Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Podsumowanie

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Streszczenie

Błędy w segregacji chromosomów prowadzą do powstania komórek aneuploidalnych. W komórkach somatycznych aneuploidia wiąże się z nowotworami, natomiast w gametach prowadzi do niepłodności, poronień lub wad rozwojowych, takich jak zespół Downa. Haploidalne gamety powstają w wyniku specyficznych dla danego gatunku programów rozwojowych sprzężonych z mejozą. Pierwszy podział meiotyczny (MI) jest unikalny dla mejozy, ponieważ chromatydy siostrzane pozostają połączone, podczas gdy segregowane są chromosomy homologiczne. Z przyczyn nie do końca wyjaśnionych ten podział redukcyjny jest podatny na błędy i częściej stanowi źródło aneuploidii niż błędy w mejozie II (MII) lub błędy w mejozie męskiej ^1,2.

U ssaków oocyty zatrzymują się w profazie MI z dużym, nienaruszonym pęcherzykiem zarodkowym (GV; jądro) i wznawiają mejozę dopiero po otrzymaniu sygnałów owulacyjnych. Po wznowieniu mejozy oocyty kończą MI i przechodzą asymetryczny podział komórkowy, ponownie zatrzymując się w metafazie MII. Komórki jajowe nie ukończą MII do momentu zapłodnienia przez plemniki. Oocyty mogą również przechodzić dojrzewanie meiotyczne przy zastosowaniu uznanych warunków hodowli in vitro ³. Ponieważ generowanie transgenicznych myszy i mutantów z celowanym nokautem genów jest kosztowne i czasochłonne, manipulacja gametami żeńskimi in vitro stanowi bardziej ekonomiczną i oszczędzającą czas strategię.

W niniejszej pracy opisujemy metody izolacji oocytów myszy zatrzymanych w profazie oraz technikę mikroiniekcji. Do oocytu można wprowadzić dowolny wybrany materiał, jednak ze względu na to, że oocyty zdolne do przejścia mejozy są transkrypcyjnie nieaktywne ^4,5, do badań nad ekspresją ektopową należy wstrzyknąć cRNA, a nie DNA. W celu oceny ploidii opisujemy warunki dojrzewania oocytów in vitro do etapu jajeczek MII. Historycznie do określania liczby chromosomów stosowano techniki rozprzestrzeniajania chromosomów ⁶. Metoda ta jest trudna technicznie i pozwala jedynie na identyfikację hiperploidii. Tutaj opisujemy metodę określania hypo- i hiperploidii z wykorzystaniem nienaruszonych jajeczek ^7-8. Metoda ta wykorzystuje monastrol, inhibitor kinezyny-5, który powoduje zapadnięcie się wrzeciona dwubiegunowego w wrzeciono jednobiegunowe ⁹, rozdzielając tym samym chromosomy w taki sposób, że poszczególne kinetochory mogą być łatwo wykrywane i liczone przy użyciu autoimmunologicznego serum anty-CREST. Ponieważ metoda ta jest przeprowadzana na nienaruszonych jajeczkach, chromosomy nie ulegają utracie w wyniku błędów operatora.

