Szczegółowo opisano transplantację mysich komórek macierzystych neuronów (NSCs) do rdzenia kręgowego myszy z utrwaloną demielinizacją. Przedstawiono przygotowanie NSCs, laminektomię dziewiątego kręgu piersiowego (T9) oraz transplantację NSCs, wraz z opieką przed- i pooperacyjną nad myszami.
Artykuł metodologiczny
Chirurgiczna transplantacja neuralnych komórek macierzystych myszy do rdzeni kręgowych myszy zainfekowanych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Myszy zakażone neurotropowym szczepem JHM wirusa zapalenia wątroby myszy (MHV) wykazują zmiany patologiczne i wyniki kliniczne podobne do tych u pacjentów z demielinizującą chorobą, jaką jest stwardnienie rozsiane (SM). Wykazaliśmy, że transplantacja NSC do rdzeni kręgowych chorych myszy prowadzi do znaczącej poprawy zarówno w zakresie remielinizacji, jak i wyników klinicznych. Terapie zastępcze komórkami w leczeniu przewlekłych chorób neurologicznych są obecnie rzeczywistością, a modele in vivo są kluczowe dla zrozumienia interakcji między przeszczepionymi komórkami a mikrośrodowiskiem tkanki gospodarza. Niniejsza prezentacja przedstawia dostosowaną metodę transplantacji komórek do rdzenia kręgowego myszy zakażonych JHMV. W skrócie przedstawiamy procedurę obejmującą: i) przygotowanie NSC przed transplantacją, ii) opiekę przedoperacyjną nad myszami, iii) odsłonięcie rdzenia kręgowego poprzez laminektomię, iv) stereotaktyczne wstrzyknięcie NSC oraz iv) opiekę pooperacyjną.
Protokół
1. Przygotowanie
- Przygotuj roztwór ksylazyny i ketaminy (ketamina jest substancją kontrolowaną. Należy prowadzić szczegółową dokumentację, a roztwory przechowywać w bezpiecznym, zamkniętym miejscu).
- Oczyść i wysterylizuj sprzęt.
- Przygotuj obszar operacyjny, przecierając go środkiem aseptycznym, a następnie przykrywając sterylnymi ręcznikami papierowymi, i skonfiguruj mikromanipulator.
2. Przygotowanie komórek do przeszczepu
- Komórki należy resuspender do stężenia 10 0 cells/µl i, mimo że na każdą mysz transplantuje się jedynie 250 00 komórek, wymagana jest nadwyżka komórek na potrzeby napełniania strzykawki (należy przygotować co najmniej 30 0 komórek na każdą mysz otrzymującą komórki).
- Komórki przeznaczone do transplantacji należy przemyć 3 razy w HBSS w 50 ml probówce stożkowej. Należy policzyć komórki przed ostatnim wirowaniem.
- Po ostatnim wirowaniu należy odlać HBSS i pozostawić probówkę w pozycji odwróconej, aby zapobiec przedostaniu się kropel do pelletu.
- Wewnętrzne ścianki należy osuszyć sterylną chusteczką Kimwipe poddaną działaniu promieni UV. Nie wolno dopuścić do wysuszenia pelletu.
- Trzymając probówkę pionowo, należy powoli i bardzo delikatnie resuspender komórki w połowie końcowej pożądanej objętości HBSS.
- Całkowitą objętość należy zmierzyć, pobierając większość zawiesiny do końcówki pipety, a następnie regulując pokrętło pipety, aż cała zawiesina znajdzie się w końcówce. Pozwoli to określić, ile dodatkowego HBSS jest potrzebne do uzyskania pożądanej koncentracji.
- Objętość należy uzupełnić do pożądanej ilości, dodając HBSS.
- Próbkę należy ponownie umieścić na lodzie. Jeśli komórki muszą pozostawać na lodzie dłużej niż 2 h, należy sprawdzić ich żywotność.
