Analiza cytometryczna komórek odpornościowych w aortach mysich

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania składu immunologicznego aorty. W pracy zaprezentowano również dodatkową technikę, która umożliwia oddzielne badanie otaczającej osłonki zewnętrznej oraz ściany naczynia. Metoda ta otwiera możliwości przeprowadzania analiz fenotypowych leukocytów aortalnych oraz zastosowania wielu testów immunologicznych w badaniach nad miażdżycą.

Streszczenie

Miażdżyca jest przewlekłym procesem zapalnym naczyń średnich i dużych, charakteryzującym się tworzeniem blaszek złożonych z komórek piankowatych, komórek odpornościowych, komórek śródbłonka naczyniowego i komórek mięśni gładkich, płytek krwi, macierzy zewnątrzkomórkowej oraz rdzenia bogatego w lipidy z rozległą nekrozą i włóknieniem tkanek otaczających.¹ W inicjacji, rozwoju i utrzymywaniu się miażdżycy uczestniczą zarówno przyrodzone, jak i nabyte mechanizmy odpowiedzi odpornościowej.^{2, 3} Istnieje wiele dowodów na to, że różne podgrupy komórek odpornościowych, takie jak makrofagi, komórki dendrytyczne oraz limfocyty T i B, występują w aortach zdrowych myszy oraz myszy podatnych na miażdżycę⁴. Dodatkowo komórki odpornościowe znajdują się w otaczającej osłonce zewnętrznej aorty, co sugeruje istotną rolę tej tkanki w aterogenezie.²

Przez pewien czas ilościowe wykrywanie różnych typów komórek odpornościowych, ich stanu aktywacji oraz składu komórkowego w ścianie aorty w badaniach nad miażdżycą było ograniczone do metod RT-PCR i immunohistochemicznych. Podejmowano niewiele prób przeprowadzenia cytometrii przepływowej z wykorzystaniem ludzkich aort, a zgłaszano szereg problemów, takich jak wysoka autofluorescencja^5,6. Ludzkie blaszki miażdżycowe trawiono kolagenazą 1, a uwolnione komórki zbierano i barwiono na CD14+/CD11c+, aby uwidocznić komórki piankowate pochodzenia makrofagicznego. W tej badaniu wykorzystano kanał „mock”, aby uniknąć fałszywie dodatniego barwienia.⁶ Materiały nekrotyczne gromadzące się podczas procesu trawienia prowadzą do powstania dużej ilości debris, co generuje wysoką autofluorescencję w próbkach aorty. Aby rozwiązać ten problem, zaproponowano panel kontroli negatywnych i pozytywnych, jednak w tych próbkach można było zastosować jedynie podwójne barwienie. Opracowaliśmy nową metodę opartą na cytometrii przepływowej⁷ do analizy składu komórek odpornościowych oraz charakterystyki ich aktywacji, proliferacji i różnicowania w aorcie zdrowej oraz predysponowanej do miażdżycy. Metoda ta umożliwia badanie składu komórek odpornościowych ściany aorty i otwiera możliwości wykorzystania szerokiego spektrum metod immunologicznych do badań nad aspektami immunologicznymi tej choroby.

Protokół

1. Izolacja aorty mysiej

Praca z myszami wymaga zatwierdzenia procedury przez instytucjonalną komisję IACUC.

