Niniejsze badanie opisuje diagnostykę grypy ptaków u dzikiego ptactwa z wykorzystaniem przenośnego systemu rRT-PCR. Metoda ta wykorzystuje liofilizowane odczynniki do badania dzikich ptaków w warunkach poza laboratoryjnymi, typowych dla scenariusza ogniska choroby. Zastosowanie narzędzi molekularnych zapewnia dokładne i czułe alternatywy dla szybkiej diagnostyki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka diagnostyka wirusa grypy ptaków u dzikich ptaków: wykorzystanie przenośnego urządzenia rRT-PCR i liofilizowanych odczynników w warunkach terenowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dzikie ptaki są uwikłane w rozprzestrzenianie wysoce patogennej grypy ptaków (HPAI) podtypu H5N1, co skłania do prowadzenia nadzoru wzdłuż szlaków migracyjnych. Pobieranie próbek od dzikich ptaków w celu wykrycia wirusa grypy ptaków (AIV) jest często przeprowadzane w regionach oddalonych, jednak wyniki są zazwyczaj opóźnione ze względu na konieczność transportu próbek do laboratorium wyposażonego w zaplecze do badań molekularnych. Ilościowa odwrócona transkrypcja z reakcją łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (rRT-PCR) jest techniką molekularną, która oferuje jedną z najdokładniejszych i najczulszych metod diagnostyki AIV. Dotychczas rygorystyczne protokoły laboratoryjne wymagane dla rRT-PCR są obecnie dostosowywane do warunków terenowych. Opracowanie liofilizowanych odczynników, które nie wymagają zachowania łańcucha chłodniczego, a wykazują czułość na poziomie odczynników w formie płynnej, sprawiło, że testowanie w terenie, w oddalonych lokalizacjach, stało się celem praktycznym.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę szybkiej diagnostyki AIV u dzikich ptaków z wykorzystaniem urządzenia rRT-PCR (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device lub RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), które wykorzystuje liofilizowane odczynniki (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). Odczynniki zawierają w jednej probówce wszystkie niezbędne do badania komponenty w odpowiednich stężeniach: startery, sondy, enzymy, bufory oraz wewnętrzne kontrole pozytywne, co eliminuje błędy związane z nieprawidłowym przechowywaniem lub obchodzeniem się z odczynnikami w formie płynnej. Przenośne urządzenie przeprowadza przesiew w kierunku grypy typu A poprzez celowanie w gen macierzy i dostarcza wyników w ciągu 2-3 godzin. Możliwe jest również subtypownie genetyczne z wykorzystaniem zestawów starterów H5 i H7 celujących w gen hemaglutyniny.
System ten nadaje się do analizy próbek z kloaki i gardła pobranych od dzikich ptaków, co zaprezentowano tutaj na przykładzie wędrownego siewca, biegusa zachodniego (Calidrus mauri) odłowionego w północnej Kalifornii. Postępowanie ze zwierzętami przebiegało zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Animal Care and Use Committee) Zachodniego Centrum Badań Ekologicznych Geologicznej Służby USA (U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center) oraz zgodnie z pozwoleniami Laboratorium Obrączkowania Ptaków Geologicznej Służby USA (U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory). Główną zaletą tej techniki jest przyspieszenie diagnostyki dzikich ptaków, co zwiększa szanse na opanowanie ogniska choroby w odległych lokalizacjach. Diagnostyka w miejscu pobrania próbek byłaby również przydatna do identyfikacji i badania zakażonych osobników w populacjach dzikich. Możliwość gromadzenia informacji na temat biologii gospodarza (odpowiedzi immunologicznej i fizjologicznej na zakażenie) oraz ekologii przestrzennej (wydajności migracyjnej zakażonych ptaków) dostarczy wiedzy na temat stopnia, w jakim dzikie ptaki mogą pełnić rolę wektorów AIV na długich dystansach.
Protokół
1. Odłów dzikich ptaków za pomocą sieci mgielnych
- W celu odłowu ptaków siewkowych rozstawić sieci mgłowe w miejscu aktywnego żerowania, takim jak bagna, linia brzegowa lub mielizna błotna.
