństwa. Znane jest, że kilka silnych onkogenów, w tym c-Myc oraz duży antygen T SV40, zwiększa wydajność produkcji indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wszystkie pozostałe znane zmiany genetyczne indukujące iPSC (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 oraz utrata funkcji p53) są również powiązane z nowotworami, co sprawia, że one także budzą stosunkowo wysoki niepokój w kwestii bezpieczeństwa.

Choć wirusy związane z nowotworami są przydatne w badaniu przeprogramowania komórkowego i pluripotencji, muszą być one używane w sposób bezpieczny. Aby rozwiązać te problemy z biobezpieczeństwem, prezentujemy metodę transdukcji ludzkich komórek ekotropowym lentiwirusem, kładąc dodatkowy nacisk na obniżenie kosztów i wygodę obsługi. Wyprodukowaliśmy ekotropowego lentiwirusa o wystarczająco wysokim mianie, aby przetransdukować ponad 90% ludzkich komórek wykazujących ekspresję receptora i narażonych na działanie wirusa, co potwierdza skuteczność tego podejścia.

Lentiwirusy są często zagęszczane poprzez ultrawirowanie, jednak proces ten trwa kilka godzin i może prowadzić do powstania aerozoli zakaźnych dla pracowników laboratoriów biomedycznych. Alternatywnie cząstki wirusowe można bezpieczniej osadzać na komórkach poprzez kompleksowanie z chondroitynosiarczanem i polybrenem (CS/PB). Technika ta zwiększa funkcjonalny miano wirusa nawet 3-krotnie w komórkach stabilnie ekspresujących receptor retrowirusa mysiego, przy pomijalnym wzroście czasu i kosztów. Transdukcja ludzkich fibroblastów skóry (HDFs) jest maksymalnie wzmocniona przy stężeniach CS/PB około 4-krotnie niższych niż optymalna wartość zgłaszana wcześniej dla linii komórek nowotworowych, co sugeruje, że stężenie polimeru powinno być miareczkowane dla konkretnego typu komórek docelowych. Opisujemy zatem zastosowanie bromku metyltiazolodifenylo-tetrazoliu (MTT) do oceny toksyczności polimeru w nowym typie komórek. Obserwujemy równoważną żywotność HDFs po transdukcji wirusowej z użyciem kompleksowania polimerowego lub standardowej dawki polybrenu (PB, 6 μg/ml), co wskazuje na minimalną toksyczność ostrą.

W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie ekotropowego lentiwirusa do nadekspresji onkogenów w komórkach ludzkich, co pozwala na zmniejszenie ryzyka biologicznego i zwiększenie wydajności transdukcji. Przedstawiamy również wykorzystanie kompleksowania polimerowego w celu usprawnienia transdukcji, przy jednoczesnym uniknięciu wirowania cząsteczek wirusowych, które mogłoby prowadzić do powstania aerozoli.

