Częściowo izolowana kora („podcięcie”) stanowi wydajny model zwierzęcy potraumatycznej epileptogenezy. W niniejszym materiale demonstrujemy sposób wykonania nowego urządzenia chirurgicznego oraz jego zastosowanie w celu tworzenia bardziej precyzyjnych i spójnych uszkodzeń niezbędnych do wygenerowania tego modelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie modelu podcięcia w badaniu epileptogenezy potraumatycznej u gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Częściowa izolacja kory („undercut”) jest modelem zwierzęcym potraumatycznej epileptogenezy. Procedura chirurgiczna polega na przecięciu kory czuciowo-ruchowej oraz znajdującej się pod nią istoty białej (undercut), tak aby określony obszar kory mózgowej został w znacznym stopniu odizolowany od sąsiednich obszarów kory i regionów podkorowych1-3. Po okresie utajenia trwającym dwa lub więcej tygodni od operacji, w skrawkach mózgu gryzoni można zarejestrować wyładowania epileptформne1, natomiast u innych gatunków, takich jak koty i małpy, można obserwować napady elektryczne lub behawioralne in vivo4-6. Ten dobrze ugruntowany model zwierzęcy jest wydajny w tworzeniu i naśladuje kilka istotnych cech urazowego uszkodzenia mózgu. Jednakże wykonanie precyzyjnych uszkodzeń kory w małym mózgu gryzoni metodą „z wolnej ręki” jest technicznie trudne. Opierając się na procedurze opracowanej pierwotnie w laboratorium dr. Davida Prince'a na Uniwersytecie Stanforda1, przedstawiamy tutaj udoskonaloną technikę przeprowadzania operacji w celu przygotowania tego modelu u myszy i szczurów. Demonstrujemy, jak wykonać proste urządzenie chirurgiczne i wykorzystać je do uzyskania lepszej kontroli nad głębokością i kątem cięcia, aby uzyskać bardziej precyzyjne i powtarzalne wyniki. Urządzenie jest łatwe do wykonania, a procedura jest szybka do opanowania. Stworzenie tego modelu zwierzęcego zapewnia wydajny system do badania mechanizmów potraumatycznej epileptogenezy.
Protokół
1. Wykonanie prostego urządzenia do operacji podcięcia
- Stworzone przez nas urządzenie do podcinania składa się z trzech części (Ryc. 1): (1) płytki wspierającej wykonanej ze stali nierdzewnej lub tworzywa sztucznego, która umożliwia przymocowanie rurki prowadzącej oraz igły i spoczywa na oknie czaszkowym podczas operacji; (2) rurki prowadzącej, która utrzymuje igłę w pozycji i umożliwia jej obrót; oraz (3) igły, która jest zgięta pod kątem 90 stopni w odległości ok. 3 mm od czubka i może być przemieszczana poprzez obrót oraz wsuwanie.
- Wytnij kawałek prostokątnej stali nierdzewnej lub przezroczystego tworzywa sztucznego (1) o grubości 1-1,5 mm i wymiarach 7~10 x 30 mm, aby przygotować płytkę wspierającą. Przygotuj igły do strzykawek o długości 1,5 cala i średnicy 22-gauge (firma BD, #305156) oraz 1,5 cala i średnicy 25-gauge (firma BD, #305127). Aby wykonać rurkę prowadzącą, odetnij plastikowy koniec oraz dolną końcówkę igły 2-gauge tak, aby jej całkowita długość wynosiła około 31-32 mm (2). Oszlifuj metalny koniec, aby był płaski i gładki. Końcowa długość tej rurki prowadzącej powinna być o około 5-6 mm krótsza niż igła 25-gauge.
- Użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować rurkę prowadzącą do płytki wspierającej, upewniając się, że igła jest prostopadła do krawędzi metalu.
- Wsuń igłę 25-gauge do rurki prowadzącej i zgnij igłę pod kątem 90 stopni w odległości 2,5-3 mm od czubka (Ryc. 1).
