Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Podsumowanie

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Streszczenie

Błędy w segregacji chromosomów prowadzą do powstania komórek aneuploidalnych. W komórkach somatycznych aneuploidia wiąże się z nowotworami, natomiast w gametach prowadzi do niepłodności, poronień lub wad rozwojowych, takich jak zespół Downa. Haploidalne gamety powstają w wyniku specyficznych dla danego gatunku programów rozwojowych sprzężonych z mejozą. Pierwszy podział meiotyczny (MI) jest unikalny dla mejozy, ponieważ chromatydy siostrzane pozostają połączone, podczas gdy segregowane są chromosomy homologiczne. Z przyczyn nie do końca wyjaśnionych ten podział redukcyjny jest podatny na błędy i częściej stanowi źródło aneuploidii niż błędy w mejozie II (MII) lub błędy w mejozie męskiej ^1,2.

U ssaków oocyty zatrzymują się w profazie MI z dużym, nienaruszonym pęcherzykiem zarodkowym (GV; jądro) i wznawiają mejozę dopiero po otrzymaniu sygnałów owulacyjnych. Po wznowieniu mejozy oocyty kończą MI i przechodzą asymetryczny podział komórkowy, ponownie zatrzymując się w metafazie MII. Komórki jajowe nie ukończą MII do momentu zapłodnienia przez plemniki. Oocyty mogą również przechodzić dojrzewanie meiotyczne przy zastosowaniu uznanych warunków hodowli in vitro ³. Ponieważ generowanie transgenicznych myszy i mutantów z celowanym nokautem genów jest kosztowne i czasochłonne, manipulacja gametami żeńskimi in vitro stanowi bardziej ekonomiczną i oszczędzającą czas strategię.

W niniejszej pracy opisujemy metody izolacji oocytów myszy zatrzymanych w profazie oraz technikę mikroiniekcji. Do oocytu można wprowadzić dowolny wybrany materiał, jednak ze względu na to, że oocyty zdolne do przejścia mejozy są transkrypcyjnie nieaktywne ^4,5, do badań nad ekspresją ektopową należy wstrzyknąć cRNA, a nie DNA. W celu oceny ploidii opisujemy warunki dojrzewania oocytów in vitro do etapu jajeczek MII. Historycznie do określania liczby chromosomów stosowano techniki rozprzestrzeniajania chromosomów ⁶. Metoda ta jest trudna technicznie i pozwala jedynie na identyfikację hiperploidii. Tutaj opisujemy metodę określania hypo- i hiperploidii z wykorzystaniem nienaruszonych jajeczek ^7-8. Metoda ta wykorzystuje monastrol, inhibitor kinezyny-5, który powoduje zapadnięcie się wrzeciona dwubiegunowego w wrzeciono jednobiegunowe ⁹, rozdzielając tym samym chromosomy w taki sposób, że poszczególne kinetochory mogą być łatwo wykrywane i liczone przy użyciu autoimmunologicznego serum anty-CREST. Ponieważ metoda ta jest przeprowadzana na nienaruszonych jajeczkach, chromosomy nie ulegają utracie w wyniku błędów operatora.