- Nasunąć pętle linki mocującej z jednego końca sieci mgłowej na żerdź i wbić żerdź pionowo w błoto.
- Rozciągnąć sieć, przełożyć drugą żerdź przez pętle mocujące na drugim końcu sieci mgłowej i wbić żerdź pionowo w błoto, upewniając się, że linki mocujące są napięte.
- Po złapaniu ptaka wyjąć go z sieci i przenieść do stacji obrączkowania.
2. Pobieranie wymazów z kloaki
- Pobrać wymazy z kloaki natychmiast po odłowieniu zwierzęcia
- Zlokalizować kloakę i odsunąć opuszkami palców okoliczne pióra
- Rozwinąć jałowy wymaz z końcówką z Dacronu lub poliestru, zaczynając od trzonka, i zwilżyć końcówkę jałowym podłożem transportowym do wirusów, aby ułatwić pobieranie próbki. Po zwilżeniu całą głowicę wymazu należy delikatnie wprowadzić do kloaki. Przejechać wymazem po wewnętrznej obwodzie kloaki, powoli obracając go, a następnie wyjąć wymaz z otworu
- Wprowadzić końcówkę wymazu bezpośrednio do probówki z podłożem transportowym do wirusów; obracać trzonkiem wymazu między kciukiem a palcem wskazującym, gdy wymaz znajduje się w podłożu. Poprosić asystenta o dokończenie procedury poprzez cofnięcie końcówki wymazu z dna probówki o około 1 cm i odcięcie trzonka nożyczkami w taki sposób, aby końcówka pozostała w probówce, a trzonek nie utrudniał zamknięcia nakrętki. Szczelnie zakręcić probówkę. Dezynfekować nożyczki alkoholem pomiędzy odcinaniem poszczególnych trzonków wymazów
- Umieścić probówki w pudełku mroźniczym zawierającym suchy lód lub wkładki chłodzące
3. Pobieranie wymazów z gardła i jamy ustnej
- Ostrożnie otwórz dziób ptaka, tak aby szczelina choanale była widoczna
- Wyjmij z opakowania czysty wymaz, zaczynając od końca trzonka, i zwilż końcówkę w medium transportowym do wirusów, aby ułatwić pobieranie materiału
- Wprowadź końcówkę do pyska, nie dotykając wcześniej żadnej innej powierzchni, i przetrzyj otwór choanalnego na podniebieniu, kierując się następnie w stronę gardła lub obszaru orofaringealnego
- Umieść końcówkę wymazu bezpośrednio w fiolce z medium transportowym do wirusów. Obracaj trzonek wymazu kciukiem i palcem wskazującym, gdy wymaz znajduje się w medium. Podobnie jak wyżej, poproś asystenta o odsunięcie końcówki wymazu od dna fiolki o ok. 1 cm i odetnij trzonek nożyczkami, tak aby końcówka pozostała w fiolce, a trzonek nie przeszkadzał w zamknięciu nakrętki. Szczelnie zakręć fiolkę. Pomiędzy odcinaniem trzonków wymazów dezynfekuj nożyczki alkoholem
- Umieść fiolki w pudełku do zamrażarki z suchym lodem lub wkładami chłodzącymi
4. Obsługa i wypuszczenie ptaków
- Zwróć ptaka w miejsce odłowu i wypuść go bezzwłocznie (<20min). Osoby obsługujące powinny znać zasady dobrostanu zwierząt i zwracać uwagę na oznaki cierpienia ptaka podczas pobierania próbek (np. otarcia, miopatia stresowa oraz hipotermia lub hipertermia). W wykazie sprzętu powinna znaleźć się podstawowa apteczka pierwszej pomocy.
5. Zaplecze badawcze
- Próbki można badać w dowolnej zamkniętej przestrzeni, takiej jak przyczepa badawcza lub namiot, z dostępem do zasilania (generator prądu z regulatorem napięcia) w celu uruchomienia urządzenia do PCR oraz podłączonego komputera.