Protokół

1. Pobieranie oocytów mysich

1. Aby zmaksymalizować liczbę mieszków antralnych wyizolowanych z każdej myszy, wykonaj dojamieniowy wtrysk 5 IU gonadotropiny z surowicy ciężkiej klaczy (PMSG) u dojrzałych płciowo samic myszy (stosujemy 6-tygodniowe myszy CF-1 od Harlan).
2. Przygotuj medium do zbierania (MEM/PVP) (3 ml/mysz), dodając milrinon do stężenia 2,5 μM i ogrzej je do 37°C. Milrinon jest inhibitorem fosfodiesterazy, który podtrzymuje zatrzymanie mejozy po usunięciu oocytów z mieszków. Alternatywnie można zastosować 3-izobutyl-1-metylksantynę (IBMX) (0,2 mM) lub dibutyrylocykliczny adenozynomonofosforan (dbcAMP) (100 μg/ml). Przygotuj medium hodowlane, dodając glutaminę (1 mM) i milrinon (2,5 μM) do 1 ml CZB i pozostaw do wyrównania w inkubatorze przez co najmniej godzinę. Przygotuj mikrokrople każdego z mediów w szalce Petriego i przykryj je olejem mineralnym. Szalkę z CZB umieszcza się w inkubatorze, natomiast szalkę z MEM/PVP pozostawia na zewnątrz na podgrzewaczu do szkiełek. Rutynowo stosuje się również inne dostępne komercyjnie media do zbierania i hodowli (M2 i M16 od Specialty media lub Sigma).
3. Około 48 h po stymulacji PMSG, utnij mysz za pomocą sedacji CO₂ z następującym zwichnięciem stawów szyjnych, wypreparuj jajniki i umieść je na szkiełku zegarkowym zawierającym uprzednio ogrzane MEM/PVP + milrinon (MEM/PVP+M).
4. Używając strzykawki insulinowej 1 ml, unieruchom jajniki na szalce i uwolnij mieszki antralne, nakłuwając je kilkakrotnie złączonymi igłami o rozmiarze 27 G (lub igłami do szycia).
5. Obserwując preparat pod mikroskopem sekcyjnym, zbierz kompleksy cumulus-oocyt za pomocą szklanej pipety sterowanej ustami. Pomocne jest zastosowanie mikroskopu o dużym kontraście. Alternatywnie medium zawierające tkankę i komórki można nanieść pipetą na pokrywkę plastikowej szalki Petriego. Zbieraj tylko duże mieszki antralne, a nie mniejsze mieszki przedantralne lub oocyty pozbawione komórek cumulus. Po zebraniu przenieś kompleksy do mikrokropli MEM/PVP+M znajdującej się na podgrzewaczu do szkiełek i pod warstwą oleju.
6. Używając małej pipety (o średnicy nieco większej niż średnica oocytu), pipetuj kompleksy w górę i w dół, aby oddzielić komórki cumulus. Przenieś oocyty pozbawione komórek cumulus większą pipetą do mikrokropli CZB + milrinon (CZB+M) i umieść w inkubatorze.
7. Pozostaw oocyty do regeneracji w inkubatorze przez co najmniej 1 h przed przystąpieniem do manipulacji.

2. Mikroiniekcja oocytów

1. Wykonaj pipety do iniekcji poprzez wyciąganie kapilar z borokrzemowego szkła w mechanicznym wyciągarzu. Używamy wyciągarza mikropipet Flaming-Brown (Model P-97) z następującymi ustawieniami: P=500, Heat=300, Pull=150, Vel=100, Time=150.
2. Przygotuj platformę do mikroiniekcji, umieszczając kroplę 5 μl MEM/PVP+M jak najbliżej kropli 0,5 μl wybranego materiału do iniekcji (np. siRNA, cRNA, oligonukleotyd morpholino itp.) na szkiełku z jedną komorą, z której usunięto komorę z medium. Przykryj olej mineralny i umieść na stoliku mikroskopu (Rys. 1).
3. Umieść pipety do iniekcji i pipety trzymające w uchwytach i ustaw je w kropli MEM/PVP+M. Otwórz butle z azotem podłączone do pikoinkektora i stołu antywibracyjnego. Otwórz końcówkę pipety do iniekcji, delikatnie stukając nią o pipetę trzymającą, jednocześnie napełniając ją medium. Jeśli otwór będzie zbyt duży, medium będzie szybko przepływać w obie strony, a igła zniszczy komórkę. Pipety z otworem zbyt małym często łatwo się zatykają.
4. Przenieś oocyty (5-10) z inkubatora do kropli MEM/PVP+M na platformie. Przed rozpoczęciem iniekcji skonfiguruj pikoinkektor. W naszym pikoinkektorze (Model PLI-100 z Harvard Apparatus) stosujemy następujące parametry: PBal=2.5-3.5 psi, PInj=7.8 psi, PClear= 10-12 psi, time= 3s. Pozwala to na uzyskanie objętości iniekcji wynoszącej 5-10 pL.
5. Naciskając przycisk CLEAR, przesuń igłę do iniekcji do kropli z materiałem i napełnij ją. Następnie wróć do kropli z medium.
6. Użyj pipety trzymającej do uchwycenia oocytu i ustaw igłę do iniekcji, oocyt oraz pipetę trzymającą wzdłuż osi x.
7. Przy większym powiększeniu wprowadź pipetę do iniekcji do oocytu, uważając, aby nie uszkodzić jądra komórkowego. Po przebiciu błony plazmatycznej naciśnij INJECT. Po iniekcji wycofaj igłę. Zwolnij oocyt i powtórz procedurę. Po zaszczepieniu wszystkich oocytów przenieś je z powrotem do inkubatora. Przechowuj w CZB+M przez wymagany czas; czas ten zależy od celu eksperymentu (np. wyciszenie za pomocą siRNA i morpholino (do 24 h), nadekspresja (3-12 h)). Należy pamiętać, że inkubacja dłuższa niż 24 h upośledzi dojrzewanie meiotyczne.