Protokół

1. Produkcja, zbiór i zamrażanie lentiwirusa

1. Przed rozpoczęciem protokołu skonsultuj się z instytucjonalnym specjalistą ds. bezpieczeństwa i stosuj zalecane przez niego wytyczne dotyczące bezpieczeństwa.
2. Dzień 1. Do produkcji wirusa należy użyć zdrowych, szybko rosnących komórek 293T. Wysiać komórki w zagęszczeniu 5 x 10⁶ komórek na płytkę 10 cm. Do produkcji wirusa stosować pożywkę dla komórek 293T bez antybiotyków (DMEM z wysoką zawartością glukozy z 10% FBS i 4 mM L-glutaminą).
3. Dzień 2. Późnym popołudniem przeprowadzić transfekcję komórek 293T w następujący sposób (podane wartości dotyczą jednej płytki 10 cm). Wszystkie odczynniki doprowadzić do temperatury pokojowej. Do probówki do mikrocentryfugi pipetować 375 μl OptiMEM, a następnie dodać 25 μl Fugene HD. Nie dopuścić do kontaktu nierozcieńczonego Fugene z powierzchnią ścianek probówki.
4. W probówce do mikrocentryfugi wymieszać:
   • 5 μg plazmidu transferowego (Slc7a1, wektora docelowego lub wektora kontrolnego z białkiem fluorescencyjnym)
   • 3,75 μg plazmidu opakowującego (pCMV-dR8.91 lub psPax2)
   • 1,25 μg plazmidu otoczki (pMD2.G dla pantropowego, pHCMV-EcoEnv dla ekotropowego)
   • bezzsrytkowy OptiMEM do objętości 100 μl
5. Połączyć zawartość obu probówek i inkubować mieszaninę przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wymienić pożywkę komórek 293T na 10 ml świeżej pożywki dla 293T bez antybiotyków. Mieszaninę Fugene/plazmid dodawać kroplowo na płytkę i inkubować przez noc w 37°C, 5% CO₂.
7. Dzień 3. Wymienić pożywkę komórek 293T na 10 ml świeżej pożywki dla 293T bez antybiotyków. Czynność wykonywać ostrożnie, ponieważ komórki 293T słabo przylegają i mogą zostać oderwane przy zbyt gwałtownym pipetowaniu pożywki na monowarstwę. Inkubować przez dwa dni w inkubatorze z nawilżaniem w celu produkcji wirusa.
8. Dzień 5. Zebrać wirusa i przefiltrować za pomocą filtra 0,45 mm o niskim wiązaniu białek. Użyć natychmiast lub rozdzielić na jednorazowe alikwoty i zamrozić w -80°C. Zamrożony wirus pantropowy i ekotropowy powinien zostać poddany ponownemu mianowaniu odpowiednio po sześciu miesiącach i jednym miesiącu przechowywania.
9. Wirusa mianować w następujący sposób, używając komórek stosunkowo podatnych na transdukcję. Transdukować komórki wirusem kontrolnym z białkiem fluorescencyjnym przez noc, stosując rozcieńczenia szeregowe (np. 1:10, 1:100, 1:1000) w świeżej pożywce z 6 μg/ml PB. Następnego dnia wymienić na świeżą pożywkę. Odczekać dwa dni po transdukcji, aż komórki zaczną ekspresować białko fluorescencyjne, a następnie określić frakcję komórek transdukowanych metodą FACS. Obliczyć miano w jednostkach transformujących (TU) na ml, w oparciu o rozcieńczenia dające < 15% transdukcji, aby zminimalizować zdarzenia wielokrotnej transdukcji.
   

2. Transdukcja ludzkich komórek docelowych mysim receptorem retrowirusowym Slc7a1

1. Wybierz wielokrotność infekcji (MOI) = 2, aby zapewnić transdukcję większości komórek. W przypadku komórek docelowych opornych na transdukcję, takich jak HDF, wymagane będzie wyższe MOI; w takim przypadku rozcieńczamy nadsącz wirusowy jedynie 1:2, aby osiągnąć transdukcję większości komórek.
2. Przeprowadź transdukcję komórek docelowych przez noc z użyciem nadsączu wirusowego rozcieńczonego w świeżej pożywce hodowlanej z dodatkiem 6 μg/ml PB, co zwiększa wydajność transdukcji poprzez wzmocnienie oddziaływań elektrostatycznych między wirusem a komórką docelową.¹ Idealnie należy użyć minimalnej objętości wirusa, np. 1 ml dla płytki 35 mm, ponieważ dyfuzja jest czynnikiem ograniczającym wydajność transdukcji.
3. Hoduj komórki przez co najmniej 48 godzin po usunięciu wirusa przed ich transdukcją wirusem ekotropowym, aby zapewnić wystarczającą ekspresję receptora Slc7a1.
4. (Opcjonalnie) Jeśli jest to pożądane, można zastosować blastycydynę do selekcji stabilnie transdukowanych komórek wykazujących ekspresję Slc7a1. Należy wcześniej wyznaczyć krzywą przeżywalności dla blastycydyny, aby określić najniższe skuteczne stężenie, zazwyczaj między 2 – 10 μg/ml, które w ciągu 7 dni zabiło wszystkie nietransdukowane komórki docelowe. Około 2 dni po usunięciu wirusa Slc7a1 przenieś transdukowane komórki do pożywki zawierającej blastycydynę. Hoduj komórki w pożywce z blastycydyną przez 7 dni; po tym czasie wszystkie pozostałe komórki będą stabilnie eksprimować receptor retrowirusowy, co pozwoli na ich transdukcję wirusem ekotropowym oraz zamrożenie banku komórek jako stabilnej linii eksprimującej Slc7a1 do przyszłych zastosowań.