6. Ekstrakcja RNA
- Izolację RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu RNeasy Mini z niewielkimi modyfikacjami instrukcji producenta, zgodnie z metodą Spackman et al. 1
- Wymieszać medium z wymazu na wirówce typu vortex przez 3-5 s i przenieść 350 μl do probówki mikrocentryfugalnej o pojemności 2 ml. Uwaga: Pozostałą część próbki należy przechowywać w lodzie na wypadek konieczności ponownego przesiewania próbek PCR-dodatnich lub wykonania testu na H5.
- Dodać 350 μl buforu RLT (z β-me) i mieszać na vortexie przez 5 s.
- Dodać 350 μl 70% etanolu klasy RNA.
- Wirować przy 5,0 x g przez 5 min.
- Przenieść 60 μl nadsączu do kolumny do wirowania umieszczonej w probówce zbierającej o pojemności 2 ml. Pozostałą część próbki pozostawić w statywie z probówkami.
- Wirować przez 20 s przy 10,00 x g i odrzucić filtrat.
- Powtarzać kroki 17-18 do momentu przepuszczenia całej próbki przez kolumnę do wirowania.
- Umieścić kolumnę do wirowania w czystej probówce zbierającej o pojemności 2 ml.
- Dodać do kolumny do wirowania 70 μl buforu RW1 i wirować przez 25 s przy 10,0 x g. Odrzucić filtrat.
- Dodać do kolumny do wirowania 50 μl buforu RPE i wirować przez 25 s przy 10,0 x g. Odrzucić filtrat.
- Powtórzyć krok 2, aby łącznie przeprowadzić dwa etapy przemywania buforem RPE.
- Wirować kolumnę do wirowania przez dodatkowe 2 minuty przy 14,0 x g. Odrzucić probówkę zbierającą.
- Umieścić kolumnę do wirowania w czystej probówce mikrocentryfugalnej o pojemności 1,5 ml i dodać 50μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 s.
- Eluować RNA, wirować przez 60 s przy 10,00 x g. Oczyszczoną próbkę umieścić w lodzie.
7. Przygotowanie kontroli negatywnych
- Liofilizowane odczynniki do analizy PCR przygotowano zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu Idaho Technologies Freeze-Dried Reagent Detection Kit for TaqMan Probes Influenza A Target 1 (ASAY-ASY-0109).
- Wiruj fiolkę z odczynnikiem kontroli negatywnej (czerwona) przez 3 s, aby upewnić się, że osad znajduje się na dnie.
- Zdejmij nakrętkę i wizualnie sprawdź, czy osad znajduje się na dnie.
- Dodaj 20 μl buforu do rekonstytucji 2 X oraz 20 μl wody czystości odczynnikowej.
- Zakręć fiolkę i mieszaj w wortexie przez 5 s z maksymalną prędkością.
- Wiruj przez 3 s, aby zgromadzić ciecz na dnie fiolki.
- Wizualnie sprawdź, czy osad uległ rehydratacji; w przeciwnym razie powtórz kroki 31-32.
- Pipetuj 19 μl uwodnionej mieszaniny do kapilary Lightcycler; powtórz tę czynność w drugiej kapilarze, aby uzyskać próbkę dubletową.
8. Przygotowanie próbek badawczych
- Odwiruguj fiolkę z nieznanym odczynnikiem (niebieską) przez 3 s, aby upewnić się, że osad znajduje się na dnie.
- Zdejmij nakrętkę i wizualnie sprawdź, czy osad znajduje się na dnie.
- Dodaj 40 μl oczyszczonego RNA.
- Zakręć fiolkę i wymieszaj wortexie przez 5 s z maksymalną prędkością.
- Odwiruguj przez 3 s, aby przenieść ciecz na dno fiolki.
- Wizualnie sprawdź, czy osad uległ rehydratacji; jeśli nie, powtórz kroki 38-39.
- Przenieś pipetą 19 μl uwodnionej mieszaniny do kapilary Lightcyclera; powtórz czynność dla drugiej kapilary, aby uzyskać próbkę dubletową.
9. Przygotowanie kontroli pozytywnych
- Odwiruj fiolkę z odczynnikiem kontroli dodatniej (zielona) przez 3 s, aby upewnić się, że osad znajduje się na dnie.
- Zdejmij nakrętkę i sprawdź wizualnie, czy osad znajduje się na dnie.