3. Dojrzewanie oocytów

1. Po inkubacji przemyj oocyty kilkoma kroplami medium CZB (medium do dojrzewania), przenieś je do mikrokropli medium do dojrzewania pod warstwą oleju i umieść w inkubatorze.
2. Pozostaw na 16 h w celu pełnego dojrzewania do metafazy mejozy II.

4. Analiza ploidalności

1. Przygotować CZB + monastrol (100 μM) i nalać 750 μl do dołka naczynia do hodowli organów, w którym w zewnętrznym pierścieniu znajduje się woda.
2. Przemyć jaja, przekładając je przez kilka kropel CZB + monastrol, a następnie przenieść je do naczynia do hodowli organów. Umieścić w inkubatorze na 1 h.
3. Utrwalić jaja, przenosząc je do szkiełka zegarkowego zawierającego 2% paraformaldehyd w PBS na 20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść do innego szkiełka zegarkowego z roztworem blokującym. Naczynie to można przechowywać w temperaturze 4° C do czasu przetworzenia.
4. Przenieść do roztworu permeabilizującego (PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN₃) w szkiełku zegarkowym na 15 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać kilkukrotnie dużymi objętościami roztworu blokującego (PBS + 0.3% BSA + 0.01 Tween-20 + 0.02% NaN₃).
5. Pozostałą część procedury wykonuje się na pokrywie płytki 96-dołkowej w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem. Krople (˜25 μl) umieszcza się wewnątrz okrągłych wgłębień. Przenieść jaja do roztworu blokującego na 15 minut.
6. Aby oznakować centromery, przenieść jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego antyserum CREST w rozcieńczeniu 1:40. Inkubować przez co najmniej 1 h. Przemyć, przekładając przez 3 krople roztworu blokującego, inkubując po 15 minut w każdej.
7. Przenieść jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciała anty-human IgG sprzężone z Cy5 lub Alexa-fluor-594 (1:200) i inkubować przez 1 h. Powtórzyć etapy przemywania jak wyżej, z wyjątkiem ostatniego kroku, w którym do roztworu blokującego należy dodać Sytox Green (1:5 000) w celu wykrycia chromosomów. Zamontować w 5 μl Vectashield. Aby zapobiec zmiażdżeniu jaj, nanieść 4 małe punkty wazeliny w rogach miejsca, w którym znajdzie się szkiełko nakrywkowe. Nałożyć szkiełko nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci. Przechowywać w kasetce na preparaty w temperaturze 4° C do czasu analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej.
8. Podczas obrazowania z użyciem obiektywu 100X, rejestrować obrazy w krokach 0.4 μm w płaszczyźnie Z i obrazować cały obszar wrzeciona metafazowego. Policzyć centromery przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J (NIH).

5. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 2 przedstawia projekcję Z z diploidalnego oocytu. W metafazie MII diploidalne oocyty myszy zawierają 20 par chromosomów, a zatem posiadają 40 centromerów. Czasami chromosomy nie rozkładają się mimo zastosowania monastrolu. Sytuacja ta utrudnia wiarygodne policzenie centromerów, dlatego nie uwzględniamy takich oocytów w naszych analizach. Okazyjnie może być trudne określenie, czy immunoreaktywna w odniesieniu do CREST „plamka” to 1 czy 2 centromery. Stosowanie programów takich jak Image J jest przydatne, ponieważ pozwala na analizę każdego przekroju Z przy uważnym odnotowywaniu orientacji chromosomów, liczby przekrojów, w których wykryto „plamkę” oraz intensywności pikseli tych „plamek”. W zależności od położenia wrzeciona meiotycznego względem ciałka polarnego, regiony DNA mogą na siebie nachodzić; takich próbek nie należy włączać do analizy.

Niepoddane manipulacjom, owulowane in vivo oocyty od młodych myszy w wieku rozrodczym charakteryzują się niskim wskaźnikiem aneuploidii (˜1-2%). Jednakże, z przyczyn nieznanych, procedury mikroiniekcji i dojrzewania in vitro mogą zwiększyć ten wskaźnik do poziomu powyżej 10%. Dlatego krytyczne jest uwzględnienie oocytów kontrolnych poddanych iniekcji w każdym badaniu z wykorzystaniem mikroiniekcji.

Rycina 1. Przygotowanie szalki do mikroiniekcji. Szkiełko komorowe z kroplami 5 μl MEM/PVP + M znajdującymi się bezpośrednio nad kroplami 0,5 μl roztworu do wstrzykiwania. Przykryto olejem mineralnym. W tym przykładzie znajdują się 3 krople dla 3 różnych roztworów do wstrzykiwania, a szkiełko spoczywa na stoliku mikroskopu. Po lewej stronie znajduje się igła do mikroiniekcji, a po prawej pipeta trzymająca. Należy zwrócić uwagę na odbicie uchwytów igieł.

Rysunek 2. Wyniki ploidii. Projekcja Z euploidnej komórki jajowej w metafazie II. DNA jest zabarwione na zielono, a kinetochory na czerwono. Strzałki wskazują na dwa odrębne ramiona chromatyd, co wskazuje na nakładanie się kinetochorów (#17 i #18). Euploidne komórki jajowe myszy zawierają 20 par kinetochorów (łącznie 40 „punktów”). Komórka aneuploidna zawierałaby dowolną inną liczbę. Gdyby procedura ta została przeprowadzona na oocytach w metafazie MI, obecnych byłoby 40 par kinetochorów (łącznie 80 „punktów”).

Tabela 1. Skład pożywki do zbierania i mikroiniekcji (MEM/PVP + M). Wszystkie materiały są klasy do hodowli embrionalnej i pochodzą od firmy Sigma-Aldrich. Sterylizować przez filtry PVDF 0.22μm (stosujemy Milipore Stericups) i przechowywać w temperaturze 4°C.

Tabela 2. Skład pożywki CZB. Wszystkie materiały są klasy do hodowli embrionalnej i pochodzą z firmy Sigma-Aldrich. Sterylizować przez filtrację przez filtry PVDF 0,22μm (stosujemy Milipore Stericups) i przechowywać w temperaturze 4°C.

Dyskusja

Mikroiniekcja oocytów jest potężną metodą badania mechanizmów regulujących dojrzewanie meiotyczne ^{10,11, 12, 13}. Metoda ta stanowi ekonomiczny sposób testowania hipotez przed dokonaniem dużych inwestycji w opracowanie transgenicznych i celowanych modeli mysich. Opanowanie technik pobierania oocytów i mikroiniekcji wymaga więcej czasu niż w przypadku typowych procedur biologii komórki. Konkretne trudności przy pobieraniu często obejmują kontrolowanie pipety ustnej, wyciąganie szklanych pipet o odpowiedniej średnicy do pobierania i usuwania komórek somatycznych oraz zwiększanie szybkości pobierania w celu zminimalizowania czasu przebywania oocytów poza inkubatorem. Zalecamy wielokrotne ćwiczenia przed przystąpieniem do eksperymentów. Przenoszenie oocytów między mikrokroplami przy zachowaniu tej samej liczby komórek to doskonały sposób na oswojenie się z tą metodą.