3. Przygotowanie myszy do operacji i transplantacji
- Zanurzyć mysz w narkozie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie ketaminy (10mg/kg) i ksylazyny (10mg/kg) w dawkach ok. 10 μl lub równoważnego środka anestetycznego. Cała procedura, od przygotowania chirurgicznego do szycia, potrwa od 30 do 40 minut.
- (Opcjonalnie: nakleić ponumerowaną, kolorową taśmę na ogon każdej myszy w celu zapewnienia identyfikacji)
- Ogolić grzbiet myszy od dolnej części pleców do karku, obejmując obszar o szerokości 2 cm po obu stronach linii środkowej, za pomocą trymera elektrycznego. Włosy należy ściąć jak najkrócej (może być konieczne kilkukrotne przejście po tym samym obszarze).
- Aby usunąć pozostałe włosy, nałożyć cienką warstwę kremu do depilacji (Nair) za pomocą aplikatora z gazy.
- Po 1-2 minutach usunąć preparat Nair gazą lekko zwilżoną wodą z mydłem. Przygotowany obszar powinien stanowić czystą, gołą skórę, pozbawioną pojedynczych włosków, które mogłyby dostać się do rany podczas następnego etapu procedury chirurgicznej.
Zdezynfekować przygotowany obszar roztworem jodku.
4. Laminektomia
- W trakcie procedury należy często zmieniać i/lub sterylizować rękawiczki. Umieść mysz na grzbiecie z głową skierowaną w lewo (jeśli jesteś praworęczny). Przykryj zwierzę sterylnym materiałem tak, aby odsłonięty był tylko ogolony obszar. Wykonaj nacięcie pionowe (˜1,3 cm) nad miejscem laminektomii, rozciągając je od około ósmego do dwunastego kręgu piersiowego (T8–T12).
- Trzymając pęsetę Graefe w lewej ręce, mocno uchwyć kręgosłup na poziomie T9 (Rycina 1A) i unieś mysz, aby zwiększyć krzywiznę kręgosłupa.
- Używając skalpela, nacinaj połączenie między kręgami T10 a T1, w przestrzeni między dwoma wyrostkami kolczystymi. Dalszo odsłoń to połączenie, ostrożnie usuwając warstwę mięśniową, aby odsłonić kość (patrz Rycina 1B,C).
- Używając nożyczek, usuwaj dalej mięśnie z okolic łuków kręgowych i nasad wyrostków za pomocą małych nacięć. Pozwoli to na stworzenie niewielkiej przestrzeni między kręgami. Powoli i delikatnie wprowadź jedno ostrze nożyczek w tę szczelinę i przetnij nasadę. Upewnij się, że zakrzywienie nożyczek jest zawsze skierowane bocznie, z dala od rdzenia. Powtórz czynność po drugiej stronie (patrz Rycina 1D,E).
- Unieś łuk kręgowy, aby odsłonić rdzeń, a następnie ostrożnie go odetnij. Upewnij się, że nie pozostały żadne luźne lub poszarpane fragmenty kostne (patrz Rycina 1F).
- Przed wstrzyknięciem usuń krew za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych.
5. Iniekcja komórek
- Przymocuj igłę wraz z nakrętką do strzykawki Hamiltona i oczyść je, przepłukując kilka razy wodą, następnie 70% etanolem, a na koniec HBSS. Po każdym napełnieniu wodą, 70% etanolem lub HBSS wsuń tłok.
- Przygotuj strzykawkę Hamiltona do załadunku komórek, wyjmując tłok, luzując nakrętkę i odsuwając igłę od strzykawki, aby zapobiec przeciwciśnieniu. Upewnij się, że manipulacje przy igle i nakrętce są wykonywane w sterylnych rękawiczkach.
- Naciągnij 15μl zawiesiny komórek do końcówki pipety i mocno dociśnij końcówkę do tylnej części strzykawki, aby wprowadzić komórki do jej wnętrza.