- Dodaj 20 μl 2 X Buforu do Rekonstytucji oraz 20 μl wody o czystości odczynnikowej.
- Zakręć fiolkę i mieszaj na wortexie przez 5 s z maksymalną prędkością.
- Odwiruj przez 3 s, aby ciecz opadła na dno fiolki.
- Sprawdź wizualnie, czy osad uległ rehydratacji; w przeciwnym razie powtórz kroki 45-46.
- Pipetuj 19 μl uwodnionej mieszaniny do kapilary Lightcycler; powtórz czynność w drugiej kapilarze, aby uzyskać próbę dubletową.
10. Wirowanie kapilar
- Po przygotowaniu wszystkich kapilar dla danej partii, należy umieścić je w miniwirówce wyposażonej w adaptery do kapilar.
- Odwiruj próbki przy najniższym ustawieniu, przytrzymując przycisk impulsu przez 1 s. Operacja ta przenosi ciecz na dno w celu przygotowania do testowania.
1. Obsługa urządzenia RAPID
- Utwórz nowy plik. Oznacz kontrolę dodatnią, kontrolę ujemną oraz próbki (zgodnie z ich numerem ID).
- Program 1: Inkubacja przygotowania próbek RNA
- Liczba cykli = 1
- Tryb analizy = Brak
- Temperatura docelowa = 40
- Czas inkubacji = 30 min
- Szybkość zmiany temperatury = 20°C/s (domyślna)
- Drugorzędna temperatura docelowa = 0 (domyślna)
- Wielkość kroku = 0 (domyślna)
- Opóźnienie kroku = 0 (domyślne)
- Tryb akwizycji = Brak (domyślny)
- Program 2: Denaturacja RNA
- Liczba cykli = 1
- Tryb analizy = Brak
- Temperatura docelowa = 94
- Czas inkubacji = 120s
- Szybkość zmiany temperatury = 20°C/s (domyślna)
- Drugorzędna temperatura docelowa = 0 (domyślna)
- Wielkość kroku = 0 (domyślna)
- Opóźnienie kroku = 0 (domyślne)
- Tryb akwizycji = Brak (domyślny)
- Program 3: Amplifikacja RNA
- Liczba cykli = 45
- Tryb analizy = Analiza automatyczna
- Temperatura docelowa, Segment 1 = 94; Segment 2 = 60
- Czas inkubacji, Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s
- Szybkość zmiany temperatury, Seg 1 i 2 = 20°C/s (domyślna)
- Drugorzędna temperatura docelowa, Seg 1 i 2 = 0 (domyślna)
- Wielkość kroku, Seg 1 i 2 = 0 (domyślna)
- Opóźnienie kroku, Seg 1 i 2 = 0 (domyślne)
- Tryb akwizycji, Segment 1 = Brak; Segment 2 = pojedynczy
- Parametry fluorescencji
- Tryb wyświetlania: kanał fluorescencji 2 (Ch2/1)
Wzmocnienie (Gains):- Ch 1 (F1) = 1
- Ch 2 (F2) = 8
- Ch 3 (F3) = 1
- Aby wyświetlić dane fluorescencji w czasie rzeczywistym dla każdej próbki, wybierz interesującą próbkę i kliknij przycisk „Show Graph” na dole ekranu
- Tryb wyświetlania: kanał fluorescencji 2 (Ch2/1)
- Dla każdej kapilary wyniki obejmują następujące informacje:
- # -- identyfikuje pozycję w karuzeli
- Nazwa próbki - podaje nazwę próbki
- Kontrola - identyfikuje typ każdej próbki
- Wynik (Score) - obliczony na podstawie zależności między fluorescencją próbki a poziomem fluorescencji tła w próbce
- Rezultat (Result) - wyświetla ogólny wynik dla próbki
12. Reprezentatywne wyniki:
Możliwe wyniki obejmują następujące opcje:
Obecny: Czerwony komunikat „obecny” (present) dla próbki testowej/nieznanej wskazuje, że w tej próbce zidentyfikowano cel, a kontrole przebiegły pomyślnie.
