Wykrywanie blaszek neurytycznych w modelu mysim choroby Alzheimera

Podsumowanie

Jedną z patologicznych cech AD jest tworzenie się blaszek neurytowych wykazujących obecność białka amyloid β. W niniejszym protokole opisujemy dwie metody wykrywania blaszek neurytowych u myszy w transgenicznym modelu AD: detekcję immunohistochemiczną z wykorzystaniem metody ABC i DAB oraz detekcję fluorescencyjną z zastosowaniem barwienia tioflawiną S.

Streszczenie

Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszym zaburzeniem neurodegeneracyjnym prowadzącym do otępienia. Tworzenie blaszek neurytycznych jest jedną z patologicznych cech charakterystycznych choroby Alzheimera. Głównym składnikiem blaszek neurytycznych jest małe białko włókniste zwane białkiem amyloid β (Aβ)¹, które powstaje w wyniku sekwencyjnego cięcia proteolitycznego białka prekursorowego beta-amyloidu (APP) przez β-sekretazę i γ-sekretazę. Hipoteza amyloidowa zakłada, że blaszki zawierające Aγ stanowią podstawowy mechanizm toksyczny w patologii AD². Analiza pośmiertna obecności blaszek neurytycznych potwierdza diagnozę AD. Aby pogłębić zrozumienie neurobiologii Aγ w patogenezie AD, opracowano różne linie myszy wykazujące mutacje związane z AD w ludzkich genach APP. W zależności od ciężkości choroby, myszy te będą rozwijać blaszki neurytyczne w różnym wieku. Myszy te służą jako nieocenione narzędzia do badania patogenezy oraz opracowywania leków, które mogłyby wpływać na szlak przetwarzania APP i tworzenie blaszek neurytycznych. W niniejszym protokole stosujemy metodę immunohistochemiczną do specyficznego wykrywania blaszek neuryticznych u myszy w modelu AD. Szczegółowo omówimy przygotowanie od momentu wycięcia połowy mózgu, fiksację paraformaldehydem, kriosekcjonowanie oraz dwie metody wykrywania blaszek neurytycznych u transgenicznych myszy z AD: detekcję immunohistochemiczną z wykorzystaniem metody ABC i DAB oraz detekcję fluorescencyjną z zastosowaniem barwienia tioflawiną S.

Protokół

1. Fiksacja mózgów myszy i kriosekcjonowanie

1. Myszy transgeniczne uśmierca się za pomocą dwutlenku węgla, po czym przeprowadza się dekapitację i wyodrębnia mózg.
2. Mózg przecinamy wzdłuż w linii środkowej. Połowę mózgu zamraża się gwałtownie na suchym lodzie do analizy biochemicznej. Pozostałą część zanurza się w 4% paraformaldehydzie (PFA) na co najmniej 48 godzin w temperaturze 4°C.
3. Po utrwaleniu w 4% PFA przez co najmniej 48 godzin, półkulę mózgu przenosi się bezpośrednio do 30% roztworu sacharozy i przechowuje w temperaturze 4°C. Na tym etapie półkula mózgu powinna unosić się w roztworze sacharozy. Gdy półkula opadnie na dno, co zazwyczaj zajmuje około 48 godzin, jest gotowa do zatopienia w OCT w celu wykonania kriofragmentacji.
4. Przed kriofragmentacją nanosi się cienką warstwę OCT na uchwyt i zamraża w temperaturze -20°C. Usuwa się móżdżek z pozostałej części półkuli mózgu i umieszcza go na zamrożonej warstwie OCT. Następnie półkulę mózgu natychmiast przykrywa się OCT i pozwala powoli zamarznąć w temperaturze -20°C. Gdy OCT zatapiający mózg stanie się nieprzezroczysty, preparat jest gotowy do cięcia.
5. Ustawia się grubość każdego przekroju na 30 μm. Każdy plaster zbiera się do pojemnika z roztworem D'Olomos.