3. Miareczkowanie kompleksu polimerowego w celu określenia toksyczności

1. Dzień 1. Wysiać komórki w zagęszczeniu 5000 cells/well na płytce 96-dołkowej, zapewniając co najmniej trzy powtórzenia dla każdej grupy eksperymentalnej. Uwzględnić komórki nietransdukowane w pożywce kompletnej w celu uzyskania wartości bazowej dla zdrowych komórek, a także próbki komórek w pożywce bezsurowiczej w celu wywołania zahamowania wzrostu jako kontroli. Równolegle wysiać komórki w odpowiednim formacie (np. na płytce 24-dołkowej) do analizy wydajności transdukcji za pomocą mikroskopii lub FACS w każdym z warunków eksperymentalnych.
2. Dzień 2. Przeprowadzić transdukcję komórek na płytkach przygotowanych zarówno do analizy MTT, jak i FACS, używając wirusa kodującego GFP przy MOI wynoszącym 0.5, aby transdukować ~40% komórek docelowych. Przetestować różne stężenia CS/PB (np. 50, 100, 200, 400, 600 i 800 mg/ml każdego składnika) oraz 6 μg/ml PB w celu wyznaczenia optymalnych ilości. Przygotować kompleksy polimerowe zgodnie z opisem w Części 4 poniżej.
3. Dzień 3. Usunąć pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją świeżą pożywką. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora z nawilżaniem.
4. Dzień 5. Przeanalizować płytkę FACS, aby określić wydajność transdukcji dla każdego stężenia polimeru.
5. Dzień 6. Usunąć pożywkę ze wszystkich dołków płytki MTT i zastąpić ją 100 μl roztworu MTT (1 mg/ml MTT w pożywce kompletnej). Inkubować przez trzy godziny w inkubatorze z nawilżaniem, aby umożliwić redukcję MTT w mitochondriach metabolicznie aktywnych komórek.
6. Usunąć roztwór MTT i zastąpić go 200 ml rozpuszczalnika MTT (0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630 w izopropanolu).
7. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub do czasu całkowitego rozpuszczenia fioletowego osadu formazanu MTT. Odczytać absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy 570 nm, odejmując wartość tła przy 690 nm.
8. Wybrać optymalne stężenie polimeru, które zapewnia maksymalny wzrost wydajności transdukcji (określony przez FACS) przy minimalnym wpływie na aktywność metaboliczną (określoną przez MTT). Dla HDF wybrano 100 μg/ml CS/PB na podstawie danych przedstawionych w Reprezentatywnych Wynikach poniżej.

4. Transdukcja ekotropowa z kompleksowaniem polimerowym

1. Przygotować sterylne, filtrowane roztwory zapasowe PB oraz chondroitynosiarczanu o stężeniu 20 mg/ml w wodzie. Rozdzielić na alykwooty i przechowywać w temperaturze -20°C.
2. Nabrać pipetą nadnadkład wirusowy do probówki do mikrocentryfugi i rozcieńczyć do pożądanego stężenia końcowego (np. MOI wynoszące 2) świeżą pożywką hodowlaną. Następnie dodać równe objętości PB i chondroitynosiarczanu (stężenia określone w kroku 3 powyżej), delikatnie potrząsając probówką po każdym dodaniu w celu wymieszania. Mieszanina wirusowa natychmiast stanie się mętna w wyniku tworzenia się osadów. Inkubować mieszaninę wirusową w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić formowanie się kompleksów.
3. Usunąć pożywkę z komórek docelowych wykazujących ekspresję receptora, zastąpić ją mieszaniną wirusową i inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po usunięciu mieszaniny wirusowej przemyć powierzchnię komórek dwukrotnie PBS, aby wspomóc usuwanie kompleksów wirusowych. Całkowite usunięcie nie jest konieczne; nie zaobserwowano negatywnego wpływu pozostałych kompleksów polimerowych na kondycję komórek.