Nie wykryto: Zielony komunikat „nie wykryto” (not detected) dla próbki testowej/nieznanej wskazuje, że w tej próbce nie zidentyfikowano celu, a kontrole testu przebiegły pomyślnie.
Proszę powtórzyć: Komunikat „proszę powtórzyć” (please repeat) wskazuje, że kontrola pozytywna lub negatywna nie powiodła się.
Przykład udanej analizy za pomocą urządzenia RAPID 720 przedstawiono na Rysunku 4. Kontrola pozytywna uległa amplifikacji i wygenerowała wykrywalną fluorescencję (oś y) w okolicach 25 cykli (oś x). Próg cyklu (CT) > 35 jest uzgodnioną wartością odcięcia dla większości referencyjnych laboratoriów badających AIV. Zatem kontrole pozytywne dla tej metody wygenerowały sygnał fluorescencyjny w dopuszczalnej liczbie cykli (0-35) dla detekcji AIV. W przeciwieństwie do nich, kontrola negatywna nie wygenerowała sygnału fluorescencyjnego nawet po 45 cyklach. Podobnie dwanaście próbek pobranych od beczkasów zachodnich nie wygenerowało sygnału fluorescencyjnego, co wskazuje, że ptaki te były negatywne pod kątem AIV. Zaleca się przeprowadzenie testów kontrolnych wszystkich próbek pozytywnych w tradycyjnym laboratorium, aby upewnić się, że nie powstały błędne wyniki fałszywie dodatnie.
Rycina 1. Odłów siewców przy użyciu sieci mgłowych.
Rysunek 2. Pobieranie próbek z kloaki i gardła u beczkasa małego.
Rycina 3. Programowanie urządzenia RAPID 720 do amplifikacji RNA.
Rycina 4. Fluorogram wygenerowany przez przenośny system rRT-PCR RAPID 720, pokazujący, jak powinny wyglądać kontrole dodatnie i ujemne w prawidłowo przeprowadzonym badaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić obraz w pełnym rozmiarze
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda szybkiej diagnostyki umożliwia czasowo wydajne i dokładne badanie próbek od dzikich ptaków w ramach nadzoru nad AIV. Znacznie mniej rygorystyczne wymagania dotyczące przechowywania próbek w przypadku przenośnego rRT-PCR są odpowiednie do warunków terenowych, w których utrzymanie łańcucha chłodniczego może być niepraktyczne, jeśli nie ma dostępu do transportatorów z ciekłym azotem lub suchego lodu. Ponadto stwierdzono, że analiza próbek z wykorzystaniem liofilizowanych odczynników była na tyle p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować M. Scullion i R. Crisp z Idaho Technologies za wsparcie techniczne, a także USGS Western Ecological Research Center za finansowanie (S. Schwarzbach) i pomoc (K. Spragens, T. Graham). Badania te zostały przeprowadzone pod auspicjami Center for Innovative Technology - Institute for Defense and Homeland Security (www.idhs.org) na rzecz Departamentu Obrony oraz Air Force Research Laboratory. Postępowanie z zwierzętami przebiegało zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Animal Care and Use Committee w USGS Western Ecological Research Center oraz zezwoleniami U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. Wszelkie użycie nazw handlowych, produktów lub firm w niniejszej publikacji służy wyłącznie celom opisowym i nie implies poparcia przez rząd USA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| kolumienka do wirowania RNeasy mini | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| probówki do zbierania (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| bufor RLT | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| bufor RW1 | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| bufor RPE | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| woda wolna od RNaz | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| roztwór 14.3 M β-merkapto–etanolu | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% etanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (sonda hydrolityczna) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| kapilary do Lightcycler 20ml | Roche Group | 04929292001 | |
| mikrowirówka z rotorem do probówek 2 ml | Idaho Technologies | zawiera zestaw RAPID | |
| wzmocnione urządzenie do identyfikacji zaawansowanych patogenów (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | zawiera zestaw RAPID | |
| laptop z procesorem Pentium i systemem Windows XP Professional | Idaho Technologies | zawiera zestaw RAPID | |
| oprogramowanie Lightcycler Data Analysis | Idaho Technologies | zawiera zestaw RAPID |
Bibliografia
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