2. Procedura immunohistochemiczna dla blaszek neur upływowych (przekroje swobodnie pływające)

1. Przetrzymaj każdy przekrój w 8% kwasie mrówkowym przez 15 minut. Po traktowaniu kwasem mrówkowym przekrój tymczasowo stanie się nieprzezroczysty i może sprawiać wrażenie pomarszczonego.
2. Przenieś każdy przekrój do płytki i przemyj za pomocą Tx-PBS (0,3% Triton X-10 w PBS) przez 5 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.
3. Zablokuj endogenny nadtlenek: blokowanie w 0,5% H₂O₂ w Tx-PBS, temperatura pokojowa (RT), 30 min przy delikatnym wstrząsaniu.
4. Przemyj przekrój w Tx-PBS przez 10 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.
5. Zablokuj przekrój 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku rozpuszczonym w Tx-PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy delikatnym wstrząsaniu.
6. Inkubuj przekroje w przeciwciałach pierwszorzędowych (Biotinylated 4G8, 1:50-1:20, Signet) rozcieńczonych w Tx-PBS z dodatkiem 5% mleka w temperaturze 4°C przez noc przy delikatnym wstrząsaniu.
7. Przemyj przekrój w Tx-PBS przez 10 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.
8. Przygotuj roztwór ABC zgodnie z protokołem producenta (Elite ABC, Vector Laboratories). Inkubuj przekroje w mieszaninie ABC przez 30 min przy delikatnym wstrząsaniu.
9. Przemyj przekrój w Tx-PBS przez 10 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.
10. Przygotuj 3,3'-diaminobenzydynę tetrahydrochlorek (DAB) (Vector Laboratories) zgodnie z protokołem producenta. Inkubuj przekroje w mieszaninie DAB przez 5-10 min. Na tym etapie zaobserwujesz pojawienie się brązowego zabarwienia na każdym przekroju.
11. Przemyj przekrój w Tx-PBS przez 10 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.
12. Wolnorefleksyjne przekroje mózgu montuje się na szkiełkach powlekanych żelatyną, aby wspomóc adhezję tkanki. Następnie przekroje są suszone na powietrzu, po czym przechodzą proces klarowania w serii ksylenu i są montowane w Entellen.
13. Blaszki są wizualizowane pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 40X i kwantyfikowane poprzez ocenę średniej liczby blaszek na przekrój dla każdej myszy.

3. Procedura barwienia tioflawiną S w celu wykrycia blaszek neurytycznych

1. Procedura uśmiercania myszy i wyjęcia mózgu przebiega zgodnie z opisem w sekcjach od 1.1 do 1.5.
2. Przenieś 4 do 5 przekrojów połowy mózgu na szkiełko przedmiotowe i pozostaw do całkowitego wyschnięcia przed barwieniem.
3. Przemyj szkiełka 70% etanolem przez 1 minutę.
4. Przemyj szkiełka 80% etanolem przez 1 minutę.
5. Inkubuj szkiełka w przefiltrowanym (filtr 0,2 μm) roztworze tioflawiny S (1% w 80% etanolu) przez 15 minut. (Roztwór tioflawiny S musi być filtrowany przed każdym użyciem). Uwaga: chroń tioflawinę S przed światłem oraz chroń zabarwione szkiełka przed światłem.
6. Przemyj szkiełka 80% etanolem przez 1 minutę.
7. Przemyj szkiełka 70% etanolem przez 1 minutę.
8. Przemyj dwukrotnie wodą destylowaną.
9. Zamontuj szkiełka w wodnym medium montażowym i pozostaw do wyschnięcia w ciemności przez co najmniej 2 godziny, a następnie zabezpiecz szkiełko nakrywką za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci. Zabarwione przekroje należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C.
10. Blaszki wybarwione na zielono fluorescencyjnie można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przeanalizuj szkiełka w ciągu jednego tygodnia, ponieważ intensywność barwienia z czasem słabnie.

4. Reprezentatywne wyniki

W naszym niedawnym badaniu nad skutecznością kwasu walproinowego (VPA), leku przeciwdrgawkowego i stabilizatora nastroju, w hamowaniu tworzenia blaszki neuronicznej, zastosowaliśmy opisane powyżej procedury barwienia immunocytochemicznego oraz barwienia tioflawiną S w celu identyfikacji blaszek neuronicznych u myszy w modelu AD (3). Rysunek 1 przedstawia typową 9-miesięczną mysz transgeniczną APP23, zabarwioną przeciwciałem anty-Aβ przy użyciu biotynilowanego 4G8 i wykrytą metodą ABC. Blaszki neuroniczne są wyraźnie oznakowane przeciwciałem i wskazane białymi strzałkami. Wykorzystując barwienie tioflawiną S, wykryliśmy odkładanie się blaszek neuronicznych u 2-miesięcznych myszy transgenicznych APP23xPS (Rysunek 2). Blaszki neuroniczne zawierające Aβ, z którymi związała się tioflawina S, wykazują zieloną fluorescencję w badaniu mikroskopowym (wskazane białymi strzałkami). Wykazaliśmy, że po zastosowaniu leczenia VPA tworzenie blaszek neuronicznych jest znacząco ograniczone (3). W innym badaniu analizowaliśmy powiązania molekularne leżące u podstaw hipoksji i patogenezy AD. Ponownie, stosując zarówno immunohistochemiczne barwienie 4G8 anty-Aβ, jak i barwienie tioflawiną S, stwierdziliśmy, że hipoksja ułatwia tworzenie blaszek neuronicznych zawierających Aβ (4).