1. Przygotować PBS z heparyną, dodając 1000 jednostek heparyny sodowej do 50 ml PBS i odwracając probówkę w celu wymieszania. Przygotować pustą probówkę do pobrania krwi oraz probówkę z PBS dla każdej aorty do pobrania. Wszystkie probówki przechowywać w lodzie.
2. Zheparynować strzykawkę do pobierania krwi (0,1ml heparyny sodowej w stężeniu 1000 U/ml), przygotować narzędzia chirurgiczne (dwie pary pęset zakrzywionych, parę nożyczek sekcyjnych oraz parę mikronożyczek) oraz stół sekcyjny do przeprowadzenia preparatyki.
3. Uśmiercić mysz za pomocą dwutlenku węgla w zatwierdzonej komorze, zgodnie z wytycznymi NIH oraz instytucjonalnego komitetu IACUC dotyczącymi eutanazji gryzoni. Przed przeniesieniem myszy na stół sekcyjny sprawdzić skuteczność zabiegu.
4. Krótko zwilżyć mysz 70% etanolem i przymocować ją do stołu sekcyjnego. Pobrać krew z myszy poprzez punkcję serca.
5. Otworzyć jamę brzuszną i klatkę piersiową. Używając strzykawki 10 ml z igłą 25 g, całkowicie przepłukać naczynia krwionośne PBS zawierającym 2% heparyny, aby całkowicie usunąć krew z naczyń poprzez punkcję serca. Upewnić się, że w tkankach aorty nie pozostała krew. Perfuzję należy przeprowadzać powoli i pod niskim ciśnieniem, aby upewnić się, że wszystkie blaszki miażdżycowe w ścianie naczynia pozostaną nienaruszone.
6. Wypreparować i usunąć narządy trzewne, narządy moczowo-płciowe, przeponę i śledzionę, pozostawiając nienaruszone nerki, serce i aortę.
7. Ostrożnie oddzielić tkankę tłuszczową i węzły chłonne okołoaortyczne od aorty, pozostawiając aortę i osłonkę zewnętrzną nienaruszone. Pobrać całą aortę, w tym łuk aorty oraz odcinki wstępujący, zstępujący, piersiowy i brzuszny. Umieścić wyizolowaną aortę w probówce z PBS. Podczas procedury izolacji dążyć do utrzymania naczynia w stanie wilgotnym.

2. Przygotowanie jednokomórkowych zawiesin

1. Przygotować 1X roztwór zapasowy enzymów do dysocjacji aorty (ADES) (125 U/ml kolagenazy typu XI, 60 U/ml hialuronidazy typu 1-s, 60 U/ml DNazy I oraz 450 U/ml kolagenazy typu I w 2,5 ml PBS, zmodyfikowany według Galkina et al.⁷). Wszystkie enzymy pochodzą z firmy Sigma-Aldrich. Umieścić roztwór zapasowy enzymów na lodzie.
2. Usunąć PBS z probówki zbiorczej zawierającej aortę. Do każdej aorty dodać 2,5 ml 1X ADES. Pociąć aortę na małe fragmenty w celu ułatwienia trawienia enzymatycznego lub pozostawić aortę w całości. Inkubować aortę w 1X roztworze enzymów przez 1 godzinę w temperaturze 37°C (opcjonalnie przy wolnym wytrząsaniu).
3. Po 1-godzinnej inkubacji przygotować zawiesiny pojedynczych komórek z strawionej aorty poprzez rozdrobnienie tkanek i przepuszczenie ich przez sitko komórkowe 70 μm do 5 ml polipropylenowych probówek FACS (BD Falcon). Wirować komórki w celu ich osadzenia (400xg, 5 minut, 4°C).
4. Resuspendować komórki w 1 ml buforu FACS (PBS uzupełniony o 1% BSA i 0,05% NaN₃) i określić liczbę komórek w zawiesinie komórek aorty, używając błękitu trypanu, hemocytometru oraz mikroskopu świetlnego. Całkowita liczba komórek uzyskanych po trawieniu będzie zależeć od wieku i diety myszy lub stopnia zaawansowania miażdżycy.

