Niniejsze badanie opisuje diagnostykę grypy ptaków u dzikiego ptactwa z wykorzystaniem przenośnego systemu rRT-PCR. Metoda ta wykorzystuje liofilizowane odczynniki do badania dzikich ptaków w warunkach poza laboratoryjnymi, typowych dla scenariusza ogniska choroby. Zastosowanie narzędzi molekularnych zapewnia dokładne i czułe alternatywy dla szybkiej diagnostyki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka diagnostyka wirusa grypy ptaków u dzikich ptaków: wykorzystanie przenośnego urządzenia rRT-PCR i liofilizowanych odczynników w warunkach terenowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dzikie ptaki są uwikłane w rozprzestrzenianie wysoce patogennej grypy ptaków (HPAI) podtypu H5N1, co skłania do prowadzenia nadzoru wzdłuż szlaków migracyjnych. Pobieranie próbek od dzikich ptaków w celu wykrycia wirusa grypy ptaków (AIV) jest często przeprowadzane w regionach oddalonych, jednak wyniki są zazwyczaj opóźnione ze względu na konieczność transportu próbek do laboratorium wyposażonego w zaplecze do badań molekularnych. Ilościowa odwrócona transkrypcja z reakcją łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (rRT-PCR) jest techniką molekularną, która oferuje jedną z najdokładniejszych i najczulszych metod diagnostyki AIV. Dotychczas rygorystyczne protokoły laboratoryjne wymagane dla rRT-PCR są obecnie dostosowywane do warunków terenowych. Opracowanie liofilizowanych odczynników, które nie wymagają zachowania łańcucha chłodniczego, a wykazują czułość na poziomie odczynników w formie płynnej, sprawiło, że testowanie w terenie, w oddalonych lokalizacjach, stało się celem praktycznym.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę szybkiej diagnostyki AIV u dzikich ptaków z wykorzystaniem urządzenia rRT-PCR (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device lub RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), które wykorzystuje liofilizowane odczynniki (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). Odczynniki zawierają w jednej probówce wszystkie niezbędne do badania komponenty w odpowiednich stężeniach: startery, sondy, enzymy, bufory oraz wewnętrzne kontrole pozytywne, co eliminuje błędy związane z nieprawidłowym przechowywaniem lub obchodzeniem się z odczynnikami w formie płynnej. Przenośne urządzenie przeprowadza przesiew w kierunku grypy typu A poprzez celowanie w gen macierzy i dostarcza wyników w ciągu 2-3 godzin. Możliwe jest również subtypownie genetyczne z wykorzystaniem zestawów starterów H5 i H7 celujących w gen hemaglutyniny.
System ten nadaje się do analizy próbek z kloaki i gardła pobranych od dzikich ptaków, co zaprezentowano tutaj na przykładzie wędrownego siewca, biegusa zachodniego (Calidrus mauri) odłowionego w północnej Kalifornii. Postępowanie ze zwierzętami przebiegało zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Animal Care and Use Committee) Zachodniego Centrum Badań Ekologicznych Geologicznej Służby USA (U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center) oraz zgodnie z pozwoleniami Laboratorium Obrączkowania Ptaków Geologicznej Służby USA (U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory). Główną zaletą tej techniki jest przyspieszenie diagnostyki dzikich ptaków, co zwiększa szanse na opanowanie ogniska choroby w odległych lokalizacjach. Diagnostyka w miejscu pobrania próbek byłaby również przydatna do identyfikacji i badania zakażonych osobników w populacjach dzikich. Możliwość gromadzenia informacji na temat biologii gospodarza (odpowiedzi immunologicznej i fizjologicznej na zakażenie) oraz ekologii przestrzennej (wydajności migracyjnej zakażonych ptaków) dostarczy wiedzy na temat stopnia, w jakim dzikie ptaki mogą pełnić rolę wektorów AIV na długich dystansach.
Protokół
1. Odłów dzikich ptaków za pomocą sieci mgielnych
- W celu odłowu ptaków siewkowych rozstawić sieci mgłowe w miejscu aktywnego żerowania, takim jak bagna, linia brzegowa lub mielizna błotna.
- Nasunąć pętle linki mocującej z jednego końca sieci mgłowej na żerdź i wbić żerdź pionowo w błoto.
- Rozciągnąć sieć, przełożyć drugą żerdź przez pętle mocujące na drugim końcu sieci mgłowej i wbić żerdź pionowo w błoto, upewniając się, że linki mocujące są napięte.
- Po złapaniu ptaka wyjąć go z sieci i przenieść do stacji obrączkowania.
2. Pobieranie wymazów z kloaki
- Pobrać wymazy z kloaki natychmiast ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda szybkiej diagnostyki umożliwia czasowo wydajne i dokładne badanie próbek od dzikich ptaków w ramach nadzoru nad AIV. Znacznie mniej rygorystyczne wymagania dotyczące przechowywania próbek w przypadku przenośnego rRT-PCR są odpowiednie do warunków terenowych, w których utrzymanie łańcucha chłodniczego może być niepraktyczne, jeśli nie ma dostępu do transportatorów z ciekłym azotem lub suchego lodu. Ponadto stwierdzono, że analiza próbek z wykorzystaniem liofilizowanych odczynników była na tyle p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować M. Scullion i R. Crisp z Idaho Technologies za wsparcie techniczne, a także USGS Western Ecological Research Center za finansowanie (S. Schwarzbach) i pomoc (K. Spragens, T. Graham). Badania te zostały przeprowadzone pod auspicjami Center for Innovative Technology - Institute for Defense and Homeland Security (www.idhs.org) na rzecz Departamentu Obrony oraz Air Force Research Laboratory. Postępowanie z zwierzętami przebiegało zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Animal Care and Use Committee w USGS Western Ecological Research Center oraz zezwoleniami U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. Wszelkie użycie nazw handlowych, produktów ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| kolumienka do wirowania RNeasy mini | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| probówki do zbierania (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| bufor RLT | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| bufor RW1 | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| bufor RPE | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| woda wolna od RNaz | Qiagen | 74106 | zawiera zestaw RNeasy Mini Kit |
| roztwór 14.3 M β-merkapto–etanolu | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% etanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (sonda hydrolityczna) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| kapilary do Lightcycler 20ml | Roche Group | 04929292001 | |
| mikrowirówka z rotorem do probówek 2 ml | Idaho Technologies | zawiera zestaw RAPID | |
| wzmocnione urządzenie do identyfikacji zaawansowanych patogenów (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | zawiera zestaw RAPID | |
| laptop z procesorem Pentium i systemem Windows XP Professional | Idaho Technologies | zawiera zestaw RAPID | |
| oprogramowanie Lightcycler Data Analysis | Idaho Technologies | zawiera zestaw RAPID |
Bibliografia
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