- Wsuń tłok na około 5mm, a następnie dokręć nakrętkę igły.
- Wciśnij tłok, aż część zawiesiny komórkowej zacznie wypływać przez igłę.
- Upewnij się, że w strzkawce nie ma pęcherzyków powietrza i połóż ją w pozycji poziomej, aby zapobiec sedymentacji komórek pod wpływem grawitacji.
- Uchwyć mysz po laminektomii za mięsień grzbietowy (spinalis dorsi) w obrębie wyrostków kolczystych kręgów T8 i T9 (Rysunek 2B, C).
- Przymocuj kleszczyk hemostatyczny do lewego (pionowego) ramienia mikromanipulatora w taki sposób, aby przednie łapy myszy znajdowały się w powietrzu, a tylne lekko dotykały platformy z jałowych ręczników papierowych, jak pokazano na Rysunkach 2A i 2B.
- Przymocuj strzykawkę do prawego ramienia mikromanipulatora (pod kątem 70°) i przesuń ją do najniższej możliwej pozycji przed zaciśnięciem zacisku.
- Ustabilizuj mysz, przypinając jej ogon do ręczników papierowych, i powoli opuszczaj strzykawkę (Rysunek 2B).
- Opuść igłę w kierunku rdzenia i wprowadź ją na 1mm do przeciwległej półkuli przez linię środkową grzbietową (Rysunek 2C). Koniec igły powinien znajdować się w istocie szarej w pobliżu kanału centralnego.
- Powoli wstrzyknij 2,5μl komórek. Wstrzykiwanie wykonuj z prędkością 1μl / 5 sekund. Po wstrzyknięciu komórek odczekaj 10 sekund, a następnie wycofuj igłę o jedną dziesiątą obrotu co 10 sekund, aż zostanie całkowicie wyjęta z rdzenia. Zwróć uwagę na ewentualny wypływ zawiesiny komórkowej.
- Szybko wycofaj strzykawkę i odłącz ją od ramienia mikromanipulatora. Połóż strzykawkę poziomo.
- Zwolnij uchwyt myszy i przenieś ją na stół do szycia.
- Powtarzaj kroki 5.7–5.14 dla każdej myszy, aż strzykawka zostanie opróżniona. Sterylizuj narzędzia (w sterylizatorze) oraz igłę (przecierając etanolem) pomiędzy zwierzętami. W razie zauważenia agregacji komórek, wylej zawartość i napełnij strzykawkę ponownie.
- Czyść strzykawkę zgodnie z instrukcją w kroku 5.1 pomiędzy kolejnymi załadunkami.
6. Szwy i opieka pooperacyjna
- Zaszyj nacięcie. Igłę chirurgiczną wprowadź w powięź powierzchowną po obu stronach nacięcia. Przewlecz nić, zbliżając do siebie powięź powierzchowną (Ryc. 3A), aby przykryć odsłonięty rdzeń kręgowy w miejscu usuniętej blaszki łukowej. Nie zaszywaj mięśni skórnych przytwierdzonych do skóry ani mięśni szkieletowych grzbietu. Przeciągnij całą nić, pozostawiając około 1/2". Za pomocą uchwytu do igieł zawiąż trzy węzły i odetnij nić jak najbliżej węzła.
- Zamknij nacięcie, zakładając dwa do trzech zszywek (w zależności od wielkości nacięcia) na skórze (Ryc. 3B). Ostrożnie odciągnij skórę od myszy, aby uniknąć zszycia leżącego poniżej mięśnia.
- Za pomocą igły 26G3/8 wstrzyknij 0,5ml Lactated Ringers podskórnie w dolnej części grzbietu, w miejscu oddalonym od nacięcia.
- Umieść mysz z powrotem w klatce. Aby zapewnić zwierzęciu swobodne oddychanie podczas działania anestezji, mysz należy położyć w klatce na boku, unikając kontaktu miejsca operowanego z podścieliskiem. Klatki powinny być umieszczone na matach grzewczych.