5. Weryfikacja specyficzności transdukcji ekotropowej

1. Podczas pierwszej produkcji wirusa ekotropowego, z perspektywy bezpieczeństwa zaleca się zweryfikowanie, czy wirus nie jest w stanie transdukować niemodyfikowanych komórek ludzkich. Przeprowadź transdukcję komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w stosunkowo wysokim stężeniu (rozcieńczenie nadsączu wirusowego w świeżym medium jedynie 1- do 2-krotnie) przez noc, stosując 6 μg/ml PB lub zoptymalizowane stężenie CS/PB.
2. Usuń medium zawierające wirusa i zastąp je świeżym medium. Po inkubacji komórek przez 2 dni potwierdź ekspresję transgenu za pomocą FACS, wykorzystując wektory fluorescencyjne i/lub metodą RT-PCR z użyciem starterów specyficznych dla transgenu.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rys. 1A przedstawia proces produkcji lentiwirusa, a rys. 1B obrazuje transdukcję ludzkich komórek ekotropowym lentiwirusem, w tym wstępną transdukcję mysim receptorem retrowirusowym Slc7a1. Do miareczkowania wirusa wykorzystujemy linię komórkową rabdomyosarkoma człowieka stabilnie transdukowaną Slc7a1 (Slc-hRMS). Przy użyciu fluorescencyjnych wektorów kontrolnych do monitorowania wydajności transdukcji rutynowo osiągamy > 90% wydajności transdukcji Slc-hRMS wirusem ekotropowym, co pokazano na rys. 2A i 2B. Stopnie transdukcji HDF są zazwyczaj niższe, ponieważ komórki nie zostały poddane selekcji blastycydyną w celu ekspresji receptora (rys. 2C). Miana lentiwirusa ekotropowego stanowią zazwyczaj 10-20% miana wirusa pseudotypowanego VSV w pomiarach przeprowadzonych na Slc-hRMS (rys. 2D).

Jeden cykl zamrażania i rozmrażania redukuje miano wirusa ekotropowego o 16 - 3%, co odpowiada utracie miana podczas pojedynczego cyklu zamrażania i rozmrażania wirusa pseudotypowanego VSV (p > 0,05). W przeciwieństwie do wcześniejszych doniesień,² nie zaobserwowano pozytywnego wpływu błyskawicznego zamrażania w suchym lodzie na miano wirusa. Przeciwnie, wyższe miana obu pseudotypów po rozmrożeniu uzyskano poprzez proste umieszczenie probówek z wirusem w zamrażarce o temperaturze -80°C (dane nie przedstawiono).

Test żywotności MTT pozwala na czułe wykrywanie zahamowania wzrostu w komórkach docelowych. Transdukcja wirusem wraz z stężeniami CS/PB do 800 μg/ml nie wpływa na metabolizm HDF (Ryc. 3A). Ekspozycja na CS/PB bez wirusa również nie wykazuje toksycznego działania na komórki (dane nie pokazano). Analiza FACS komórek HDF transdukowanych wirusem wraz z różnymi stężeniami CS/PB wykazuje zwiększenie wydajności transdukcji w porównaniu do samego PB (Ryc. 3B). Maksymalne zwiększenie wydajności występuje przy stężeniu 100 μg/ml CS/PB (Ryc. 3C), co jest wartością kilkukrotnie niższą niż raportowano wcześniej.³ Zatem istotna jest optymalizacja warunków dla każdego konkretnego typu komórek docelowych.

Kompleksowanie z CS/PB zwiększa obserwowany miano około 3-krotnie w Slc-hRMS (Rys. 4A, p < 0.01). W praktyce przekłada się to na większy efekt w zakresie wydajności transdukcji przy niskich stężeniach wirusa niż przy stężeniach wyższych (Rys. 4B), co najprawdopodobniej wynika z wielokrotnej transdukcji komórek oraz nasycenia receptorów przy wyższych stężeniach wirusa.

Transdukcja wirusem ekotropowym jest specyficzna dla komórek wykazujących ekspresję receptora dla mysiego retrowirusa. Podczas transdukcji niemodyfikowanych ludzkich komórek wirusem ekotropowym nie zaobserwowano fluorescencji przekraczającej tło komórek nietransdukowanych, niezależnie od zastosowania PB lub CS/PB, co przedstawiono na Rys. 5A. W badaniu mikroskopowym HDF nie wykazują transdukcji w przypadku braku receptora (Rys. 5B), podczas gdy wstępna transdukcja receptorem prowadzi do powstania komórek fluorescencyjnych (Rys. 5C).

Rycina 1. Schematyczna prezentacja (A) procesu produkcji wirusa oraz (B) transdukcji ludzkich komórek receptorem retrowirusowym mysim, a następnie lentiwirusem ekotropowym.