Protokół

1. Pobieranie oocytów myszy

1. Aby zmaksymalizować liczbę pęcherzyków antralnych izolowanych z każdej myszy, wstrzyknij dojniałym płciowo samicom myszy (stosujemy 6-tygodniowe myszy CF-1 z Harlan) drogą dosytniewną 5 IU gonadotropiny z surowicy klaczy w ciąży (PMSG).
2. Przygotuj medium do zbioru (MEM/PVP) (3 ml/mysz), dodając milrinon do stężenia 2,5 μM, i podgrzej je do 37°C. Milrinon jest inhibitorem fosfodiesterazy, który utrzymuje zatrzymanie mejozy po usunięciu oocytów z pęcherzyków. Alternatywnie można zastosować 3-izobutyl-1-metylksantynę (IBMX) (0,2 mM) lub dibutyryl-cykliczny adenozynomonofosforan (dbcAMP) (100 μg/ml). Przygotuj medium hodowlane, dodając glutaminę (1 mM) i milrinon (2,5 μM) do 1 ml CZB, a następnie pozostaw je w inkubatorze na co najmniej godzinę w celu równowagi. Przygotuj mikrokrople każdego z mediów w szalce Petriego i przykryj je olejem mineralnym. Szalkę z CZB umieść w inkubatorze, podczas gdy szalka z MEM/PVP powinna pozostać na zewnętrznym podgrzewaczu do szkiełek. Rutynowo stosowane są również inne dostępne komercyjnie media do zbioru i hodowli (M2 i M16 z Specialty media lub Sigma).
3. W przybliżeniu 48 h po stymulacji PMSG, uśmierć mysz poprzez sedację CO₂, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych, wypreparuj jajniki i umieść je na szkiełku zegarkowym zawierającym uprzednio podgrzane MEM/PVP + milrinon (MEM/PVP+M).
4. Za pomocą strzykawki insulinowej 1 ml unieruchom jajniki w szalce i uwolnij pęcherzyki antralne, nakłuwając je kilkakrotnie złączonymi igłami 27G (lub igłami do szycia).
5. Obserwując preparat pod mikroskopem sekcyjnym, zbierz kompleksy kumulus-oocyt za pomocą szklanej pipety sterowanej ustami. Pomocne jest zastosowanie mikroskopu o wysokim kontraście. Alternatywnie medium zawierające tkankę i komórki można nanieść pipetą na pokrywkę plastikowej szalki Petriego. Zbieraj wyłącznie duże pęcherzyki antralne, pomijając mniejsze pęcherzyki przedantralne oraz oocyty pozbawione komórek kumulusu. Po zebraniu przenieś kompleksy do mikrokropli MEM/PVP+M znajdującej się na podgrzewaczu do szkiełek pod warstwą oleju.
6. Za pomocą małej pipety (o średnicy nieco większej od średnicy oocytu) wykonaj kilkakrotne pipetowanie kompleksów w górę i w dół, aby oddzielić komórki kumulusu. Przenieś oocyty pozbawione komórek kumulusu większą pipetą do mikrokropli CZB + milrinon (CZB+M) i umieść je w inkubatorze.
7. Pozostaw oocyty do regeneracji na co najmniej 1 h w inkubatorze przed przystąpieniem do manipulacji.

2. Mikroiniekcja oocytów

1. Wykonaj pipety do iniekcji poprzez wyciąganie kapilar z borokrzemowego szkła w mechanicznym wyciągaczu. Używamy wyciągacza mikropipet Flaming-Brown (model P-97) z następującymi ustawieniami: P=500, Heat=300, Pull=150, Vel=100, Time=150.
2. Przygotuj platformę do mikroiniekcji, umieszczając kroplę 5 μl MEM/PVP+M jak najbliżej kropli 0,5 μl wybranego materiału do iniekcji (np. siRNA, cRNA, oligonukleotyd morfolino itd.) na szkiełku z jedną komorą, z której usunięto komorę z medium. Przykryj olej mineralny i umieść na stoliku mikroskopu (Ryc. 1).
3. Umieść pipety do iniekcji i pipety trzymające w uchwytach i ustaw je w kropli MEM/PVP+M. Otwórz butle z azotem podłączone do pikoinkektora i stołu antywibracyjnego. Otwórz końcówkę pipety do iniekcji, delikatnie uderzając nią o pipetę trzymającą, jednocześnie napełniając ją medium. Jeśli otwór będzie zbyt duży, medium będzie szybko przepływać w obie strony, a igła zabije komórkę. Pipety ze zbyt małym otworem często łatwo się zatykają.
4. Przenieś oocyty (5-10) z inkubatora do kropli MEM/PVP+M na platformie. Przed iniekcją skonfiguruj pikoinkektor. W naszym pikoinkektorze (model PLI-100 firmy Harvard Apparatus) stosujemy następujące parametry: PBal=2,5-3,5 psi, PInj=7,8 psi, PClear= 10-12 psi, time= 3s. Daje to objętość iniekcji wynoszącą 5-10 pL.
5. Naciskając przycisk CLEAR, przesuń igłę do iniekcji do kropli z materiałem i napełnij ją. Przenieś ją z powrotem do kropli z medium.
6. Użyj pipety trzymającej, aby uchwycić oocyt, a następnie wyrównaj igłę do iniekcji, oocyt i pipetę trzymającą wzdłuż osi x.
7. Przy większym powiększeniu wprowadź pipetę do iniekcji przez oocyt, uważając, aby nie uszkodzić jądra komórkowego. Po przebiciu błony plazmatycznej naciśnij INJECT. Po iniekcji wycofaj igłę. Zwolnij oocyt i powtórz procedurę. Po iniekcji wszystkich oocytów przenieś je z powrotem do inkubatora. Przechowuj w CZB+M przez wymagany czas; czas ten zależy od celu eksperymentalnego (np. wyciszenie siRNA i morfolino (do 24 h), nadekspresja (3-12 h)). Należy pamiętać, że inkubacja dłuższa niż 24 h upośledzi dojrzewanie meiotyczne.