3. Barwienie metodą cytometrii przepływowej

1. Oznakuj odpowiednią liczbę nowych probówek do FACS. Zasadniczo eksperymenty z cytometrii przepływowej powinny obejmować probówkę kontrolną niebarwioną, zestaw probówek z pojedynczymi barwnikami, odpowiednie kontrole FMO (fluorescence-minus-one)⁸, odpowiednie kontrole izotypowe oraz zestaw probówek badawczych. Ze względu na ograniczoną liczbę leukocytów aorty, które można wyizolować, do przeprowadzenia pojedynczego barwienia kontrolnego można wykorzystać leukocyty śledziony.
2. Do barwienia zawiesin komórek aorty stosujemy standardowy protokół cytometrii przepływowej. W skrócie: przenieś aalikwot 0,5-1x10⁶ komórek z zawiesiny komórek aorty do probówki (lub probówek) FACS. Dodaj 1 ml buforu FACS i zwirowuj komórki w celu ich osadzenia. Usuń nadsącz z osadu komórkowego poprzez odlanie.
3. Przygotuj roztwór blokujący Fc oraz koktajle przeciwciał dla probówek badawczych, probówek FMO i probówek izotypowych. Do wszystkich probówek dodaj 100 μl blokera Fc w buforze FACS (14,2 μg/ml, klon 2.4G2) i wymieszaj poprzez delikatne potrząsanie palcami lub krótko w wirówce vortex, aby resuspenderować komórki. Inkubuj próbki przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Przygotuj koktajle do barwienia przeciwciałami, barwienia izotypowego lub barwienia kontrolnego FMO. Optymalne stężenie przeciwciał określ w wstępnych eksperymentach z miareczkowaniem. W obecności blokera Fc dodaj koktajle przeciwciał (100 μl/0,5-1,0x10⁶ komórek) do probówek z próbkami. Inkubuj przez 20-30 min w temperaturze 4°C w ciemności.
5. Dodaj 1 ml buforu FACS do każdej probówki, wymieszaj w wirówce vortex i zwirowuj komórki w celu ich osadzenia. Powtórz tę procedurę jeszcze raz.
6. Odlej nadsącz i resuspenderuj osad komórkowy w 300 μl 2% PFA. Przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym.
   • Uwaga: Zazwyczaj do wszystkich próbek dodawane jest przeciwciało anty-CD45 (marker wspólnego antygenu leukocytarnego), aby móc później wyznaczyć bramkę dla leukocytów CD45⁺.⁷ Dodatkowo należy początkowo zastosować kontrole FMO i izotypowe dla CD45, aby ustawić bramkę dla leukocytów CD45⁺, ponieważ ekspresja CD45 może się różnić pomiędzy leukocytami.
   • Uwaga: W celu wykrycia antygenów powierzchniowych o niskiej gęstości ekspresji lub antygenów występujących w rzadkich zdarzeniach, należy użyć „jasnych fluorochromów”, takich jak fykoerytryna (PE) lub allofikocyjanina (APC). Ponadto rzadkie zdarzenia można wykryć poprzez łączenie kilku dopasowanych aort; jednak w przypadku użycia ponad miliona komórek, ilość przeciwciał stosowana w teście powinna zostać zwiększona proporcjonalnie.
   • Uwaga: Aby upewnić się, że w wyizolowanych aortach, a w konsekwencji w zawiesinie komórek aorty, występuje minimalne zanieczyszczenie krwią, w niektórych eksperymentach przeprowadzono dodatkowe barwienie na TER-119,⁷ antygen eksprymowany przez erytrocyty (RBC). Stosunek erytrocytów do leukocytów (WBC) we krwi wynosi w przybliżeniu od 10x10⁶ komórek/μl do 8x10³ komórek/μl. Na podstawie ekspresji TER-119 w próbkach aorty można obliczyć procent leukocytów pochodzenia krwi w próbce. Zazwyczaj w próbkach aorty mamy mniej niż 0,02% leukocytów pochodzenia krwi. (Rys. 1)
   • Uwaga: Ponieważ obróbka enzymatyczna może wpływać na ekspresję antygenów powierzchniowych, należy określić odporność na trawienie enzymatyczne dla badanych antygenów. W skrócie: obwodowe węzły chłonne (pLN) lub małe fragmenty śledziony inkubuje się z koktajlem enzymatycznym lub bez niego przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po 1 godzinie ekspresję antygenów określa się za pomocą cytometrii przepływowej. Koktajl enzymatyczny nie ma wpływu na wiele antygenów powierzchniowych (Rys. 2)⁷. W niektórych innych przypadkach obróbka enzymatyczna prowadziła do znacznej utraty ekspresji antygenu. Problem ten można obejść, stosując alternatywne markery komórkowe.
   • Uwaga: Barwienie żywotności komórek (żywe/martwe) można przeprowadzić po kroku 4, jeśli jest to pożądane. Zazwyczaj stosuje się zestaw Live/Dead Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen, Molecular Probes). Aby zabarwić komórki barwnikiem Live/Dead, należy przygotować 1x roztwór Live/Dead, dodając 1 μl rozpuszczonego barwnika live/dead do 1 ml PBS i wymieszać w wirówce vortex. Dodaj 100-200 μl 1x barwnika Live/Dead do próbek pojedynczych, koktajlowych, FMO oraz kontroli izotypowych. Inkubuj próbki z barwnikiem w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności. Pojedynczą probówkę kontrolną dla Live/Dead należy inkubować w temperaturze 56°C w ciemności przez 10 minut, aby zabić komórki poprzez szok termiczny. Przemyj komórki 1 ml PBS i zwirowuj je w celu osadzenia. Wróć do protokołu w kroku 5.
   • Uwaga: Barwienie wewnątrzkomórkowe dla antygenów wewnątrzkomórkowych i cytokin jest kompatybilne z tym protokołem. W skrócie: barwienie wewnątrzkomórkowe można przeprowadzić przy użyciu odczynników do fiksacji/permeabilizacji komórek z laboratoriów BD Pharmingen, eBioscience lub Caltag – w zależności od badanych antygenów. Aby utrwalić i permeabilizować komórki do barwienia wewnątrzkomórkowego, przeprowadź etap fiksacji/permeabilizacji zgodnie z instrukcjami producenta po etapie barwienia zewnątrzkomórkowego (sekcja 3, krok 5). Po etapie przemywania wewnątrzkomórkowego wróć do naszego protokołu w kroku 6 (sekcja 3, krok 6).