- Monitoruj myszy po ustąpieniu działania anestezji, aby upewnić się, że krwawienie ustało, szwy pozostają nienaruszone, a zwierzęta odzyskały sprawność ruchową sprzed operacji.
- Po zabiegu podaj myszom jednorazowo lek przeciwbólowy buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg).
- Zapewnij myszom z ograniczoną sprawnością odpowiedni dostęp do pokarmu i wody: butelki z wodą należy wyposażyć w wydłużone dysze o długości 3,5 cala, a myszom, które nie mogą chodzić, należy podawać wodę i/lub wysokokaloryczny suplement diety (Nutri-Cal, Tomlyn) ręcznie.
7. Reprezentatywne wyniki:
Pożądane wyniki będą możliwe do zidentyfikowania po braku wycieku zawiesiny komórkowej podczas wstrzykiwania oraz po zachowaniu nienaruszonego wyglądu rdzenia kręgowego po zakończeniu procedury. W tym celu niezbędne jest zapewnienie jasnego i bezpośredniego oświetlenia kręgosłupa myszy podczas laminektomii oraz w trakcie wstrzykiwania. Optymalne oświetlenie jest możliwe dzięki zastosowaniu oświetlenia światłowodowego (Rysunek 2A).
Rysunek 1- Laminektomia. (A) Po stabilnym uchwyceniu kręgu T9 kleszczykami Graefe (B, C) naciąć kręgosłup skalpelem pomiędzy T10 a T1, aby ułatwić wprowadzenie mikronozyczek. (D) Ostrożnie przesunąć mikronozyczki przez przestrzeń między T10 a T1 (strzałki i wstawka, E) i przeciąć nasady łuków po obu stronach (kreski, E), aby uwolnić blaszkę łuku kręgu. (F) Odgiąć blaszkę w kierunku rostralnym i odciąć ją.
Rysunek 2. Iniekcja NSC. (A) Ogólny układ mikromanipulatora z kleszczykami hemostatycznymi utrzymującymi mysz przymocowanymi do lewego ramienia oraz strzykawką Hamiltona na prawym ramieniu pod kątem 70°. (B) Kleszczyki hemostatyczne utrzymują mięsień plecy (*musculus spinalis dorsi*) łączący kolce wyrostków T8 i T9. (C) Igła jest wprowadzana w dół przez linię środkową do istoty szarej przeciwległej półkuli, proksymalnie względem kanału centralnego.
Rycina 3. Szwy i zamknięcie rany. (A) Szwy zostają założone na powięź powierzchowną po obu stronach nacięcia. (B) Nacięcie zostaje zamknięte za pomocą 2–3 zszywek w zależności od potrzeb (na ranie wymagającej 3 zszywek pokazano jedną).
Dyskusja
Prawidłowo wykonany przeszczep zależy przede wszystkim od starannego przeprowadzenia laminektomii oraz iniekcji komórek. Głównym błędem, którego należy uniknąć podczas laminektomii, jest uszkodzenie rdzenia kręgowego. Może ono nastąpić w trakcie samego zabiegu lub w wyniku obrażeń spowodowanych przez ostre fragmenty kości pozostawione po jego zakończeniu. Aby tego uniknąć, należy upewnić się, że ostrza zakrzywionych mikronozyczek są zawsze skierowane w stronę przeciwną do rdzenia, a następnie dokładnie zbadać laminektomizowany kręgosłup, aby upewnić się, że wszystkie fragmenty kostne zostały usunięte i że w pozostałej strukturze kręgów nie ma wyraźnie wystających lub poszarpanych krawędzi.