3. Dojrzewanie oocytów

1. Po inkubacji przemyj oocyty kilkoma kroplami CZB (medium do dojrzewania), przenieś je do mikrokropli medium do dojrzewania pod warstwą oleju i umieść w inkubatorze.
2. Pozostaw na 16 h do pełnego dojrzewania do metafazy mejozy II.

4. Analiza ploidalności

1. Przygotować CZB + monastrol (100 μM) i nalać 750 μl do dołka naczynia do hodowli organów, w którego zewnętrznym pierścieniu znajduje się woda.
2. Przemyć jaja, przepuszczając je przez kilka kropel CZB + monastrol, a następnie przenieść je do naczynia do hodowli organów. Inkubować w inkubatorze przez 1 h.
3. Utrwalić jaja, przenosząc je do zegarka zawierającego 2% paraformaldehyd w PBS na 20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść do innego zegarka z roztworem blokującym. Naczynie to można przechowywać w temperaturze 4° C do czasu opracowania.
4. Przenieść do roztworu permeabilizującego (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN₃) w zegarku na 15 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać kilkoma dużymi objętościami roztworu blokującego (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN₃).
5. Dalszą część procedury przeprowadzić na pokrywce płytki 96-dołkowej w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Krople (˜25 μl) nanosi się do kolistych wgłębień. Przenieść jaja do roztworu blokującego na 15 minut.
6. W celu znakowania centromerów przenieść jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego antyserum CREST w rozcieńczeniu 1:40. Inkubować przez co najmniej 1 h. Przemyć, przepuszczając przez 3 krople roztworu blokującego, inkubując po 15 minut w każdej z nich.
7. Przenieść jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciała anty-IgG ludzkie sprzężone z Cy5 lub Alexa-fluor-594 (1:200) i inkubować przez 1 h. Powtórzyć etapy płukania jak opisano powyżej, z wyjątkiem ostatniego kroku, w którym należy dodać Sytox Green (1:5 000) do roztworu blokującego w celu wykrycia chromosomów. Zamontować w 5 μl Vectashield. Aby zapobiec zgnieceniu jaj, nanieść 4 małe kropki wazeliny w narożnikach miejsca, w którym znajdzie się szkiełko podstawowe. Nałożyć szkiełko nakrywkę i uszczelnić lakierem do paznokci. Przechowywać w kasecie do szkiełek w temperaturze 4° C do czasu obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.
8. Podczas obrazowania z użyciem obiektywu 100X, rejestrować obrazy w płaszczyźnie Z w krokach 0,4 μm i obrazować cały obszar wrzeciona metafazy. Policzyć centromery, używając oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J (NIH).