- Dostosuj pionowy zakres ruchu igły, przyklejając małą plastikową rurkę do górnego końca igły (Ryc. 1, ogranicznik igły). Końcowy zakres ruchu igły określa, jak głęboko igła może zostać wprowadzona do kory i powinien wynosić 1,6-1,8 mm dla szczurów P21 oraz 1,3-1,5 mm dla myszy P21. Długość ta musi zostać dostosowana do różnych gatunków i wieku zwierząt.
- Przymocuj mały miedziany drut lub mały kawałek taśmy do górnego końca igły w tym samym kierunku, w którym skierowany jest zgięty czubek (Ryc. 1, wskaźnik igły). Drut lub taśma wskazują kąt obrotu igły podczas operacji podcinania (Ryc. 1).
2. Przygotowanie zwierząt
- Wszystkie instrumenty chirurgiczne muszą zostać poddane autoklawowaniu, sterylizacji w sterylizatorze szklanym lub dezynfekcji 70% etanolem.
- Stosujemy szczury Sprague/Dawley w 20–2 dniu po urodzeniu (P20-2) lub myszy CD1 w tym samym wieku. W zależności od konkretnego projektu mogą być wykorzystywane inne szczepy myszy lub szczurów.
- Zanieś mysz pod narkozę poprzez dożylne wstrzyknięcie (i.p.) ketaminy w dawce 80 mg/kg i ksylazyny w dawce 8 mg/kg. Procedurę chirurgiczną rozpoczyna się po stwierdzeniu braku reakcji zwierzęcia na uszczypnięcie w ogon. W trakcie operacji, w razie potrzeby, można podać dawkę przypominającą stanowiącą jedną trzecią pierwotnej dawki koktajlu anestetycznego, aby przywrócić pierwotny stan znieczulenia.
- Wytnij włosy na skórze głowy zwierzęcia za pomocą elektrycznego trymera. Na oczy zwierzęcia nałóż niewielką ilość maści okulistycznej, aby zapobiec ich wysychaniu podczas anestezji. Zdezynfekuj skórę głowy, stosując 10% roztwór powidonu z jodem, a następnie 70% etanol.
- Zamocuj zwierzę w aparacie stereotaksycznym, aby utrzymać głowę w stabilnej, stałej pozycji. Przez cały czas trwania operacji zwierzę powinno znajdować się na podgrzewanej macie w celu zapobiegania hipotermii.
- Za pomocą skalpela wykonaj w linii środkowej nacięcie przednio-tylne na skórze głowy, rozciągając je od lambda do obszaru między oczami. Użyj kleszczyków hemostatycznych, aby odsunąć skórę i dostatecznie odsłonić lewą stronę czaszki.
- Wykonaj prostokątne nacięcie na lewej stronie czaszki, a następnie za pomocą skalpela zeskrob okostnę. Krok ten ograniczy krwawienie i ułatwi wiercenie w czaszce.
3. Wykonywanie podcięć
- Nanieś niewielką ilość jałowej soli fizjologicznej na odsłonięty obszar czaszki, a następnie użyj kilku patyczków higienicznych, aby oczyścić krew i osuszyć ten obszar.
- Pod mikroskopem chirurgicznym zacznij wiercić prostokątny rowek (~5 x 7 mm u szczurów, 4 x 5 mm u myszy) w centrum lewej strony czaszki (mniej więcej nad lewą korą sensoromotoryczną). Aplikacja kropli soli fizjologicznej na czaszkę ułatwia wiercenie i odprowadza ciepło. Po wywierceniu około 2/3 głębokości kości usuń nadmiar soli fizjologicznej i oczyść obszar wiercenia patyczkiem higienicznym. Powoli i ostrożnie wierć głębiej, aż środkowy fragment kości stanie się ruchomy przy delikatnym dotknięciu pęsetą.
- Ostrożnie usuń środkowy fragment kości, wsuwając ostrą końcówkę pęsety na krawędź kości i powoli unosząc pęsetę, aby odsłonić lewą półkulę.