Rysunek 2. Wysokowydajna transdukcja ludzkich komórek ekotropowym lentiwirusem kodującym GFP. Komórki zostały uprzednio poddane transdukcji mysim receptorem retrowirusowym Slc7a1. (A) Ludzka linia komórkowa rabdomiosarkoma selekcjonowana blastycydyną pod kątem Slc7a1 (Slc-hRMS), transdukowana (niebieski) lub nietransdukowana (różowy) GFP. (B) Mikrografia fluorescencyjna Slc-hRMS po transdukcji ekotropowej (4X). (C) HDFy transdukowane (niebieski) i nietransdukowane (różowy) ekotropowym lentiwirusem GFP; komórki zostały poddane transdukcji Slc7a1 dwa dni przed transdukcją ekotropową. (D) Miano lentiwirusa pseudotypowanego VSV-G oraz lentiwirusa ekotropowego, zmierzone na Slc-hRMS.

Rysunek 3. Optymalizacja stężeń siarczanu chondroityny/polybrene (CS/PB) w ludzkich fibroblastach skóry właściwej. (A) Żywotność HDF mierzona testem MTT po transdukcji w obecności samego PB lub różnych stężeń CS/PB. (B) Zwiększenie wydajności transdukcji w HDF przy różnych stężeniach CS/PB, mierzone za pomocą FACS. (C) Ilościowe określenie wzrostu wydajności transdukcji, wykazujące, że maksymalna transdukcja występuje przy stężeniu 100 μg/ml CS/PB.

Rycina 4. Wpływ 400 μg/ml CS/PB na transdukcję Slc-hRMS ekotropowym lentiwirusem. (A) Zwiększenie miana oraz (B) krotność zmiany szybkości transdukcji w porównaniu do zastosowania samego polybrene w stężeniu 6 μg/ml.

Rycina 5. Brak transdukcji ekotropowej HDF w przypadku braku mysiego receptora retrowirusowego Slc7a1. (A) Wykres FACS ludzkich fibroblastów BJ, nieprzetransdukowanych (różowy) lub przetransdukowanych (niebieski) ekotropowym lentiwirusem GFP w obu przypadkach przy braku receptora Slc7a1. Ludzkie fibroblasty BJ przetransdukowane ekotropowym lentiwirusem GFP, bez (B) oraz z (C) pretransdukcją receptorem Slc7a1 (4X).

Dyskusja

Rekombinowany ekotropowy gammaretrowirus oparty na mysim wirusie białaczki Moloneya (MLV) oraz jego receptor mSlc7a1 są dobrze poznane i powszechnie dostępne, będąc wykorzystywanymi od ponad 20 lat do dostarczania transgenów do komórek mysich. Ekotropowy gammaretrowirus był również stosowany w ostatnim czasie do dostarczania onkogenów do komórek ludzkich; w kontekście przeprogramowania komórkowego uznanym jest zastosowanie mSlc7a1 w celu uniknięcia generowania wirusa amfotropowego przenoszącego ludzkie onkogeny.^4,5 Jednakże lentiwirusy zapewniają znaczące zalety w stosunku do gammaretrowirusów w transdukcji opornych populacji komórek,⁶ w tym komórek pierwotnych, które często są pożądanymi celami przeprogramowania, ponieważ lentiwirusowy kompleks przedintegracyjny umożliwia transdukcję komórek niedzielących się.⁷

Lentiwirusy produkowano z wykorzystaniem kilkudziesięciu różnych pseudotypów, w tym MLV, w celu zmiany tropizmu wirusa, toksyczności i innych właściwości.⁸ Ekotropowy lentiwirus pseudotypowany MLV był stosowany do transdukcji komórek mysich,⁹ lecz rzadko używano go w odniesieniu do komórek ludzkich.¹⁰ Proponujemy zatem wykorzystanie ekotropowego lentiwirusa pseudotypowanego MLV jako bezpiecznego, kosztowo efektywnego i wysoce wydajnego nośnika do dostarczania znanych lub podejrzewanych onkogenów, w tym czynników reprogramowania komórkowego, do komórek ludzkich.