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 2 przedstawia projekcję Z z euploidnego oocytu. W metafazie MII euploidne oocyty mysie zawierają 20 par chromosomów, a zatem posiadają 40 centromerów. Sporadycznie, mimo zastosowania monastrolu, chromosomy nie rozprzestrzeniają się całkowicie. Sytuacja ta utrudnia rzetelne policzenie centromerów, dlatego nie uwzględniamy takich oocytów w naszych analizach. Czasami może być trudne określenie, czy immunoreaktywna względem CREST „plamka” reprezentuje 1 czy 2 centromery. Korzystanie z programów takich jak Image J jest pomocne, ponieważ pozwala na analizę każdego przekroju Z przy uważnym odnotowaniu orientacji chromosomów, liczby przekrojów, w których wykryto „plamkę” oraz intensywności pikseli tych „plamek”. W zależności od położenia wrzeciona mejotycznego względem ciałka polarnego, regiony DNA mogą na siebie nachodzić; takie próbki nie powinny być włączane do analizy.

Niemodyfikowane, owulowane in vivo oocyty od młodych myszy w wieku reprodukcyjnym charakteryzują się niskim wskaźnikiem aneuploidii (˜1-2%). Jednakże, z nieznanych przyczyn, procedury mikroiniekcji i dojrzewania in vitro mogą zwiększyć ten wskaźnik do ponad 10%. Dlatego kluczowe jest uwzględnienie w każdym badaniu z użyciem mikroiniekcji grupy kontrolnej oocytów poddanych iniekcji.

Rycina 1. Układ szalki do mikroiniekcji. Preparat na szkiełku z komorą, zawierający krople 5 μl MEM/PVP + M umieszczone bezpośrednio nad kroplami 0,5 μl roztworu do iniekcji. Przykryto olejem mineralnym. W tym przykładzie znajdują się 3 krople dla 3 różnych roztworów do iniekcji, a szkiełko spoczywa na stole mikroskopu. Po lewej stronie znajduje się igła do mikroiniekcji, a po prawej pipeta trzymająca. Zwróć uwagę na odbicie uchwytów igieł.

Rycina 2. Wyniki ploidii. Projekcja Z euploidalnego jaja w metafazie II. DNA jest zabarwione na zielono, a kinetochory na czerwono. Strzałki wskazują na 2 odrębne ramiona chromatyd, co wskazuje, że kinetochory (#17 i #18) nakładają się na siebie. Euploidalne jaja myszy zawierają 20 par kinetochorów (łącznie 40 „punktów”). Jajo aneuploidalne zawierałoby dowolną odstępstwą od tej liczby. Gdyby procedura ta została przeprowadzona na oocytach w metafazie MI, obecnych byłoby 40 par kinetochorów (łącznie 80 „punktów”).

Tabela 1. Przepis na pożywkę do zbierania i mikroiniekcji (MEM/PVP + M). Wszystkie materiały są klasy do hodowli embrionów i pochodzą od firmy Sigma-Aldrich. Sterylizować przez filtry PVDF 0,22μm (używamy Millipore Stericups) i przechowywać w temperaturze 4°C.

Tabela 2. Skład pożywki CZB. Wszystkie materiały są klasy do hodowli embrionów i pochodzą z firmy Sigma-Aldrich. Sterylizować przez filtry PVDF 0,22μm (stosujemy Milipore Stericups) i przechowywać w temperaturze 4°C.

Dyskusja

Mikroiniekcja oocytów jest potężną metodą badania mechanizmów regulujących dojrzewanie meiotyczne ^{10,11, 12, 13}. Metoda ta stanowi ekonomiczny sposób testowania hipotez przed dokonaniem dużych inwestycji w opracowanie transgenicznych i celowanych modeli mysich. Opanowanie technik pobierania oocytów i mikroiniekcji wymaga więcej czasu niż w przypadku typowych procedur biologii komórki. Konkretne trudności przy pobieraniu często obejmują kontrolowanie pipety ustnej, wyciąganie szklanych pipet o odpowiedniej średnicy do pobierania i usuwania komórek somatycznych oraz zwiększanie szybkości pobierania w celu zminimalizowania czasu przebywania oocytów poza inkubatorem. Zalecamy wielokrotne ćwiczenia przed przystąpieniem do eksperymentów. Przenoszenie oocytów między mikrokroplami przy zachowaniu tej samej liczby komórek to doskonały sposób na oswojenie się z tą metodą.