- Pod mikroskopem chirurgicznym chwyć urządzenie do nacinania (undercut device), skieruj igłę w kierunku parasagitalnym, a płytkę wspierającą prostopadle do linii środkowej, lekko przechylając urządzenie w stronę kaudalną, aby zachować widoczność końcówki igły i docelowego obszaru kory. Skieruj końcówkę igły w obszar 1-2 mm bocznie od górnego szwu strzałkowego, w połowie okna czaszkowego, unikając bezpośredniego przebicia dużych naczyń.
- Wprowadź igłę w kierunku poziomym przez oponę twardą i pod oponę miękką, tak aby oszczędzić naczynia krwionośne. Oprzyj podstawę urządzenia do nacinania o obie krawędzie okna czaszkowego, tak aby igła była ustawiona prostopadle do powierzchni kory (Rys. 1). Oparcie urządzenia ręcznie o obie krawędzie okna czaszkowego znacznie zredukuje lub wyeliminuje drżenie rąk podczas kolejnego etapu procedury. Unieś igłę pod oponę miękką, a następnie powoli opuszczaj ją, aby wykonać cięcie transkortykalne, aż igła nie będzie mogła wejść głębiej. Obróć o ~135° w kierunku przeciwnym do linii środkowej, aby stworzyć półkoliste podcięcie istoty białej/głębokiej warstwy VI. Następnie ponownie unieś igłę pod oponę miękką. Przechyl urządzenie do tyłu i wycofaj igłę.
- Opcjonalnie można powtórzyć powyższą procedurę (krok 2.5), ale bez obracania igły, aby wykonać dodatkowe cięcie transkortykalne przy bocznych krawędziach okna. Pozwoli to na uzyskanie bardziej pełnej izolacji kory.
- Umieść kawałek folii plastikowej (6 x 6 mm) na oknie czaszkowym w celu ochrony, a następnie zaszyj skórę głowy. Umieść zwierzę na podgrzewanej podkładce aż do całkowitego wybudzenia z anestezji.
4. Reprezentatywne wyniki:
W celu potwierdzenia powodzenia operacji podcięcia można przygotować koronalne skrawki kory. W skrawkach przygotowanych >2 tygodnie po operacji, nacięcia transkortykalne i podcięcia są widoczne pod obiektywem mikroskopu o niskim powiększeniu (Rys. 2). Częściowo izolowana kora zazwyczaj staje się nieco cieńsza, a w większości skrawków korowych za pomocą rejestracji potencjałów polowych można wykryć aktywność epileptформową (Rys. 3).
Z kolei powstanie dużych ubytków w istocie białej lub w głębokich warstwach kory, znaczne ścieńczenie uszkodzonej kory lub błędne cięcie powyżej lub poniżej istoty białej sprawi, że mózg nie będzie nadawał się do dalszych eksperymentów.
Rysunek 1. Budowa i zastosowanie urządzenia do wykonywania podcięć. Rurkę prowadzącą (2) przykleja się do płytki podporowej (1), wykonanej ze stali nierdzewnej lub przezroczystego tworzywa sztucznego. Igłę strzykawki (3) wprowadza się przez rurkę prowadzącą i zgina w odległości ok. 3 mm od końcówki. Na górnym końcu igły przykleja się ogranicznik wykonany z rurki plastikowej w taki sposób, aby zakres ruchu pionowego igły był ograniczony do ok. 1,2 mm w przypadku myszy P21 i do ok. 1,5 mm w przypadku szczurów. Pod uchwytem mocuje się odcinek cienkiego miedzianego drutu, który służy jako wskaźnik orientacji zgiętej igły. Należy pamiętać, aby urządzenie było nachylone i stykało się z obiema krawędziami okna czaszkowego, tak aby cięcie można było wykonać równolegle do powierzchni pialnej.
Rysunek 2. Reprezentatywny obraz przekroju z podcięciem. A. Obraz fluorescencyjny skrawka przygotowanego dwa tygodnie po wykonaniu podcięcia (undercut lesion) u szczura P48. Rana cięta została oznakowana fluorescencyjnym barwnikiem DiI. Białe strzałki po prawej stronie wskazują cięcie transkortykalne, a strzałki na dole wskazują podcięcie przebiegające przez granicę między warstwą IV a istotą białą.