4. Analiza cytometryczna przepływowa wyizolowanej otoczki zewnętrznej i ściany naczynia

Ponieważ leukocyty mogą migrować zarówno do zewnętrznej błony tętnicy aorty (adwentycji), jak i do blaszek miażdżycowych w obrębie ściany aorty, w celu zbadania leukocytów adwentycjalnych i aortalnych za pomocą cytometrii przepływowej opracowano protokół izolacji i analizy cytometrycznej tych dwóch obszarów anatomicznych.⁹ W skrócie, przed trawieniem całej aorty za pomocą ADES (Sekcja 2, krok 2), adwentycja aorty jest częściowo trawiona i oddzielana od pozostałej części naczynia. Po usunięciu i odstawieniu adwentycji, pozostała część aorty jest trawiona ADES w celu uwolnienia leukocytów ze ściany naczynia.

• Protokół izolacji tuniki zewnętrznej aorty

1. Po przygotowaniu 1X ADES (sekcja 2 krok 1), przygotuj 2,5 ml/aorta 1X roztworu enzymów do trawienia zewnętrznej błony tętnicy aorty (AADES) (781,25 U kolagenazy II i 14,0625 U elastazy w 2,5 ml PBS (Worthington biochemical Corp., Lakewood, NJ)).⁹ Przechowuj roztwór zapasowy w lodzie do momentu użycia.
2. Usuń PBS z probówki zbiorczej zawierającej aortę. Dodaj 2,5 ml 1X AADES do każdej aorty. Nie tnij aort na małe kawałki. Inkubuj aorty w 1X roztworze enzymów do zewnętrznej błony przez 10-20 minut w temperaturze 37°C.
3. Po 10-20 minutach trawienia przenieś częściowo strawioną aortę z 1X AADES do szalki Petriego ze świeżym PBS. Bardzo ostrożnie, używając dwóch par zakrzywionych pęset, oddziel warstwę zewnętrzną od aorty jako jedną całość.
   • Uwaga: Dłuższy czas trawienia ułatwia usuwanie zewnętrznej błony; jednak w przypadku nadmiernego strawienia błona ta ulegnie rozerwaniu.
4. Po całkowitym usunięciu zewnętrznej błony przenieś ją oraz aortę do oddzielnych probówek do FACS. Do probówki z zewnętrzną błoną dodaj 1 ml PBS i umieść ją w lodzie. Do probówki z aortą dodaj 2,5 ml 1X roztworu enzymów do dysocjacji aorty i inkubuj aortę przez 40 minut w temperaturze 37°C.
   • Uwaga: Aby ułatwić trawienie enzymatyczne, na tym etapie aortę można podzielić na mniejsze kawałki.
5. Po 40 minutach trawienia umieść probówkę z aortą w lodzie i przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek z aorty i zewnętrznej błony poprzez rozdrobnienie aorty i zewnętrznej błony oraz przepuszczenie ich przez sito komórkowe 70 μm do polipropylenowych probówek do FACS 5 ml (BD Falcon). Skoncentruj komórki poprzez wirowanie (400xg, 5 minut, 4°C). Wróć do sekcji 2 krok 4 i kontynuuj protokół.