Jak wspomniano wcześniej, wykrycie wycieku będzie możliwe, jeśli światło będzie świecić mocno i bezpośrednio na odsłonięty rdzeń kręgowy podczas wstrzykiwania. Wyciek najczęściej występuje przy użyciu igieł o rozmiarze 30 G (w porównaniu do 33 G) oraz w przypadku zbyt szybkiego wstrzykiwania. Chociaż niniejszy protokół przyniósł nam dobre rezultaty, inni autorzy zgłaszali dłuższe okresy oczekiwania (do 5 minut) przed wycofaniem igły po wstrzyknięciu 8,9. Ponadto preferowane są igły o mniejszym rozmiarze, jednak zaobserwowaliśmy, że niektóre komórki ulegają zbyt łatwej lizie podczas przechodzenia przez igły o rozmiarze 33 G.
Aby zmaksymalizować wydajność, zaleca się powołanie zespołu transplantacyjnego obsługującego cztery różne stanowiska (przygotowanie myszy, laminektomia, iniekcja i szwy). Ponadto czas trwania każdej procedury powinien zostać zoptymalizowany tak, aby zminimalizować czas oczekiwania komórek w lodzie. Na przykład transplantujemy myszy w grupach po cztery (liczba dawek w jednym napełnieniu strzykawki); osoba wykonująca iniekcje komórek rozpoczyna napełnianie strzykawki po wykonaniu laminektomii u trzeciej myszy, a osoba przygotowująca zwierzęta powinna podać znieczulenie kolejnej grupie po laminektomii drugiej myszy z poprzedniej grupy. W ten sposób możemy przeprowadzić transplantację komórek (lub medium kontrolnego) u 40 myszy w około 3 h, mimo że każda mysz wymaga około 30-40 min.
Terapie zastępcze komórek w leczeniu niektórych schorzeń OUN znajdują się obecnie w fazie badań klinicznych 10. Nie ma zamiennika dla modeli in vivo transplantacji NSC, a nasz protokół wszczepiania NSC do rdzeni kręgowych myszy z wirusowo indukowaną demielinizacją ułatwia wykorzystanie istotnego modelu SM i może być również łatwo dostosowany do innych modeli.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ketaject | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-542-02 | |
| Ksylazyny chlorowodorek | MP Biomedicals | 158307 | |
| Nair | Kościół & Dwight Co. | ||
| 10 μStrzykawka Hamilton z wymienną igłą | Hamilton Co | 7635-01 | |
| igły Hamilton, 30G lub 33G, ½ cal, 30° ścięcie | Hamilton Co | 7803-077803-05 | Przetestuj żywotność komórek po przepuszczeniu ich przez igły, aby zidentyfikować optymalny rozmiar igły do zastosowania |
| Mikronożyczki | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | |
| Małe kleszczyki Graefego | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Stereotaktyczny | Kopf Instruments | Uniwersalny uchwyt model 1772 | |
| Stereotaktyczny | Kopf Instruments | Uchwyt do elektrod Model 1773 | |
| Stereotaktyczny | Kopf Instruments | Steryotaksometr dla małych zwierząt model 902 | |
| Stereotaktyczny | Kopf Instruments | Uchwyt lewej elektrody modelu 960 | |
| Szwy | Ethicon Inc. | 95057-064 | |
| roztwór Ringera z mleczanem | Hospira Inc. | NDC 0409-7953-03 | |
| Zszywki | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13010-12 | |
| Skalpele, rozmiary 10, 11 | Fisher Scientific | 268878, 268879 | |
| Szycie chirurgiczne | Ethicon Inc. | 1676G | rozmiar 5-0, 3/8" okrąg, igła 19 mm, pleciona nić 45 cm |
| Aplikator do klipsów ranowych Reflex 7 | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| Klipsy do ran Reflex 7 mm | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| potrzymywacz igieł Olsen-Hegar | Fine Science Tools | 12502-12 |
Bibliografia
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Weiner, H. L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease. Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).
- Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).
- Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).
- Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).
- Blakemore, W. F., Crang, A. J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , Oxford UP. Oxford. (1992).
- Liu, S. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).
- Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).
- Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).
Przedruki i uprawnienia