Rysunek 1. Analiza immunohistochemiczna tworzenia się blaszek neurytowych u transgenicznych myszy z AD. Myszy APP23 w wieku 9 miesięcy zostały uśmiercone, a następnie poddane sekcji, utrwaleniu i cięciu na skrawki. Blaszki neurytczne w hipokampie wykryto przy użyciu przeciwciała anty-Aβ 4G8 i wybarwiono metodą ABC i DAB. Blaszki zobrazowano za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 40X. Białe strzałki wskazują neurytczne blaszki Aβ.

Rycina 2. Barwienie tioflawiną S blaszek neurytycznych u myszy z modelem AD. Myszy podwójnie transgeniczne APP23xPS45 w wieku 8 tygodni uśpiono, a następnie poddano dyssekcji, utrwaleniu i sekcjonowaniu. Obecność blaszek neurytycznych w obszarze hipokampa potwierdzono za pomocą fluorescencyjnego barwienia tioflawiną S i zobrazowano za pomocą mikroskopii przy powiększeniu 40X. Białe strzałki wskazują blaszki neurytyczne zabarwione tioflawiną S.

Dyskusja

Immunohistochemia z wykorzystaniem biotynjlowanego przeciwciała 4G8 pozwala na swoiste barwienie blaszek neurytonalnych w modelach mysich z chorobą Alzheimera (AD). Wynik barwienia umożliwia ilościowe określenie i porównanie obciążenia blaszkami pomiędzy różnymi grupami badawczymi. Istnieje kilka kluczowych etapów, które mogą wpłynąć na końcowy efekt. Ponieważ półkule mózgu nie są perfundowane przed wyjęciem z czaszki, należy zachować szczególną ostrożność podczas procesu ekstrakcji, aby zapobiec uszkodzeniom tkanki. Ponadto, ze względu na pasywną perfuzję półkul mózgu, zaleca się ich inkubację w 4% PFA przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4°C przed zanurzeniem w 30% roztworze sacharozy. Alternatywnie można przeprowadzić perfuzję przezsercową przed wyjęciem mózgu. Prawidłowo utrwalony mózg powinien mieć gumowatą konsystencję. W przypadku niewłaściwego utrwalenia preparaty będą łatwo rwać się w roztworze D'Olomos lub podczas procedur barwienia.

Przeciwciało monoklonalne 4G8 wykazuje reaktywność wobec reszt aminokwasowych 17-24 Aβ i rozpoznaje epitop w sekwencji rdzeniowej (VFFAE). Ponieważ 4G8 pochodzi od myszy, wykazuje tendencję do generowania silniejszego barwienia tła. W związku z tym zdecydowaliśmy się inkubować przekroje w wskazanym rozcieńczeniu, aby uzyskać rzeczywisty sygnał przy jednoczesnym zminimalizowaniu barwienia tła.

Oprócz immunobarwienia w celu wykrycia blaszek neur upływowych z użyciem przeciwciała 4G8, do identyfikacji blaszek stosuje się również metodę barwienia tioflawiną S. Tioflawina S jest jednorodną mieszaniną barwników powstającą w wyniku metylowania dehydrotiotoluidyny kwasem sulfonowym. Tioflawina S nieselektywnie wiąże struktury beta-kartki białek, takie jak te występujące w oligomerach amyloidowych. Po związaniu tioflawina ulega charakterystycznemu przesunięciu emisji widma w stronę niebieską. Z kolei wiązanie tioflawiny S z formami monomerycznymi nie powoduje przesunięcia w stronę niebieską, przez co nie można go wykryć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Barwienie tioflawiną S stanowi szybką alternatywę do przesiewowego wykrywania amyloidu, ponieważ intensywność fluorescencji pozwala na dobrą wizualizację niewielkich ilości złogów amyloidowych. Wadą barwienia tioflawiną S jest jednak brak specyficzności. Wiele innych składników tkanki zawierających rozległe struktury beta-kartki, takich jak fibrinoidy, hialina, keratyna itp., wykazuje dość duże powinowactwo do tego barwnika.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
Poliwinylo-pirolidon	Sigma-Aldrich	PVP40-100G
Sacharoza	Fisher Scientific	S5-3
Glikol etylenowy	Sigma-Aldrich	324558-2L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
88% kwas mrówkowy	Fisher Scientific	A118P-500
Triton X-100	ICN Biomedicals	807426
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009
Przeciwciało 4G8 znakowane biotyną	Cedarlane Labs	SIG-39240-500
Zestaw Elite ABC	Vector Laboratories	PK-6100
Imm PACT DAB	Vector Laboratories	SK-4105
Ksylen	Fisher Scientific	X4-4
Entellan	Electron Microscopy Sciences	65037-71
Przeźroczniki do mikroskopu Superfrost* Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Kriostat	Leica Microsystems	CM-3050-S
Ostrze mikrotomu MX35 Premier	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3052835
Tioflawina S	Sigma-Aldrich	T1892-25G