5. Reprezentatywne wyniki

W niniejszej sekcji przedstawiamy szereg rycin obrazujących barwienie metodą cytometrii przepływowej w celu analizy składu immunologicznego całych aort, ściany naczyń aorty oraz otaczającej ją powłoką zewnętrzną (adventitia) aorty. Najpierw prezentujemy reprezentatywny wykres FACS wykazujący barwienie TER-119 w pełnej krwi oraz wyizolowanej zawiesinie komórek aorty (Ryc. 1). Erytrocy wykazujące pozytywną reakcję na TER-119 stanowiły 18% komórek w zawiesinie komórek aorty, co wskazuje, że jedynie 0,014% komórek wyizolowanych z zawiesin komórkowych aorty pochodzi z krwi. Jest to istotny eksperyment kontrolny, który jednoznacznie dowodzi, że źródłem większości leukocytów analizowanych w zawiesinie komórek aorty są trawione naczynia, a nie krążąca krew obwodowa. Dodatkowo, w celu walidacji metody, oceniliśmy wpływ koktajlu enzymatycznego do dysocjacji aorty na antygeny powierzchniowe splenocytów (Ryc. 2). Koktajl enzymatyczny nie wpływa na ekspresję wielu antygenów, w tym CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ oraz kilku innych antygenów powierzchniowych⁷.

Barwienie CD45 w połączeniu z barwnikiem żywotności Live/Dead oraz odpowiednimi kontrolami izotypowymi jest wykorzystywane do wykrywania i sub-gatingu głównych populacji zainteresowania oraz do wykluczenia debris komórkowych podczas analizy. Na Rys. 3 wyselekcjonowano żywe leukocyty CD45⁺ z aorty, aby określić procent limfocytów T IFN_Υ+ w połączonych aortach dwóch młodych myszy Apoe^-/-. Aby podkreślić wszechstronność tej metody, stosując schemat gatingu przedstawiony na Rys. 3, prezentujemy na Rys. 4 reprezentatywne barwienie wewnątrzkomórkowe dla makrofagów CD68+CD11b+ oraz komórek IFNγ+TCRαβ+ z dwóch myszy Apoe^-/- karmionych dietą zachodnią przez 12 tygodni. Zgodnie z oczekiwaniami, w aortach myszy Apoe^-/- karmionych dietą zachodnią większość leukocytów w aorcie stanowią makrofagi (40% CD68+CD11b+) lub inne komórki mieloidalne (CD11b+CD68^low i CD11b+CD68-). Dodatkowo, komórki Th1 stanowią znaczną część naciekających aortę limfocytów T TCRαβ (Rys. 4). Ponieważ całkowity procent leukocytów aortalnych oraz ich podzbiorów różni się w zależności od wieku myszy i stopnia zaawansowania miażdżycy, optymalna strategia gatingu dla głównych populacji zainteresowania powinna zostać określona empirycznie.

Aby wykazać możliwość izolacji tuniki zewnętrznej aorty do barwienia metodą cytometrii przepływowej, przedstawiamy reprezentatywne barwienie leukocytów CD45⁺ dla zawiesin komórek aorty i tuniki zewnętrznej (Rys. 5). W skrócie, trzy aorty starszych myszy Apoe^-/- poddano trawieniu i połączono zgodnie z powyższym opisem (Sekcje 2 i 4). Infiltrujące leukocyty CD45⁺ wykryto zarówno w tunice zewnętrznej (18% zawiesiny komórkowej), jak i w pozostałej części aorty (11% zawiesiny komórkowej).

Rycina 1.Barwienie TER-119 w zawiesinie komórek aorty po trawieniu. Aortę perfumowano poprzez nakłucie serca roztworem PBS zawierającym 2% heparyny. Następnie aortę trawiono koktajlem enzymatycznym przez 1 hr w 37°C. Zawiesinę komórek aorty oraz próbkę krwi (jako kontrolę pozytywną) barwiono przeciwciałami anty-TER-119-PE i analizowano metodą cytometrii przepływowej. Erytrocyty dodatnie pod kątem TER-119 stanowią 18% wszystkich komórek w zawiesinie komórek aorty, co wskazuje, że prawdopodobnie tylko 0,014% wszystkich leukocytów izolowanych z aort stanowią leukocyty pochodzenia krwi.