Śmierć komórek często występuje podczas nauki mikroiniekcji. Może to być spowodowane szeregiem przyczyn, w tym wstrzyknięciem zbyt dużej objętości materiału (np. otwór igły do iniekcji jest zbyt duży), uderzeniem igły w jądro komórkowe, przebiciem przeciwległej strony oocytu lub toksycznością wstrzykniętego materiału dla oocytu. Kluczem do opanowania tej techniki jest ćwiczenie iniekcji buforu do oocytów aż do momentu, gdy wskaźnik przeżywalności wyniesie co najmniej 50%. Jeśli oocyty nie dojrzewają, prawdopodobnie milrinon nie został wystarczająco rozcieńczony. Zalecamy płukanie oocytów w wielu dużych kroplach medium CZB bez milrinonu przed rozpoczęciem dojrzewania.

Analiza ploidalności po mikroiniekcji jest jednym z wielu testów służących do oceny dojrzewania meiotycznego. Inne rutynowe analizy stosowane w naszym laboratorium obejmują monitorowanie kinetyki postępu oocytów przez mejozę, immunofluorescencję w celu analizy formowania wrzeciona i ustawienia chromosomów oraz aktywację komórki jajowej lub zapłodnienie in vitro w celu oceny skuteków rozwojowych manipulacji oocytem ^{14,15, 16, 17}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela specyficznych odczynników:
Milrinon	Sigma-Aldrich	M4659	Resuspendować w DMSO w stężeniu 2,5mM
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M5310	Stosować wyłącznie sterylny, filtrowany, sprawdzony na embrionach
Autoserum CREST	Immunovision	HCT-0100
Sytox Green	Invitrogen	57020
Przeciwciało antyludzkie Alexa 594	Invitrogen	A-11014
Vectashield	Vector Laboratories	H-100
Paraformaldehyd	Polysciences, Inc.	577773
Albumina z surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A3294
PMSG	Calbiochem	367222
Monastrol	Sigma-Aldrich	M8515	Resuspendować w DMSO w stężeniu 100mM
Tween-20	Sigma-Aldrich	274348
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tabela specyficznego sprzętu:
Końcówka ustna	Biodiseno	MP-001-Y
Zegarek szklany	Electron Microscopy Sciences	70543-30
Strzykawka	BD Biosciences	309623	1ml, 27G1/2
Szalka Petriego 60 mm	Falcon BD	351007
Szklane pipety Pasteura	Fisher Scientific	13-678-200
Podgrzewacz boczny	Fisher Scientific		Dowolny standardowy model
Mikroskop do dissekcji			Dowolny standardowy model
Kuweta do slajdów	Nalge Nunc international	177372
Kapilary	Drummond Scientific	1-000-0500	microcaps
Wytapiająca do pipet	Flaming-Brown micropipette puller		Model P-97
Mikroskop odwrócony	Nikon Instruments		Dowolny standardowy model
Mikromanipulatory	Eppendorf		Dowolny standardowy model
Pikoinkektor	Harvard Apparatus	Model PLI-100	Dowolny standardowy model
Butle CO2			Do inkubatora
Butla N2			Do stołu i injektora
Stół antywibracyjny	Technical Manufacturing Corp.		Dowolny standardowy model
Inkubator			Dowolny standardowy model
Pipety trzymające	Eppendorf	930001015	Vacutip
Mikroskop konfokalny	Leica Microsystems		Dowolny standardowy model
Narzędzia do dissekcji	Fine Science Tools		Dowolny standardowy model
Komora nawilżana			Używamy pojemników typu tupperware
Wieczko płytki 96-dołkowej	Nalge Nunc international	263339
Przedmioty szkiełka	Fisher Scientific	12-544-3
Szkiełka nakrywki	Thomas Scientific	6663-F10	Grubość zależy od konkretnych mikroskopów
Naczynie do hodowli organów z centralnym dołkiem	Fisher Scientific	353037	60 X 15mm