Śmierć komórek często występuje podczas nauki mikroiniekcji. Może to być spowodowane szeregiem przyczyn, w tym wstrzyknięciem zbyt dużej objętości materiału (np. otwór igły do iniekcji jest zbyt duży), uderzeniem igły w jądro komórkowe, przebiciem przeciwległej strony oocytu lub toksycznością wstrzykniętego materiału dla oocytu. Kluczem do opanowania tej techniki jest ćwiczenie iniekcji buforu do oocytów aż do momentu, gdy wskaźnik przeżywalności wyniesie co najmniej 50%. Jeśli oocyty nie dojrzewają, prawdopodobnie milrinon nie został wystarczająco rozcieńczony. Zalecamy płukanie oocytów w wielu dużych kroplach medium CZB bez milrinonu przed rozpoczęciem dojrzewania.

Analiza ploidalności po mikroiniekcji jest jednym z wielu testów służących do oceny dojrzewania meiotycznego. Inne rutynowe analizy stosowane w naszym laboratorium obejmują monitorowanie kinetyki postępu oocytów przez mejozę, immunofluorescencję w celu analizy formowania wrzeciona i ustawienia chromosomów oraz aktywację komórki jajowej lub zapłodnienie in vitro w celu oceny skuteków rozwojowych manipulacji oocytem ^{14,15, 16, 17}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela specyficznych odczynników:
Milrinon	Sigma-Aldrich	M4659	Resuspendować w DMSO w stężeniu 2,5mM
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M5310	Stosować wyłącznie sterylny, filtrowany, sprawdzony na embrionach
Autoserum CREST	Immunovision	HCT-0100
Sytox Green	Invitrogen	57020
Przeciwciało antyludzkie Alexa 594	Invitrogen	A-11014
Vectashield	Vector Laboratories	H-100
Paraformaldehyd	Polysciences, Inc.	577773
Albumina z surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A3294
PMSG	Calbiochem	367222
Monastrol	Sigma-Aldrich	M8515	Resuspendować w DMSO w stężeniu 100mM
Tween-20	Sigma-Aldrich	274348
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tabela specyficznego sprzętu:
Końcówka ustna	Biodiseno	MP-001-Y
Zegarek szklany	Electron Microscopy Sciences	70543-30
Strzykawka	BD Biosciences	309623	1ml, 27G1/2
Szalka Petriego 60 mm	Falcon BD	351007
Szklane pipety Pasteura	Fisher Scientific	13-678-200
Podgrzewacz boczny	Fisher Scientific		Dowolny standardowy model
Mikroskop do dissekcji			Dowolny standardowy model
Kuweta do slajdów	Nalge Nunc international	177372
Kapilary	Drummond Scientific	1-000-0500	microcaps
Wytapiająca do pipet	Flaming-Brown micropipette puller		Model P-97
Mikroskop odwrócony	Nikon Instruments		Dowolny standardowy model
Mikromanipulatory	Eppendorf		Dowolny standardowy model
Pikoinkektor	Harvard Apparatus	Model PLI-100	Dowolny standardowy model
Butle CO2			Do inkubatora
Butla N2			Do stołu i injektora
Stół antywibracyjny	Technical Manufacturing Corp.		Dowolny standardowy model
Inkubator			Dowolny standardowy model
Pipety trzymające	Eppendorf	930001015	Vacutip
Mikroskop konfokalny	Leica Microsystems		Dowolny standardowy model
Narzędzia do dissekcji	Fine Science Tools		Dowolny standardowy model
Komora nawilżana			Używamy pojemników typu tupperware
Wieczko płytki 96-dołkowej	Nalge Nunc international	263339
Przedmioty szkiełka	Fisher Scientific	12-544-3
Szkiełka nakrywki	Thomas Scientific	6663-F10	Grubość zależy od konkretnych mikroskopów
Naczynie do hodowli organów z centralnym dołkiem	Fisher Scientific	353037	60 X 15mm