Rysunek 3. Rejestracja potencjałów polowych z podciętego skrawka. Rejestracja potencjałów polowych z wyciętego fragmentu plastra mózgu wykazała aktywność epileptiformną, co sugeruje nadpobudliwość uszkodzonej tkanki korowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Model podcięcia (undercut) jest wysoce wydajnym systemem do badania potraumatycznej epileptogenezy. Typowy zabieg trwa zaledwie około 20–30 minut, a wywołaną lub spontaniczną aktywność epileptyformną można rejestrować w skrawkach mózgu u większości zwierząt dwa tygodnie po operacji1-2. Co ważniejsze, model ten odwzorowuje aspekty zmian następujących po urazowym uszkodzeniu mózgu, takich jak krwawienie, stan zapalny, obrzęk, aksotomia i śmierć neuronów7. Aktywność epileptyformna została zaobserwowana...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantu NIH/NINDS 4R00 NS 057940 oraz grantu SCBI 200-12 z funduszu badań nad urazami rdzenia kręgowego i mózgu (Spinal Cord and Brain Injury Research fund) Departamentu Zdrowia Stanu Indiana.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Zestaw mikrosilnika Foredom | sprzęt | Foredom | K.1070 | |
| Igła do strzykawki 1,5 cala, rozmiar 22G | materiał | BD Biosciences | 305156 | |
| Igła do strzykawki 1,5 cala, rozmiar 25G | materiał | BD Biosciences | 305127 | |
| Klej cyjanoakrylowy | materiał | Ted Pella, Inc. | 14450 |
Bibliografia
- Hoffman, S. N., Salin, P. A., Prince, D. A. Chronic neocortical epileptogenesis in vitro. J Neurophysiol. 71, 1762-1773 (1994).
- Topolnik, L., Steriade, M., Timofeev, I. Hyperexcitability of intact neurons underlies acute development of trauma-related electrographic seizures in cats in vivo. Eur J Neurosci. 18, 486-496 (2003).
- Graber, K., Prince, D. A. Models of Seizures and Epilepsy. , Elsevier. 477-493 (2005).
- Nita, D. A., Cisse, Y., Timofeev, I., Steriade, M. Increased propensity to seizures after chronic cortical deafferentation in vivo. J Neurophysiol. 95, 902-913 (2006).
- Sharpless, S. K., Halpern, L. M. The electrical excitability of chronically isolated cortex studied by means of permanently implanted electrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 244-255 (1962).
- Echlin, F. A., Battista, A. Epileptiform Seizures from Chronic Isolated Cortex. Arch Neurol. 9, 154-170 (1963).
- Prince, D. A. Epileptogenic neurons and circuits. Adv Neurol. 79, 665-684 (1999).
- Marin-Padilla, M. Developmental neuropathology and impact of perinatal brain damage. II: white matter lesions of the neocortex. J Neuropathol Exp Neurol. 56, 219-235 (1997).
- Jin, X., Prince, D. A., Huguenard, J. R. Enhanced excitatory synaptic connectivity in layer v pyramidal neurons of chronically injured epileptogenic neocortex in rats. J Neurosci. 26, 4891-4900 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. J Neurophysiol. 88, 2-12 (2002).
- Salin, P., Tseng, G. F., Hoffman, S., Parada, I., Prince, D. A. Axonal sprouting in layer V pyramidal neurons of chronically injured cerebral cortex. J Neurosci. 15, 8234-8245 (1995).
- Avramescu, S., Nita, D. A., Timofeev, I. Neocortical post-traumatic epileptogenesis is associated with loss of GABAergic neurons. J Neurotrauma. 26, 799-812 (2009).
- Avramescu, S., Timofeev, I. Synaptic strength modulation after cortical trauma: a role in epileptogenesis. J Neurosci. 28, 6760-6772 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