Należy podkreślić, że niniejszy protokół nie eliminuje całkowicie konieczności wytwarzania i stosowania pantropowego lentiwirusa; zamiast tego oddziela on onkogen(y) od wirusa pantropowego, chroniąc badaczy przed potencjalną samoinkulacją wirusami związanymi z nowotworami. Białko mSlc7a1 i jego ludzki homolog hSlc7a1 są powszechnie ekspresjonowanymi transporterami aminokwasów o nieznanej tumorigeniczności i braku zdolności do nadawania selektywnej przewagi wzrostu komórkom biorcy,¹¹ co sprawia, że mSlc7a1 wiąże się z relatywnie niskim ryzykiem w przypadku wbudowania w wirusa amfotropowego. Ten dodatkowy krok może być szczególnie użyteczny w laboratoriach nieposiadających dedykowanych pomieszczeń do hodowli wirusów lub tkanek o wymaganym poziomie bezpieczeństwa biologicznego.

W niektórych sytuacjach możliwe może być całkowite wyeliminowanie użycia wirusa pantropowego poprzez bezpośrednią transfekcję plazmidu Slc7a1 do komórek docelowych; jednak wiele komórek, które stanowiłyby przydatne cele dla tej techniki, jest jednocześnie opornych na transfekcję. Jako alternatywę, możliwość izolacji komórek transdukowanych Slc7a1 poprzez selekcję blastycydyną oznacza, że pseudotypowany VSV-G lentiwirus może zostać użyty jednorazowo w celu wygenerowania banku komórek wykazujących ekspresję receptora, po czym w rutynowy sposób można stosować wirusa ekotropowego do transdukcji tych komórek w wielu eksperymentach. Badacze powinni zawsze przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa pracy z dowolnym lentiwirusem, niezależnie od jego tropizmu.

Miana wirusa ekotropowego uzyskane przy zastosowaniu tego protokołu są umiarkowanie niższe niż w przypadku wirusa pseudotypowanego VSV, zazwyczaj stanowią 10-20% miana wirusa pantropowego, co jest zgodne z poprzednimi badaniami.⁹ Miana te mierzono w ludzkich komórkach stabilnie transdukowanych Slc7a1, zatem niższe zaobserwowane miano wirusa ekotropowego może wynikać częściowo ze zróżnicowanej ekspresji genu receptora w komórkach docelowych. Niemniej jednak miana wirusowe osiągnięte w naszym protokole są więcej niż wystarczające dla większości zastosowań i prowadzą do transdukcji większości komórek, w niektórych przypadkach > 90% komórek.

Techniki oparte na wirowaniu są powszechnie stosowane do zagęszczania cząstek wirusowych. Jednakże wirowanie trwa kilka godzin, generuje zakaźne aerozole i może prowadzić do znacznej utraty cząstek wirusowych.¹² Jako alternatywę można zastosować kompleksowanie z CS/PB w celu zwiększenia transdukcji bez zmiany tropizmu wirusa.³ Metoda ta jest szybka (5 minut) i niedroga (0,03 USD na 10 ml wirusa), a jednocześnie mniej więcej trzykrotnie zwiększa obserwowany miano. Nie jest wymagany specjalistyczny sprzęt ani zastrzeżone odczynniki; zaobserwowano minimalną toksyczność ostrą po narażeniu HDF na CS/PB, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami na innych liniach komórkowych.¹³ Potencjalną wadą tego protokołu jest fakt, że niektóre widoczne mikroskopowo kompleksy polimerowe przylegają do komórek przez kilka dni hodowli. Nie można wykluczyć możliwości, że kompleksy te, mimo braku wyraźnej toksyczności dla komórek, mogą wywierać subtelniejszy wpływ na procesy komórkowe.

W niniejszym opracowaniu opisano metodologię bezpiecznej i wydajnej transdukcji ludzkich komórek czynnikami onkogennymi. Podejście to powinno okazać się bardzo użyteczne dla badaczy zajmujących się onkogenami oraz biologią komórek macierzystych, w tym komórek iPS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Mysi receptor MLV
pMD2.G	Addgene	12259	Otoczka VSV-G
pCMV-dR8.91	Addgene		Laboratorium D. Trono14 Plazmid pakujący (równoważny plazmid psPax2 jest dostępny w Addgene, nr kat. 12260)
pHCMV-Ec–nv	Addgene	15802	Otoczka ekotropowa
FUGW	Addgene	14883	Plazmid kontrolny GFP
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche Group	04 709 705 001
Bromek heksadymetryny (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Siarczan chondroityny, sól sodowa z chrząstki rekina	Sigma-Aldrich	C4384
Blastycydyna S	Fisher Scientific	BP 2647100
Bromek metyltiazoliodifenylo-tetrazoliu (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021