Rysunek 2.Obróbka koktajlem enzymatycznym nie wpływa na ekspresję CD45 (góra) lub CD19 (dół) na limfocytach. Uzyskano zawiesiny komórkowe z niepoddanych obróbce (A, B) oraz poddanych obróbce koktajlem enzymatycznym (C, D) węzłów chłonnych, a następnie barwiono je przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD45 sprzężonymi z APC-Cy7 oraz anty-CD19 sprzężonymi z APC. (A, C) Liczby reprezentują procent leukocytów CD45+ w bramce R1. (B, D) Liczby reprezentują procent limfocytów CD45⁺/CD19⁺ . Profile zostały wybrane na podstawie leukocytów CD45⁺.

Rysunek 3. Strategia bramkowania dla analizy leukocytów aorty. Wyizolowano i połączono dwie aorty od myszy z predyspozycją do miażdżycy Apoe^-/-, a następnie przygotowano zawiesiny komórek aorty zgodnie z powyższym opisem. Zawiesiny komórek barwiono przeciwciałami przeciwko CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNγ (eFluor 450) oraz barwnikiem Live/Dead Aqua, a następnie analizowano za pomocą Cytek DXP 8 Color zmodernizowanego BD FACS Calibur. W skrócie: wyznaczono bramkę dla leukocytów CD45⁺ (B), które następnie poddano dalszej analizie (C-F). Komórki martwe wykluczono z analizy na podstawie barwienia Live/Dead Aqua (D) oraz wykresów FSC (E). Następnie w żywych leukocytach aorty badano ekspresję TCRαβ i IFNγ (F).

Rycina 4. Barwienie wewnątrzkomórkowe antygenów i cytokin wewnątrzkomórkowych. Zawiesiny komórkowe przygotowano z całej aorty i śledziony myszy Apoe^-/- zgodnie z opisem. Zawiesiny komórek aorty (A) i śledziony (B, C) barwiono pod kątem CD45, CD11b i CD68 lub kontroli izotypowej przy użyciu zestawu BD Cytofix/Cytoperm™ Kit (BD Biosciences). Wyznaczono bramkę dla leukocytów CD45⁺, a zanieczyszczenia wykluczono na podstawie profili rozproszenia światła przedniego (FSC) i bocznego (SSC). W celu barwienia wewnątrzkomórkowego IFNγ zawiesiny komórek aorty i śledziony hodowano przez pięć godzin w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o Golgi stop, PMA i jonomycynę C, zgodnie z wcześniejszym opisem.⁹ Stymulowane zawiesiny pojedynczych komórek aorty (D) i śledziony (E, F) barwiono następnie przeciwciałami CD45(PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7), barwnikiem Live Dead Aqua oraz IFNγ (eFluor 450; E) lub izotypem (IgG1-eF450, F). Limfocyty T (D-F) wyodrębniono z żywych leukocytów CD45+CD3+ (CD45+Live/Dead Aqua-) i analizowano pod kątem ekspresji TCRαβ i IFNγ.

Rysunek 5. Reprezentatywny obraz wyizolowanej błony zewnętrznej aorty i ściany naczyniowej aorty myszy. Reprezentatywny wykres konturowy z cytometrii przepływowej wykazuje obecność limfocytów T CD45⁺ w błonie zewnętrznej i ścianie aorty u starych myszy Apoe^-/-. SSC – rozproszenie boczne. Aby wyeliminować autofluorescencję pochodzącą z zanieczyszczeń i tkanek martwiczych, wykresy ograniczono do FSC>750. Aby uniknąć dodatkowej autofluorescencji pochodzącej z dubletów, bramki ustawiono również na FSC<3500, SSC<3500. Procenty wskazują zawartość komórek CD45⁺ w obrębie bramek.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiamy opartą na cytometrii przepływowej metodę badania składu komórek odpornościowych w aortach myszy. Główną zaletą tej metody jest możliwość analizy komórek odpornościowych aorty na poziomie pojedynczych komórek oraz charakterystyka stanu aktywacji leukocytów aorty. Metoda ta nie ogranicza się tylko do aort mysich; my (dane niepublikowane) oraz inni autorzy¹⁰ wykorzystaliśmy to podejście do analizy próbek ludzkich, takich jak tętnica piersiowa wewnętrzna, zastawki aorty i tętnice w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H3506
DNaza I, typ 2	Sigma-Aldrich	D4527
Kolagenaza I	Sigma-Aldrich	C0130
Kolagenaza II	Worthington Biochemical	LS004174
Elastaza	Worthington Biochemical	LS002292